Os metabólitos imunomoduladores são uma característica fundamental do microambiente tumoral (TME), mas, com algumas exceções, suas identidades permanecem em grande parte desconhecidas. Neste estudo, analisamos tumores e células T provenientes de tumores e do líquido ascítico de pacientes com carcinoma seroso de alto grau (CSAG) para revelar o metaboloma desses diferentes compartimentos do TME. O líquido ascítico e as células tumorais apresentam extensas diferenças metabólicas. Comparadas ao líquido ascítico, as células T infiltrantes do tumor são significativamente enriquecidas em 1-metilnicotinamida (MNA). Embora o nível de MNA nas células T esteja elevado, a expressão da nicotinamida N-metiltransferase (uma enzima que catalisa a transferência de grupos metil da S-adenosilmetionina para a nicotinamida) é limitada a fibroblastos e células tumorais. Funcionalmente, a MNA induz as células T a secretarem o fator de necrose tumoral alfa, uma citocina promotora de tumores. Portanto, o MNA derivado do TME contribui para a regulação imunológica das células T e representa um alvo potencial para imunoterapia no tratamento do câncer humano.
Os metabólitos derivados de tumores podem ter um profundo efeito inibitório na imunidade antitumoral e, cada vez mais, evidências mostram que eles também podem servir como uma força motriz fundamental para a progressão da doença (1). Além do efeito Warburg, trabalhos recentes começaram a caracterizar o estado metabólico das células tumorais e sua relação com o estado imunológico do microambiente tumoral (TME). Estudos em modelos de camundongos e células T humanas mostraram que o metabolismo da glutamina (2), o metabolismo oxidativo (3) e o metabolismo da glicose (4) podem atuar independentemente em vários subgrupos de células imunes. Diversos metabólitos nessas vias inibem a função antitumoral das células T. Foi comprovado que o bloqueio da coenzima tetraidrobiopterina (BH4) pode prejudicar a proliferação de células T e que o aumento de BH4 no organismo pode potencializar a resposta imune antitumoral mediada por CD4 e CD8. Além disso, o efeito imunossupressor da quinurenina pode ser revertido pela administração de BH4 (5). Em glioblastomas com mutação na isocitrato desidrogenase (IDH), a secreção do enantiômero metabólico (R)-2-hidroxiglutarato (R-2-HG) inibe a ativação, proliferação e atividade citolítica das células T (6). Recentemente, demonstrou-se que o metilglioxal, um subproduto da glicólise, é produzido por células supressoras de origem mieloide, e a transferência de metilglioxal para células T pode inibir a função das células T efetoras. No tratamento, a neutralização do metilglioxal pode superar a atividade das células supressoras derivadas de mieloides (MDSC) e potencializar sinergicamente a terapia de bloqueio de pontos de controle imunológico em modelos murinos (7). Esses estudos, em conjunto, enfatizam o papel fundamental dos metabólitos derivados do microambiente tumoral (TME) na regulação da função e atividade das células T.
A disfunção das células T tem sido amplamente relatada no câncer de ovário (8). Isso se deve, em parte, às características metabólicas inerentes à hipóxia e à vascularização tumoral anormal (9), que resultam na conversão de glicose e triptofano em subprodutos como ácido lático e quinurenina. O excesso de lactato extracelular reduz a produção de interferon-γ (IFN-γ) e impulsiona a diferenciação de subgrupos mielossupressores (10, 11). O consumo de triptofano inibe diretamente a proliferação de células T e a sinalização do receptor de células T (12-14). Apesar dessas observações, muitos trabalhos sobre o metabolismo imunológico foram realizados em culturas de células T in vitro utilizando meios otimizados ou limitados a modelos murinos homólogos in vivo, nenhum dos quais reflete completamente a heterogeneidade dos cânceres humanos e o macro e microambiente fisiológico.
Uma característica comum do câncer de ovário é a disseminação peritoneal e o aparecimento de ascite. O acúmulo de fluido celular na ascite está associado a doença avançada e prognóstico desfavorável (15). De acordo com relatos, esse compartimento único é hipóxico, apresenta altos níveis de fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) e é infiltrado por células T reguladoras e células mieloides inibitórias (15-18). O ambiente metabólico da ascite pode ser diferente do do próprio tumor, portanto, a reprogramação das células T no espaço peritoneal ainda não está clara. Além disso, as principais diferenças e a heterogeneidade entre a ascite e os metabólitos presentes no ambiente tumoral podem dificultar a infiltração de células imunes e sua função sobre os tumores, sendo necessárias mais pesquisas.
Para solucionar esses problemas, desenvolvemos um método sensível de separação celular e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (LC-MS/MS) para estudar diferentes tipos celulares (incluindo células T CD4+ e CD8+), bem como células dentro e entre tumores. Seus metabólitos abrangem células no mesmo ambiente ascítico e tumoral do paciente. Utilizamos esse método em conjunto com citometria de fluxo de alta dimensão e sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) para fornecer um retrato altamente detalhado do estado metabólico dessas populações-chave. Esse método revelou um aumento significativo no nível de 1-metilnicotinamida (MNA) em células T tumorais, e experimentos in vitro mostraram que o efeito imunomodulador da MNA na função das células T era até então desconhecido. Em geral, esse método revela as interações metabólicas mútuas entre tumores e células imunes e fornece informações únicas sobre metabólitos de regulação imune, o que pode ser útil para o tratamento do câncer de ovário com imunoterapia baseada em células T.
Utilizamos citometria de fluxo de alta dimensão para quantificar simultaneamente a captação de glicose [2-(N-(7-nitrofenil-2-oxa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-desoxiglicose (2-NBDG)] e a atividade mitocondrial [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20), marcadores típicos que distinguem células imunes e populações de células tumorais (Tabela S2 e Figura S1A). Esta análise mostrou que, em comparação com as células T, as células ascíticas e tumorais apresentam níveis mais elevados de captação de glicose, mas com diferenças menores na atividade mitocondrial. A captação média de glicose pelas células tumorais [CD45-EpCAM (EpCAM)+] é de três a quatro vezes maior que a das células T, e a captação média de glicose pelas células T CD4+ é 1,2 vezes maior que a das células T CD8+, o que indica que os linfócitos infiltrantes de tumor (TIL) têm diferentes necessidades metabólicas, mesmo no mesmo microambiente tumoral (Figura 1A). Em contraste, a atividade mitocondrial nas células tumorais é semelhante à das células T CD4+, e a atividade mitocondrial de ambos os tipos celulares é maior do que a das células T CD8+ (Figura 1B). De modo geral, esses resultados revelam o nível metabólico. A atividade metabólica das células tumorais é maior do que a das células T CD4+, e a atividade metabólica das células T CD4+ é maior do que a das células T CD8+. Apesar desses efeitos entre os diferentes tipos celulares, não há diferença consistente no estado metabólico das células T CD4+ e CD8+ ou em suas proporções relativas na ascite em comparação com os tumores (Figura 1C). Em contrapartida, na fração de células CD45-, a proporção de células EpCAM+ no tumor aumentou em comparação com a ascite (Figura 1D). Também observamos uma clara diferença metabólica entre os componentes celulares EpCAM+ e EpCAM-. As células EpCAM+ (tumorais) apresentam maior captação de glicose e atividade mitocondrial do que as células EpCAM-, que é muito maior do que a atividade metabólica dos fibroblastos nas células tumorais no TME (Figura 1, E e F).
(A e B) Intensidade de fluorescência mediana (MFI) da captação de glicose (2-NBDG) (A) e atividade mitocondrial de células T CD4+ (MitoTracker vermelho escuro) (B). Gráficos representativos (esquerda) e dados tabulados (direita) de células T CD8+ e células tumorais EpCAM+CD45- de ascite e tumor. (C) Proporção de células CD4+ e CD8+ (de células T CD3+) em ascite e tumor. (D) Proporção de células tumorais EpCAM+ em ascite e tumor (CD45−). (E e F) Captação de glicose (2-NBDG) (E) e atividade mitocondrial (MitoTracker vermelho escuro) (F) em células tumorais EpCAM+CD45- e EpCAM−CD45- da matriz. Gráficos representativos (esquerda) e dados tabulados (direita) de células tumorais e de ascite. (G) Gráficos representativos da expressão de CD25, CD137 e PD1 por citometria de fluxo. (H e I) Expressão de CD25, CD137 e PD1 em células T CD4+ (H) e células T CD8+ (I). (J e K) Fenótipos de células T naive, de memória central (Tcm), efetoras (Teff) e de memória efetora (Tem) com base na expressão de CCR7 e CD45RO. Imagens representativas (esquerda) e dados tabulares (direita) de células T CD4+ (J) e células T CD8+ (K) em ascite e tumores. Valores de p determinados pelo teste t pareado (*p < 0,05, **p < 0,01 e ***p < 0,001). A linha representa os pacientes correspondentes (n = 6). FMO, fluorescência menos um; MFI, intensidade de fluorescência mediana.
Análises adicionais revelaram outras diferenças significativas entre o estado fenotípico altamente resolvido das células T. As células ativadas (Figura 1, G a I) e de memória efetora (Figura 1, J e K) nos tumores são muito mais frequentes do que no líquido ascítico (proporção de células T CD3+). Da mesma forma, a análise do fenótipo pela expressão de marcadores de ativação (CD25 e CD137) e marcadores de depleção [proteína 1 de morte celular programada (PD1)] mostrou que, embora as características metabólicas dessas populações sejam diferentes (Figura S1, B a E), nenhuma diferença metabólica significativa foi observada consistentemente entre os subconjuntos de células naive, efetoras ou de memória (Figura S1, F a I). ​​Esses resultados foram confirmados pelo uso de métodos de aprendizado de máquina para atribuir automaticamente fenótipos celulares (21), o que revelou ainda a presença de um grande número de células da medula óssea (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) no líquido ascítico do paciente (Figura S2A). Dentre todos os tipos celulares identificados, essa população de células mieloides apresentou a maior captação de glicose e atividade mitocondrial (Figura S2, B a G). Esses resultados destacam as fortes diferenças metabólicas entre os múltiplos tipos celulares encontrados no líquido ascítico e nos tumores de pacientes com carcinoma seroso de alto grau.
O principal desafio para a compreensão das características metabonômicas dos TILs reside na necessidade de isolar amostras de células T com pureza, qualidade e quantidade suficientes a partir de tumores. Estudos recentes demonstraram que métodos de triagem e enriquecimento por esferas baseados em citometria de fluxo podem levar a alterações nos perfis metabólicos celulares (22-24). Para superar esse problema, otimizamos o método de enriquecimento por esferas para isolar TILs de câncer de ovário humano ressecado cirurgicamente antes da análise por LC-MS/MS (ver Materiais e Métodos; Figura 2A). A fim de avaliar o impacto geral desse protocolo nas alterações metabólicas, comparamos os perfis metabólicos de células T ativadas por doadores saudáveis ​​após a etapa de separação por esferas com células que não foram separadas por esferas, mas permaneceram no gelo. Essa análise de controle de qualidade revelou uma alta correlação entre as duas condições (r = 0,77), e a repetibilidade técnica do grupo de 86 metabólitos apresentou alta repetibilidade (Figura 2B). Portanto, esses métodos podem realizar análises precisas de metabólitos em células submetidas ao enriquecimento de tipos celulares, fornecendo assim a primeira plataforma de alta resolução para identificar metabólitos específicos em HGSC, permitindo, dessa forma, uma compreensão mais profunda da especificidade celular do programa de metabolismo sexual.
(A) Diagrama esquemático do enriquecimento com esferas magnéticas. Antes da análise por LC-MS/MS, as células passam por três rodadas consecutivas de enriquecimento com esferas magnéticas ou permanecem no gelo. (B) Efeito do tipo de enriquecimento na abundância de metabólitos. Média de três medições para cada tipo de enriquecimento ± erro padrão. A linha cinza representa uma relação 1:1. O coeficiente de correlação intraclasse (ICC) das medições repetidas é mostrado no rótulo do eixo. NAD, nicotinamida adenina dinucleotídeo. (C) Diagrama esquemático do fluxo de trabalho da análise de metabólitos de pacientes. Ascite ou tumores são coletados de pacientes e criopreservados. Uma pequena porção de cada amostra foi analisada por citometria de fluxo, enquanto as amostras restantes passaram por três rodadas de enriquecimento para células CD4+, CD8+ e CD45-. Essas frações celulares foram analisadas por LC-MS/MS. (D) Mapa de calor da abundância de metabólitos padronizada. O dendrograma representa o agrupamento de Ward das distâncias euclidianas entre as amostras. (E) Análise de componentes principais (PCA) do mapa de metabólitos da amostra, mostrando três réplicas de cada amostra; amostras do mesmo paciente são conectadas por uma linha. (F) A PCA do perfil de metabólitos da amostra condicionada ao paciente (ou seja, usando redundância parcial); o tipo de amostra é limitado pelo casco convexo. PC1, componente principal 1; PC2, componente principal 2.
Em seguida, aplicamos esse método de enriquecimento para analisar 99 metabólitos nas frações de células CD4+, CD8+ e CD45- no líquido ascítico primário e nos tumores de seis pacientes com carcinoma seroso de alto grau (HGSC) (Figura 2C, Figura S3A e Tabelas S3 e S4). A população de interesse representa de 2% a 70% da grande amostra original de células vivas, e a proporção de células varia muito entre os pacientes. Após a separação das esferas, a fração enriquecida de interesse (CD4+, CD8+ ou CD45-) representa, em média, mais de 85% de todas as células vivas na amostra. Esse método de enriquecimento nos permite analisar populações celulares do metabolismo do tecido tumoral humano, o que é impossível de se fazer com amostras grandes. Usando esse protocolo, determinamos que a L-quinurenina e a adenosina, dois metabólitos imunossupressores bem caracterizados, estavam elevados em células T tumorais ou em células tumorais (Figura S3, B e C). Portanto, esses resultados demonstram a fidelidade e a capacidade de nossa tecnologia de separação celular e espectrometria de massa para encontrar metabólitos biologicamente importantes em tecidos de pacientes.
Nossa análise também revelou uma forte separação metabólica dos tipos celulares dentro e entre os pacientes (Figura 2D e Figura S4A). Em particular, em comparação com outros pacientes, o paciente 70 apresentou características metabólicas diferentes (Figura 2E e Figura S4B), indicando que pode haver uma heterogeneidade metabólica substancial entre os pacientes. Vale ressaltar que, em comparação com outros pacientes (1,2 a 2 litros; Tabela S1), a quantidade total de ascite coletada no paciente 70 (80 ml) foi menor. O controle da heterogeneidade interpaciente durante a análise de componentes principais (por exemplo, usando análise de redundância parcial) mostra alterações consistentes entre os tipos celulares, e os tipos celulares e/ou o microambiente estão claramente agregados de acordo com o perfil metabólico (Figura 2F). A análise de metabólitos individuais enfatizou esses efeitos e revelou diferenças significativas entre os tipos celulares e o microambiente. Vale ressaltar que a diferença mais extrema observada foi no MNA, que geralmente é enriquecido em células CD45- e em células CD4+ e CD8+ que infiltram o tumor (Figura 3A). Para as células CD4+, esse efeito é mais evidente, e o MNA em células CD8+ também parece ser fortemente afetado pelo ambiente. No entanto, isso não é importante, pois apenas três dos seis pacientes puderam ser avaliados quanto à pontuação de CD8+ tumoral. Além do MNA, em diferentes tipos de células na ascite e nos tumores, outros metabólitos pouco caracterizados em TIL também apresentam abundância diferencial (Figuras S3 e S4). Portanto, esses dados revelam um conjunto promissor de metabólitos imunomoduladores para pesquisas futuras.
(A) Conteúdo normalizado de MNA em células CD4+, CD8+ e CD45- de ascite e tumor. O gráfico de caixa mostra a mediana (linha), o intervalo interquartil (dobradiça da moldura) e a amplitude dos dados, até 1,5 vezes o intervalo interquartil (bigode da moldura). Conforme descrito em Materiais e Métodos do Paciente, utilize o valor limma do paciente para determinar o valor de P (*P<0,05 e **P<0,01). (B) Diagrama esquemático do metabolismo de MNA (60). Metabólitos: S-adenosil-1-metionina; SAH, S-adenosina-1-homocisteína; NA, nicotinamida; MNA, 1-metilnicotinamida; 2-PY, 1-metil-2-piridona-5-carboxamida; 4-PY, 1-metil-4-piridona-5-carboxamida; NR, ribose de nicotinamida; NMN, mononucleotídeo de nicotinamida. Enzimas (verde): NNMT, nicotinamida N-metiltransferase; SIRT, sirtuínas; NAMPT, nicotinamida fosforibosiltransferase; AOX1, aldeído oxidase 1; NRK, nicotinamida ribosídeo quinase; NMNAT, nicotinamida mononucleotídeo adenilato transferase; Pnp1, purina nucleosídeo fosforilase. (C) t-SNE de scRNA-seq de ascite (cinza) e tumor (vermelho; n = 3 pacientes). (D) Expressão de NNMT em diferentes populações celulares identificadas por scRNA-seq. (E) Expressão de NNMT e AOX1 em SK-OV-3, células renais embrionárias humanas (HEK) 293T, células T e células T tratadas com MNA. A expressão relativa é mostrada em relação a SK-OV-3. O padrão de expressão com SEM é mostrado (n = 6 doadores saudáveis). Valores de Ct maiores que 35 são considerados indetectáveis ​​(UD). (F) Expressão de SLC22A1 e SLC22A2 em células T SK-OV-3, HEK293T e células T tratadas com 8 mM de MNA. A expressão relativa é mostrada em relação às células SK-OV-3. O padrão de expressão com erro padrão da média (SEM) é mostrado (n = 6 doadores saudáveis). Valores de Ct maiores que 35 são considerados indetectáveis ​​(UD). (G) Conteúdo de MNA em células T de doadores saudáveis ​​ativadas após 72 horas de incubação com MNA. O padrão de expressão com SEM é mostrado (n = 4 doadores saudáveis).
A MNA é produzida pela transferência do grupo metil da S-adenosil-1-metionina (SAM) para a nicotinamida (NA) pela nicotinamida N-metiltransferase (NNMT; Figura 3B). A NNMT apresenta superexpressão em diversos tipos de câncer humano e está associada à proliferação, invasão e metástase (25-27). Para melhor compreender a origem da MNA em células T no microambiente tumoral (TME), utilizamos o sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) para caracterizar a expressão da NNMT em diferentes tipos celulares no líquido ascítico e nos tumores de três pacientes com carcinoma seroso de alto grau (HGSC) (Tabela S5). A análise de aproximadamente 6.500 células mostrou que, tanto no líquido ascítico quanto nos tumores, a expressão da NNMT estava restrita às populações presumivelmente de fibroblastos e células tumorais (Figura 3, C e D). Vale ressaltar que não há expressão evidente de NNMT em nenhuma população que expresse PTPRC (CD45+) (Figura 3D e Figura S5A), o que indica que a MNA detectada no espectro de metabólitos foi introduzida nas células T. A expressão da aldeído oxidase 1 (AOX1), que converte MNA em 1-metil-2-piridona-5-carboxamida (2-PYR) ou 1-metil-4-piridona-5-carboxamida (4-PYR) (Figura 3B), também está restrita à população de fibroblastos que expressam COL1A1 (Figura S5A), o que, em conjunto, indica que as células T não possuem a capacidade de metabolizar MNA convencionalmente. O padrão de expressão desses genes relacionados ao MNA foi verificado utilizando um segundo conjunto de dados celulares independente, proveniente de líquido ascítico de pacientes com carcinoma seroso de alto grau (HGSC) (Figura S5B; n = 6) (16). Além disso, a análise por reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) de células T de doadores saudáveis ​​tratadas com MNA mostrou que, em comparação com as células tumorais ovarianas SK-OV-3 de controle, a expressão de NNMT ou AOX1 foi praticamente nula (Figura 3E). Esses resultados inesperados indicam que o MNA pode ser secretado por fibroblastos ou tumores para células T adjacentes no microambiente tumoral.
Embora os candidatos incluam a família de transportadores de cátions orgânicos 1 a 3 (OCT1, OCT2 e OCT3) codificados pela família de transportadores solúveis 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 e SLC22A3), os potenciais transportadores de MNA ainda não foram definidos (28). A qPCR do mRNA de células T de doadores saudáveis ​​mostrou baixos níveis de expressão de SLC22A1, mas níveis indetectáveis ​​de SLC22A2, o que confirmou o que já havia sido relatado na literatura (Figura 3F) (29). Em contraste, a linhagem celular de tumor ovariano SK-OV-3 expressou altos níveis de ambos os transportadores (Figura 3F).
Para testar a possibilidade de as células T terem a capacidade de absorver MNA exógena, células T de doadores saudáveis ​​foram cultivadas por 72 horas na presença de diferentes concentrações de MNA. Na ausência de MNA exógena, o conteúdo celular de MNA não pôde ser detectado (Figura 3G). No entanto, as células T ativadas tratadas com MNA exógena apresentaram um aumento dose-dependente no conteúdo de MNA nas células, até 6 mM de MNA (Figura 3G). Esse resultado indica que, apesar do baixo nível de expressão do transportador e da ausência da principal enzima responsável pelo metabolismo intracelular de MNA, os TILs ainda podem captar MNA.
O espectro de metabólitos nas células T dos pacientes e os experimentos de absorção de MNA in vitro aumentam a possibilidade de que fibroblastos associados ao câncer (CAF) secretem MNA e que as células tumorais possam regular o fenótipo e a função dos TILs. Para determinar o efeito do MNA nas células T, células T de doadores saudáveis ​​foram ativadas in vitro na presença ou ausência de MNA, e sua proliferação e produção de citocinas foram avaliadas. Após 7 dias da adição de MNA na dose mais alta, o número de duplicações populacionais foi moderadamente reduzido, enquanto o vigor foi mantido em todas as doses (Figura 4A). Além disso, o tratamento com MNA exógeno resultou em um aumento na proporção de células T CD4+ e CD8+ expressando fator de necrose tumoral-α (TNF-α; Figura 4B). Em contraste, a produção intracelular de IFN-γ foi significativamente reduzida em células T CD4+, mas não em células T CD8+, e não houve alteração significativa na interleucina 2 (IL-2; Figura 4, C e D). Portanto, o ensaio imunoenzimático (ELISA) dos sobrenadantes dessas culturas de células T tratadas com MNA mostrou um aumento significativo de TNFα, uma diminuição de IFN-γ e nenhuma alteração em IL-2 (Figura 4, E a G). A diminuição de IFN-γ indica que o MNA pode desempenhar um papel na inibição da atividade antitumoral das células T. Para simular o efeito do MNA na citotoxicidade mediada por células T, células T com receptor de antígeno quimérico (FRα-CAR-T) direcionadas ao receptor de folato α e células CAR-T (GFP) reguladas por proteína fluorescente verde (GFP) (GFP-CAR-T) foram produzidas a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de doadores saudáveis. As células CAR-T foram cultivadas por 24 horas na presença de MNA e, em seguida, cocultivadas com células tumorais ovarianas humanas SK-OV-3 que expressam o receptor de folato α em uma proporção de células efetoras para células-alvo de 10:1. O tratamento com MNA resultou em uma diminuição significativa na atividade citotóxica das células FRα-CAR-T, semelhante à observada em células FRα-CAR-T tratadas com adenosina (Figura 4H).
(A) Contagem total de células viáveis ​​e duplicação populacional (DP) diretamente da cultura no dia 7. O gráfico de barras representa a média ± erro padrão da média (EPM) de seis doadores saudáveis. Representa dados de pelo menos n = 3 experimentos independentes. (B a D) CD3/CD28 e IL-2 foram usados ​​para ativar células T em suas respectivas concentrações de MNA por 7 dias. Antes da análise, as células foram estimuladas com PMA/ionomicina com GolgiStop por 4 horas. Expressão de TNFα (B) em células T. Imagem de exemplo (esquerda) e dados tabulares (direita) da expressão de TNFα em células vivas. Expressão de IFN-γ (C) e IL-2 (D) em células T. A expressão de citocinas foi medida por citometria de fluxo. O gráfico de barras representa a média (n = 6 doadores saudáveis) ± EPM. Use análise de variância de uma via e medidas repetidas (*P<0,05 e **P<0,01) para determinar o valor de P. Representa dados de pelo menos n = 3 experimentos independentes. (E a G) CD3/CD28 e IL-2 foram usados ​​para ativar células T em suas respectivas concentrações de MNA por 7 dias. O meio foi coletado antes e após 4 horas de estimulação com PMA/ionomicina. As concentrações de TNFα (E), IFN-γ (F) e IL-2 (G) foram medidas por ELISA. O gráfico de barras representa a média (n = 5 doadores saudáveis) + erro padrão da média (EPM). O valor de p foi determinado usando análise de variância unidirecional e medidas repetidas (*p < 0,05). A linha pontilhada indica o limite de detecção. (H) Ensaio de lise celular. Células FRα-CAR-T ou GFP-CAR-T foram tratadas com adenosina (250 μM) ou MNA (10 mM) por 24 horas, ou deixadas sem tratamento (Ctrl). A porcentagem de morte de células SK-OV-3 foi medida. O valor de p foi determinado pelo teste t de Welch (*p < 0,5 e **p < 0,01).
Para obter uma compreensão mecanística da regulação da expressão de TNFα dependente de MNA, as alterações no mRNA de TNFα em células T tratadas com MNA foram avaliadas (Figura 5A). Células T de doadores saudáveis ​​tratadas com MNA apresentaram um aumento de duas vezes nos níveis de transcrição de TNFα, indicando que a regulação transcricional de TNFα depende de MNA. Para investigar esse possível mecanismo regulatório, dois fatores de transcrição conhecidos que regulam o TNFα, o fator nuclear de células T ativadas (NFAT) e a proteína específica 1 (Sp1), foram avaliados em resposta à ligação de MNA ao promotor proximal de TNFα (30). O promotor de TNFα contém 6 sítios de ligação de NFAT identificados e 2 sítios de ligação de Sp1, com sobreposição em um sítio [-55 pares de bases (pb) do cap 5'] (30). A imunoprecipitação da cromatina (ChIP) mostrou que, quando tratadas com MNA, a ligação de Sp1 ao promotor de TNFα aumentou três vezes. A incorporação de NFAT também aumentou e se tornou significativa (Figura 5B). Esses dados indicam que o MNA regula a expressão do TNFα por meio da transcrição de Sp1 e, em menor grau, a expressão do NFAT.
(A) Comparado com células T cultivadas sem MNA, a variação da expressão de TNFα em células T tratadas com MNA. O padrão de expressão com erro padrão da média (SEM) é mostrado (n = 5 doadores saudáveis). Representa dados de pelo menos n = 3 experimentos independentes. (B) O promotor de TNFα de células T tratadas com ou sem 8 mM de MNA após NFAT e Sp1 serem combinados com (Ctrl) e estimulação com PMA/ionomicina por 4 horas. Imunoglobulina G (IgG) e H3 foram usados ​​como controles negativo e positivo para imunoprecipitação, respectivamente. A quantificação de ChIP mostrou que a ligação de Sp1 e NFAT ao promotor de TNFα em células tratadas com MNA aumentou várias vezes em comparação com o controle. Representa dados de pelo menos n = 3 experimentos independentes. Valor de p determinado por testes t múltiplos (*** p < 0,01). (C) Comparado ao líquido ascítico de carcinoma seroso de alto grau (HGSC), as células T (não citotóxicas) mostraram aumento da expressão de TNF no tumor. As cores representam diferentes pacientes. As células exibidas foram amostradas aleatoriamente para 300 e ajustadas aleatoriamente para limitar a sobreposição (** Padj = 0,0076). (D) Modelo proposto de MNA para câncer de ovário. O MNA é produzido em células tumorais e fibroblastos no microambiente tumoral (TME) e é captado por células T. O MNA aumenta a ligação do Sp1 ao promotor do TNFα, levando ao aumento da transcrição do TNFα e da produção da citocina TNFα. O MNA também causa uma diminuição no IFN-γ. A inibição da função das células T leva à redução da capacidade de destruição e ao crescimento acelerado do tumor.
De acordo com relatos, o TNFα possui efeitos antitumorais dependentes da ação na frente e atrás do tumor, mas também é conhecido por promover o crescimento e a metástase do câncer de ovário (31-33). Relatos indicam que a concentração de TNFα no líquido ascítico e no tecido tumoral de pacientes com câncer de ovário é maior do que em tecidos benignos (34-36). Em termos de mecanismo de ação, o TNFα pode regular a ativação, a função e a proliferação de leucócitos, além de alterar o fenótipo das células cancerígenas (37, 38). Em consonância com esses achados, a análise de expressão gênica diferencial demonstrou que o TNF estava significativamente superexpresso em células T no tecido tumoral em comparação com o líquido ascítico (Figura 5C). O aumento na expressão de TNF foi evidente apenas em populações de células T com fenótipo não citotóxico (Figura S5A). Em resumo, esses dados corroboram a hipótese de que o MNA possui efeitos duplos, imunossupressores e promotores tumorais, no carcinoma seroso de alto grau (HGSC).
A marcação fluorescente baseada em citometria de fluxo tornou-se o principal método para o estudo do metabolismo de TILs (linfócitos infiltrantes de tumor). Esses estudos mostraram que, em comparação com linfócitos do sangue periférico ou células T de órgãos linfoides secundários, os TILs murinos e humanos apresentam maior tendência à captação de glicose (4, 39) e perda gradual da função mitocondrial (19, 40). Embora tenhamos observado resultados semelhantes neste estudo, o principal avanço reside na comparação do metabolismo de células tumorais e TILs do mesmo tecido tumoral ressecado. Em consonância com alguns desses relatos anteriores, as células tumorais (CD45-EpCAM+) da ascite e dos tumores apresentam maior captação de glicose do que as células T CD8+ e CD4+, corroborando a hipótese de que a alta captação de glicose pelas células tumorais pode ser comparada à das células T no microambiente tumoral (TME). Contudo, a atividade mitocondrial das células tumorais é maior do que a das células T CD8+, mas semelhante à das células T CD4+. Esses resultados reforçam o tema emergente de que o metabolismo oxidativo é importante para as células tumorais (41, 42). Eles também sugerem que as células T CD8+ podem ser mais suscetíveis à disfunção oxidativa do que as células T CD4+, ou que as células T CD4+ podem usar fontes de carbono diferentes da glicose para manter a atividade mitocondrial (43, 44). Deve-se notar que não observamos diferença na captação de glicose ou na atividade mitocondrial entre células T CD4+ efetoras, células T de memória efetora e células T de memória central na ascite. Da mesma forma, o estado de diferenciação das células T CD8+ em tumores não tem relação com alterações na captação de glicose, destacando a diferença significativa entre células T cultivadas in vitro e TILs humanos in vivo (22). Essas observações também foram confirmadas pelo uso de alocação automática imparcial de populações celulares, que revelou ainda que células CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+ com maior captação de glicose e atividade mitocondrial do que as células tumorais são prevalentes, mas constituem uma população celular metabolicamente ativa. Esta população pode representar a suposta subpopulação de células supressoras mieloides ou células dendríticas plasmocitoides identificadas na análise scRNA-seq. Embora ambas tenham sido relatadas em tumores ovarianos humanos [45], ainda são necessários mais estudos para descrever essa subpopulação mieloide.
Embora os métodos baseados em citometria de fluxo possam esclarecer as diferenças gerais no metabolismo da glicose e oxidativo entre os tipos celulares, os metabólitos precisos produzidos pela glicose ou outras fontes de carbono para o metabolismo mitocondrial no microambiente tumoral (TME) ainda não foram determinados. Atribuir a presença ou ausência de metabólitos a um determinado subconjunto de TILs requer a purificação da população celular do tecido excisado. Portanto, nosso método de enriquecimento celular, combinado com espectrometria de massa, pode fornecer informações sobre os metabólitos que são diferencialmente enriquecidos em células T e populações de células tumorais em amostras de pacientes correspondentes. Embora esse método apresente vantagens em relação à triagem celular por ativação de fluorescência, certas bibliotecas de metabólitos podem ser afetadas devido à estabilidade inerente e/ou à alta taxa de renovação (22). Mesmo assim, nosso método foi capaz de identificar dois metabólitos imunossupressores reconhecidos, adenosina e quinurenina, pois eles variam muito entre os tipos de amostra.
Nossa análise metabonômica de tumores e subtipos de TILs fornece mais informações sobre o papel dos metabólitos no microambiente tumoral ovariano. Primeiro, usando citometria de fluxo, determinamos que não havia diferença na atividade mitocondrial entre tumores e células T CD4+. No entanto, a análise por LC-MS/MS revelou alterações significativas na abundância de metabólitos entre essas populações, indicando que as conclusões sobre o metabolismo dos TILs e sua atividade metabólica geral requerem interpretação cuidadosa. Em segundo lugar, o MNA é o metabólito com a maior diferença entre células CD45- e células T na ascite, e não nos tumores. Portanto, a compartimentalização e a localização do tumor podem ter efeitos diferentes no metabolismo dos TILs, o que destaca a possível heterogeneidade em um determinado microambiente. Em terceiro lugar, a expressão da enzima NNMT, produtora de MNA, é principalmente limitada aos CAFs, que são células tumorais em menor grau, mas níveis detectáveis ​​de MNA são observados em células T derivadas de tumores. A superexpressão de NNMT em CAF ovarianos tem um conhecido efeito promotor do câncer, em parte devido à promoção do metabolismo de CAF, invasão tumoral e metástase (27). Embora o nível geral de TIL seja moderado, a expressão de NNMT em CAF está intimamente relacionada ao subtipo mesenquimal do Atlas do Genoma do Câncer (TCGA), que está associado a um prognóstico ruim (27, 46, 47). Finalmente, a expressão da enzima AOX1, responsável pela degradação de MNA, também é limitada à população de CAF, o que indica que as células T não têm a capacidade de metabolizar MNA. Esses resultados apoiam a ideia de que, embora sejam necessários mais estudos para verificar essa descoberta, altos níveis de MNA em células T podem indicar a presença de um microambiente imunossupressor em CAF.
Considerando o baixo nível de expressão dos transportadores de MNA e os níveis indetectáveis ​​de proteínas-chave envolvidas no metabolismo de MNA, a presença de MNA em células T é inesperada. Nem NNMT nem AOX1 puderam ser detectados por análise de scRNA-seq e qPCR direcionado em duas coortes independentes. Esses resultados indicam que o MNA não é sintetizado pelas células T, mas sim absorvido do microambiente tumoral circundante. Experimentos in vitro mostram que as células T tendem a acumular MNA exógeno.
Nossos estudos in vitro demonstraram que o MNA exógeno induz a expressão de TNFα em células T e aumenta a ligação de Sp1 ao promotor de TNFα. Embora o TNFα possua funções tanto antitumorais quanto citotóxicas, no câncer de ovário, ele pode promover o crescimento tumoral (31-33). A neutralização do TNFα em culturas de células tumorais ovarianas ou a eliminação da sinalização de TNFα em modelos murinos podem aumentar a produção de citocinas inflamatórias mediada por TNFα e inibir o crescimento tumoral (32, 35). Portanto, nesse caso, o MNA derivado do microambiente tumoral pode atuar como um metabólito pró-inflamatório por meio de um mecanismo dependente de TNFα através do circuito autócrino, promovendo assim a ocorrência e disseminação do câncer de ovário (31). Com base nessa possibilidade, o bloqueio de TNFα está sendo estudado como um potencial agente terapêutico para o câncer de ovário (37, 48, 49). Além disso, o MNA prejudica a citotoxicidade das células CAR-T contra células tumorais ovarianas, fornecendo mais evidências da supressão imunológica mediada por MNA. Em conjunto, esses resultados sugerem um modelo no qual tumores e células CAF secretam MNA no microambiente tumoral extracelular. Através de (i) estimulação do crescimento do câncer de ovário induzida por TNF e (ii) inibição da atividade citotóxica das células T induzida por MNA, isso pode ter um efeito duplo sobre o tumor (Figura 5D).
Em conclusão, ao combinar enriquecimento celular rápido, sequenciamento de células individuais e perfil metabólico, este estudo revelou as enormes diferenças imunometabolômicas entre células tumorais e células ascíticas em pacientes com carcinoma seroso de alto grau (HGSC). Esta análise abrangente demonstrou que existem diferenças na captação de glicose e na atividade mitocondrial entre as células T e identificou o MNA como um metabólito imunorregulador não autônomo. Esses dados têm impacto na compreensão de como o microambiente tumoral (TME) afeta o metabolismo das células T em cânceres humanos. Embora a competição direta por nutrientes entre células T e células cancerígenas já tenha sido relatada, os metabólitos também podem atuar como reguladores indiretos, promovendo a progressão tumoral e possivelmente suprimindo as respostas imunes endógenas. A descrição mais detalhada do papel funcional desses metabólitos regulatórios pode abrir caminho para estratégias alternativas para o aprimoramento da resposta imune antitumoral.
Amostras de pacientes e dados clínicos foram obtidos através do repositório de tecido tumoral do BC Cancer, certificado pela Rede Canadense de Repositórios de Tecidos. De acordo com o protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do BC Cancer e pela Universidade da Colúmbia Britânica (H07-00463), todos os pacientes obtiveram consentimento livre e esclarecido por escrito ou renunciaram formalmente ao consentimento. As amostras estão armazenadas no Biobanco certificado (BRC-00290). As características detalhadas dos pacientes são apresentadas nas Tabelas S1 e S5. Para a criopreservação, um bisturi foi utilizado para decompor mecanicamente a amostra tumoral do paciente e, em seguida, filtrá-la através de um filtro de 100 micrômetros para obter uma suspensão de células únicas. O líquido ascítico do paciente foi centrifugado a 1500 rpm por 10 minutos a 4°C para sedimentar as células e remover o sobrenadante. As células obtidas do tumor e do líquido ascítico foram criopreservadas em 50% de soro AB humano inativado pelo calor (Sigma-Aldrich), 40% de RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) e 10% de dimetilsulfóxido. Essas suspensões de células únicas preservadas foram descongeladas e utilizadas para metabolômica e determinação de metabólitos, conforme descrito abaixo.
O meio completo consiste em RPMI 1640:AimV filtrado em 0,22 μm, suplementado na proporção de 50:50. O meio RPMI 1640 contém 2,05 mM de L-glutamina (Thermo Fisher Scientific), 10% de soro AB humano inativado pelo calor (Sigma-Aldrich), 12,5 mM de Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM de L-glutamina (Thermo Fisher Scientific), 1x de solução de penicilina-estreptomicina (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) e 50 μM de MB-mercaptoetanol. O meio AimV (Invitrogen) é suplementado com 20 mM de Hepes (Thermo Fisher Scientific) e 2 mM de L-glutamina (Thermo Fisher Scientific). A solução tampão para coloração do citômetro de fluxo consistia em solução salina tamponada com fosfato (PBS; Invitrogen) filtrada a 0,22 μm, suplementada com 3% de soro humano AB inativado pelo calor (Sigma). A solução tampão para enriquecimento celular era composta por PBS filtrado a 0,22 μm e suplementado com 0,5% de soro humano AB inativado pelo calor (Sigma-Aldrich).
Em meio completo a 37 °C, as células foram coradas com 10 nM de MT DR e 100 μM de 2-NBDG por 30 minutos. Em seguida, as células foram coradas com o corante de viabilidade eF506 a 4 °C por 15 minutos. Ressuspenda as células em FC Block (eBioscience) e Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), dilua em tampão de coloração para citometria de fluxo (de acordo com as instruções do fabricante) e incube por 10 minutos à temperatura ambiente. Corar as células com um conjunto de anticorpos (Tabela S2) em tampão de coloração para citometria de fluxo a 4 °C por 20 minutos. Ressuspenda as células em tampão de coloração para citometria de fluxo (Cytek Aurora; configuração 3L-16V-14B-8R) antes da análise. Utilize SpectroFlo e FlowJo V10 para analisar os dados de contagem celular e GraphPad Prism 8 para gerar os gráficos. A intensidade de fluorescência mediana (MFI) de 2-NBDG e MT DR foi normalizada logaritmicamente e, em seguida, um teste t pareado foi usado para análise estatística para considerar pacientes pareados. Todas as populações com menos de 40 eventos foram removidas da análise; um valor de MFI de 1 foi atribuído a quaisquer valores negativos antes de realizar a análise estatística e a visualização dos dados.
Para complementar a estratégia de gating manual do painel de processo acima, utilizamos a anotação completa por árvore de restrição de forma (FAUST) (21) para atribuir automaticamente as células à população após a eliminação de células mortas no FlowJo. Gerenciamos manualmente a saída para mesclar populações que parecem estar mal alocadas (combinando células tumorais PD1+ com células tumorais PD1-) e populações retidas. Cada amostra contém, em média, mais de 2% de células, totalizando 11 populações.
A centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll foi utilizada para separar as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) dos produtos de separação de leucócitos (STEMCELL Technologies). As células T CD8+ foram isoladas das PBMC utilizando microesferas CD8 (Miltenyi) e expandidas em meio completo com TransAct (Miltenyi) por 2 semanas, de acordo com as instruções do fabricante. As células foram incubadas por 5 dias em meio completo contendo IL-7 (10 ng/ml; PeproTech) e, em seguida, reestimuladas com TransAct. No sétimo dia, seguindo as instruções do fabricante, microesferas CD45 humanas (Miltenyi) foram utilizadas para enriquecer as células em três rodadas consecutivas. As células foram aliquotadas para análise por citometria de fluxo (conforme descrito acima), e um milhão de células foram aliquotadas três vezes para análise por LC-MS/MS. As amostras foram processadas por LC-MS/MS conforme descrito abaixo. Estimamos o valor do metabólito ausente com um número de íons de 1.000. Cada amostra é normalizada pelo número total de íons (TIC), convertida logaritmicamente e normalizada automaticamente no MetaboAnalystR antes da análise.
A suspensão de células individuais de cada paciente foi descongelada e filtrada através de um filtro de 40 μm em meio completo (conforme descrito acima). De acordo com o protocolo do fabricante, três rodadas consecutivas de seleção positiva por separação magnética com esferas MicroBeads (Miltenyi) foram utilizadas para enriquecer as amostras em células CD8+, CD4+ e CD45- (em gelo). Resumidamente, as células são ressuspensas em tampão de enriquecimento celular (conforme descrito acima) e contadas. As células foram incubadas com esferas CD8 humanas, esferas CD4 humanas ou esferas CD45 humanas (Miltenyi) a 4°C por 15 minutos e, em seguida, lavadas com tampão de enriquecimento celular. A amostra é passada através da coluna LS (Miltenyi) e as frações positivas e negativas são coletadas. Para reduzir a duração e maximizar a recuperação celular, a fração CD8 é então utilizada para a segunda rodada de enriquecimento de CD4+ e a fração CD4 é utilizada para o subsequente enriquecimento de CD45. Mantenha a solução em gelo durante todo o processo de separação.
Para preparar as amostras para análise de metabólitos, as células foram lavadas uma vez com solução salina gelada e 1 ml de metanol a 80% foi adicionado a cada amostra. Em seguida, as amostras foram homogeneizadas em vórtex e congeladas instantaneamente em nitrogênio líquido. Foram então submetidas a três ciclos de congelamento e descongelamento e centrifugadas a 14.000 rpm por 15 minutos a 4°C. O sobrenadante contendo os metabólitos foi evaporado até secar. Os metabólitos foram redissolvidos em 50 μl de ácido fórmico a 0,03%, homogeneizados em vórtex e centrifugados para remover os detritos.
Extraia os metabólitos conforme descrito acima. Transfira o sobrenadante para um frasco de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) para pesquisa metabolômica. Utilize um protocolo de tratamento aleatório para tratar cada amostra com um número semelhante de células, a fim de evitar efeitos de lote. Realizamos uma avaliação qualitativa dos metabólitos globais previamente publicados no espectrômetro de massas de triplo quadrupolo AB SCIEX QTRAP 5500 (50). A análise cromatográfica e a integração da área do pico foram realizadas utilizando o software MultiQuant versão 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Uma contagem de íons de 1000 foi usada para estimar o valor do metabólito ausente, e o TIC de cada amostra foi usado para calcular a área do pico normalizada de cada metabólito detectado para corrigir as alterações introduzidas pela análise instrumental do processamento da amostra. Após a normalização do TIC, o MetaboAnalystR(51) (parâmetro padrão) é usado para conversão logarítmica e escalonamento automático da linha de normalização. Usamos PCA com o pacote vegan do R para realizar a análise exploratória das diferenças do metaboloma entre os tipos de amostra e usamos análise de redundância parcial para analisar os pacientes. Usamos o método de Ward para construir um dendrograma de mapa de calor para agrupar a distância euclidiana entre as amostras. Usamos limma (52) na abundância de metabólitos padronizada para identificar metabólitos diferencialmente abundantes em todo o tipo celular e microambiente. Para simplificar a explicação, usamos o parâmetro de média do grupo para especificar o modelo e consideramos os tipos celulares no microambiente como cada grupo (n = 6 grupos); Para o teste de significância, realizamos três medições repetidas para cada metabólito. Para evitar replicação falsa, o paciente foi incluído como um obstáculo no modelo limma. Para verificar as diferenças nos metabólitos entre diferentes pacientes, ajustamos o modelo limma incluindo os pacientes de forma fixa. Relatamos a significância do contraste pré-especificado entre o tipo celular e o microambiente de Padj <0,05 (correção de Benjamini-Hochberg).
Após enriquecimento de células vivas utilizando o kit Miltenyi Dead Cell Removal (>80% de viabilidade), o sequenciamento do transcriptoma de célula única foi realizado em amostras totais de ascite congelada e tumor utilizando um protocolo de expressão gênica 5′ de 10x. Cinco casos com tumores e ascite correspondentes foram analisados, embora a baixa viabilidade de uma amostra tumoral tenha impedido sua inclusão. Para obter múltiplas seleções de pacientes, combinamos as amostras de cada paciente nas faixas do controlador Chromium de 10x e analisamos os locais de ascite e tumor separadamente. Após o sequenciamento [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), genoma de Quebec; [com uma média de 73.488 e 41.378 leituras por célula para tumor e ascite, respectivamente]], usamos CellSNP e Vireo (53) (com base no CellSNP como SNP humano comum (VCF) fornecido pelo GRCh38, ao qual é atribuída uma identidade de doador. Usamos o SNPRelate para inferir a identidade mais próxima (IBS) do status do genótipo do paciente (IBS), excluindo células não atribuídas e células identificadas como duplexes e doadores correspondentes entre as amostras de ascite e tumor (54). Com base nessa tarefa, retivemos três casos com abundante representação celular no tumor e na ascite para análise subsequente. Após realizar uma etapa de filtragem em massa nos pacotes BioConductor scater (55) e scran (56), obtivemos 6.975 células (2.792 e 4.183 células do tumor e da ascite, respectivamente) para análise. Usamos o agrupamento Louvain da rede de vizinhos mais próximos compartilhados (SNN) do igraph (57) com base em Distância de Jaccard para agrupar células por expressão. Os agrupamentos foram anotados manualmente para tipos celulares putativos com base na expressão de genes marcadores e visualizados com t-SNE. As células T citotóxicas são definidas pela expressão de CD8A e GZMA, excluindo subgrupos com baixa expressão de proteína ribossômica. Acessamos os dados publicados por Izar et al. (16), incluindo sua incorporação t-SNE, que pode controlar a sobreposição de expressão entre marcadores de células imunes e a expressão de NNMT.
As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram separadas dos produtos de separação de leucócitos (STEMCELL Technologies) por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll. As células CD3+ foram isoladas das PBMC utilizando esferas CD3 (Miltenyi). Na presença ou ausência de MNA, as células CD3+ foram ativadas com CD3 imobilizado em placa (5 μg/ml), CD28 solúvel (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; Proleukin). No último dia de expansão, a viabilidade (corante de viabilidade fixável eFluor450, eBioscience) e a proliferação (123 contagens de esferas eBeads, Thermo Fisher Scientific) foram avaliadas por citometria de fluxo. A função efetora foi avaliada estimulando as células com PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) com GolgiStop por 4 horas, e monitorando CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4, BioLegend) e TNFα-isotiocianato de fluoresceína (FITC) (MAb11, BD). As células para qPCR e ChIP foram estimuladas com PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) por 4 horas. O sobrenadante do ELISA foi coletado antes e depois da estimulação com PMA (20 ng/ml) e ionomicina (1 μg/ml) por 4 horas.
Siga o protocolo do fabricante para isolar o RNA usando o kit RNeasy Plus Mini (QIAGEN). Utilize o QIAshredder (QIAGEN) para homogeneizar a amostra. Utilize o kit High-Capacity RNA to cDNA (Thermo Fisher Scientific) para sintetizar o DNA complementar (cDNA). Utilize o TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) para quantificar a expressão gênica (de acordo com o protocolo do fabricante) com as seguintes sondas: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH)] e Hs01010726_m1 (SLC22A2). As amostras foram analisadas no sistema de PCR em tempo real StepOnePlus (Applied Biosystems) na placa de reação óptica rápida MicroAmp de 96 poços (Applied Biosystems) com filme óptico MicroAmp. Qualquer valor de Ct superior a 35 é considerado acima do limite de detecção e marcado como indetectável.
Realize o ChIP conforme descrito anteriormente (58). Resumidamente, as células foram tratadas com formaldeído (concentração final de 1,42%) e incubadas à temperatura ambiente por 10 minutos. Utilize tampão de intumescimento suplementado (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl e 0,1% NP-40) em gelo por 10 minutos e, em seguida, ressuspenda em tampão de imunoprecipitação conforme descrito (58). A amostra foi então sonicada com os seguintes ciclos: 10 ciclos (20 pulsos de 1 segundo) e um tempo estático de 40 segundos. Incube os anticorpos de grau ChIP: imunoglobulina G (Cell Signaling Technology; 1 μl), histona H3 (Cell Signaling Technology; 3 μl), NFAT (Invitrogen; 3 μl) e SP1 (Cell Signaling Technology; 3 μl) com a amostra a 4 °C sob agitação durante a noite. Incube as esferas de proteína A (Thermo Fisher Scientific) com a amostra a 4 °C, sob agitação suave, durante 1 hora. Em seguida, utilize esferas Chelex (Bio-Rad) para enriquecer o DNA e proteinase K (Thermo Fisher) para a digestão proteica. O promotor de TNFα foi detectado por PCR: sentido direto, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; sentido inverso, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produto de 207 pb). As imagens foram produzidas pelo Image Lab (Bio-Rad) e quantificadas utilizando o software ImageJ.
O sobrenadante da cultura celular foi coletado conforme descrito anteriormente. A determinação foi realizada de acordo com os procedimentos do fabricante dos kits ELISA para TNFα humano (Invitrogen), IL-2 humano (Invitrogen) e IFN-γ humano (Abcam). Conforme o protocolo do fabricante, o sobrenadante foi diluído 1:100 para detecção de TNFα e IL-2, e 1:3 para detecção de IFN-γ. A absorbância a 450 nm foi medida utilizando o leitor de múltiplas etiquetas EnVision 2104 (PerkinElmer).
As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) foram separadas dos produtos de separação de leucócitos (STEMCELL Technologies) por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll. As células CD3+ foram isoladas das PBMC utilizando esferas CD3 (Miltenyi). Na presença ou ausência de MNA, as células CD3+ foram ativadas com CD3 imobilizado em placa (5 μg/ml), CD28 solúvel (3 μg/ml) e IL-2 (300 U/ml; Proleukin) durante 3 dias. Após 3 dias, as células foram coletadas e lavadas com solução salina a 0,9%, e o pellet foi congelado rapidamente. A contagem celular foi realizada por citometria de fluxo (Cytek Aurora; configuração 3L-16V-14B-8R) utilizando esferas eBeads 123count.
Extrair os metabólitos conforme descrito acima. O extrato seco foi reconstituído a uma concentração de 4000 equivalentes celulares/μl. A amostra foi analisada por cromatografia de fase reversa (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) e coluna CORTECS T3 (2,1 × 150 mm, tamanho de partícula 1,6 μm, tamanho de poro 120 Å; nº 186008500, Waters). Espectrômetro de massas polar (6470, Agilent), no qual a ionização por eletrospray opera no modo positivo. A fase móvel A consiste em ácido fórmico a 0,1% (em H₂O) e a fase móvel B em acetonitrila a 90% e ácido fórmico a 0,1%. O gradiente de LC é de 0 a 2 minutos para 100% de A, de 2 a 7,1 minutos para 99% de B e de 7,1 a 8 minutos para 99% de B. Em seguida, reequilibre a coluna com a fase móvel A a uma vazão de 0,6 ml/min por 3 minutos. A vazão é então de 0,4 ml/min e a câmara da coluna é aquecida a 50 °C. Utilize o padrão químico puro da MNA (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontário, Canadá) para determinar o tempo de retenção (TR) e a transformação (TR = 0,882 minutos, transformação 1 = 137→94,1, transformação 2 = 137→92, transformação 3 = 137→78). Quando todas as três transições ocorrem no tempo de retenção correto, a transição 1 é utilizada para a quantificação, garantindo a especificidade. A curva padrão de MNA (Toronto Research Chemical Company) foi gerada por seis diluições seriadas da solução estoque (1 mg/mL) para obter padrões de 0,1, 1,0, 10 e 100 ng/mL e 1,0 e 10 μg/mL, respectivamente. O limite de detecção é de 1 ng/mL e a resposta linear situa-se entre 10 ng/mL e 10 μg/mL. Cada injeção de dois microlitros de amostra e padrão foi utilizada para a análise por LC/MS, e uma amostra de controle de qualidade mista foi analisada a cada oito injeções para garantir a estabilidade da plataforma analítica. As respostas de MNA de todas as amostras de células tratadas com MNA estiveram dentro da faixa linear do ensaio. A análise dos dados foi realizada utilizando o software de análise quantitativa MassHunter (v9.0, Agilent).
A construção αFR-CAR de segunda geração foi obtida de Song et al. (59). Resumidamente, a construção contém os seguintes componentes: sequência líder de CD8a, fragmento variável de cadeia única específico para αFR humano, região de dobradiça e transmembrana de CD8a, domínio intracelular de CD27 e domínio intracelular de CD3z. A sequência completa do CAR foi sintetizada pela GenScript e, em seguida, clonada no vetor de expressão lentiviral de segunda geração a montante do cassete de expressão de GFP usado para avaliar a eficiência de transdução.
O lentivírus foi produzido por transfecção de células HEK293T [American Type Culture Collection (ATCC); cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco contendo 10% de soro fetal bovino (SFB) e 1% de penicilina/estreptomicina, e utilizando o vetor CAR-GFP e os plasmídeos de empacotamento (psPAX2 e pMD2.G, Addgene) com amina de lipofecção (Sigma-Aldrich). O sobrenadante contendo o vírus foi coletado 48 e 72 horas após a transfecção, filtrado e concentrado por ultracentrifugação. O sobrenadante viral concentrado foi armazenado a -80°C até a transdução.
As células mononucleares do sangue periférico (PBMC) são separadas dos leucócitos de doadores saudáveis ​​obtidos por centrifugação em gradiente de densidade de Ficoll. Microesferas de seleção positiva para CD8 (Miltenyi) são utilizadas para isolar células CD8+ das PBMC. As células T são estimuladas com TransAct (Miltenyi) em meio TexMACS [Miltenyi; suplementado com 3% de soro humano inativado pelo calor, 1% de PenStrep e IL-2 (300 U/ml)]. Vinte e quatro horas após a estimulação, as células T são transduzidas com lentivírus (10 μl de sobrenadante viral concentrado por 10⁶ células). De 1 a 3 dias após a transdução em um citômetro de fluxo Cytek Aurora (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), a expressão de GFP nas células é avaliada para demonstrar uma eficiência de transdução de pelo menos 30%.
As células CAR-T foram cultivadas por 24 horas em Immunocult (STEMCELL Technologies; suplementado com 1% de PenStrep) nas seguintes condições: não tratadas, tratadas com 250 μM de adenosina ou 10 mM de MNA. Após o pré-tratamento, as células CAR-T foram lavadas com PBS e combinadas com 20.000 células SK-OV-3 [ATCC; em meio McCoy 5A (Sigma-Aldrich) suplementado com 10% de FBS e 1% de PenStrep na proporção de 10:1. A proporção de células efetoras para células-alvo de 1:1 foi amplificada em triplicata em meio Immunocult suplementado. Células SK-OV-3 e células SK-OV-3 lisadas com saponina digitálica (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich) foram usadas como controles negativo e positivo, respectivamente. Após 24 horas de co-cultivo, o sobrenadante foi coletado e a lactato desidrogenase (LDH) foi dosada de acordo com as instruções do fabricante (Kit de Ensaio de Citotoxicidade LDH Glo, Promega). O sobrenadante de LDH foi diluído 1:50 em tampão LDH. A porcentagem de morte celular foi calculada utilizando a seguinte fórmula: porcentagem de morte celular = porcentagem de correção / taxa máxima de morte celular x 100%, onde porcentagem de correção = co-cultivo apenas com células T e taxa máxima de morte celular = controle positivo - controle negativo.
Conforme descrito no texto ou nos materiais e métodos, utilize o GraphPad Prism 8, o Microsoft Excel ou o R v3.6.0 para a análise estatística. Se múltiplas amostras forem coletadas do mesmo paciente (como ascite e tumor), utilize o teste t pareado ou inclua o paciente como um efeito aleatório em um modelo linear ou generalizado, conforme apropriado. Para a análise metabolômica, o teste de importância é realizado em triplicata.
Para acessar o material complementar deste artigo, visite http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
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Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. De Bellardini (Ralph J. DeBerardinis), Russell G. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
A MNA contribui para a supressão imunológica das células T e representa um alvo potencial para imunoterapia no tratamento do câncer em humanos.
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A MNA contribui para a supressão imunológica das células T e representa um alvo potencial para imunoterapia no tratamento do câncer em humanos.
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