O ácido propiônico (PPA), um agente antifúngico e aditivo alimentar comum, demonstrou causar desenvolvimento neurológico anormal em camundongos, acompanhado de disfunção gastrointestinal, que pode ser causada por disbiose intestinal. Uma ligação entre a exposição dietética ao PPA e a disbiose da microbiota intestinal foi sugerida, mas não foi investigada diretamente. Neste estudo, investigamos as alterações na composição da microbiota intestinal associadas ao PPA que podem levar à disbiose. Os microbiomas intestinais de camundongos alimentados com uma dieta sem tratamento (n=9) e uma dieta enriquecida com PPA (n=13) foram sequenciados usando sequenciamento metagenômico de longo alcance para avaliar as diferenças na composição microbiana e nas vias metabólicas bacterianas. O PPA dietético foi associado a um aumento na abundância de táxons significativos, incluindo várias espécies de Bacteroides, Prevotella e Ruminococcus, cujos membros já foram implicados na produção de PPA. Os microbiomas dos camundongos expostos ao PPA também apresentaram mais vias relacionadas ao metabolismo lipídico e à biossíntese de hormônios esteroides. Nossos resultados indicam que o PPA pode alterar a microbiota intestinal e suas vias metabólicas associadas. Essas alterações observadas destacam que conservantes classificados como seguros para consumo podem influenciar a composição da microbiota intestinal e, consequentemente, a saúde humana. Dentre eles, P, G ou S é selecionado dependendo do nível de classificação que está sendo analisado. Para minimizar o impacto de classificações falso-positivas, um limiar mínimo de abundância relativa de 1e-4 (1/10.000 leituras) foi adotado. Antes da análise estatística, as abundâncias relativas relatadas por Bracken (fraction_total_reads) foram transformadas usando a transformação de log-razão centrada (CLR) (Aitchison, 1982). O método CLR foi escolhido para a transformação dos dados por ser invariante à escala e suficiente para conjuntos de dados não esparsos (Gloor et al., 2017). A transformação CLR utiliza o logaritmo natural. Os dados de contagem relatados por Bracken foram normalizados usando a expressão logarítmica relativa (RLE) (Anders e Huber, 2010). As figuras foram geradas usando uma combinação de matplotlib v. 3.7.1, seaborn v. 3.7.2 e logaritmos sequenciais (Gloor et al., 2017). 0.12.2 e stantanotations v. 0.5.0 (Hunter, 2007; Waskom, 2021; Charlier et al., 2022). A razão Bacillus/Bacteroidetes foi calculada para cada amostra usando contagens bacterianas normalizadas. Os valores apresentados nas tabelas foram arredondados para 4 casas decimais. O índice de diversidade de Simpson foi calculado usando o script alpha_diversity.py fornecido no pacote KrakenTools v. 1.2 (Lu et al., 2022). O relatório Bracken é fornecido no script e o índice de Simpson “Si” é fornecido para o parâmetro -an. Diferenças significativas na abundância foram definidas como diferenças médias de CLR ≥ 1 ou ≤ -1. Uma diferença média de CLR de ±1 indica um aumento de 2,7 vezes na abundância de um tipo de amostra. O sinal (+/-) indica se o táxon é mais abundante na amostra PPA e na amostra controle, respectivamente. A significância estatística foi determinada utilizando o teste U de Mann-Whitney (Virtanen et al., 2020). O programa Statsmodels v. 0.14 (Benjamini e Hochberg, 1995; Seabold e Perktold, 2010) foi utilizado, e o procedimento de Benjamini-Hochberg foi aplicado para correção de testes múltiplos. Um valor p ajustado ≤ 0,05 foi utilizado como limiar para determinar a significância estatística.
O microbioma humano é frequentemente referido como “o último órgão do corpo” e desempenha um papel vital na saúde humana (Baquero e Nombela, 2012). Em particular, o microbioma intestinal é reconhecido por sua influência sistêmica e por seu papel em muitas funções essenciais. As bactérias comensais são abundantes no intestino, ocupando múltiplos nichos ecológicos, utilizando nutrientes e competindo com potenciais patógenos (Jandhyala et al., 2015). Diversos componentes bacterianos da microbiota intestinal são capazes de produzir nutrientes essenciais, como vitaminas, e promover a digestão (Rowland et al., 2018). Metabólitos bacterianos também demonstraram influenciar o desenvolvimento tecidual e aprimorar vias metabólicas e imunológicas (Heijtz et al., 2011; Yu et al., 2022). A composição do microbioma intestinal humano é extremamente diversa e depende de fatores genéticos e ambientais, como dieta, sexo, medicamentos e estado de saúde (Kumbhare et al., 2019).
A dieta materna é um componente crítico do desenvolvimento fetal e neonatal e uma possível fonte de compostos que podem influenciar o desenvolvimento (Bazer et al., 2004; Innis, 2014). Um desses compostos de interesse é o ácido propiônico (PPA), um ácido graxo de cadeia curta, subproduto da fermentação bacteriana e aditivo alimentar (den Besten et al., 2013). O PPA possui propriedades antibacterianas e antifúngicas, sendo, portanto, utilizado como conservante alimentar e em aplicações industriais para inibir o crescimento de fungos e bactérias (Wemmenhove et al., 2016). O PPA apresenta diferentes efeitos em diferentes tecidos. No fígado, o PPA exerce efeitos anti-inflamatórios, afetando a expressão de citocinas em macrófagos (Kawasoe et al., 2022). Esse efeito regulatório também foi observado em outras células imunes, levando à redução da inflamação (Haase et al., 2021). Contudo, o efeito oposto foi observado no cérebro. Estudos anteriores demonstraram que a exposição ao PPA induz comportamento semelhante ao autismo em camundongos (El-Ansary et al., 2012). Outros estudos mostraram que o PPA pode induzir gliose e ativar vias pró-inflamatórias no cérebro (Abdelli et al., 2019). Por ser um ácido fraco, o PPA pode se difundir através do epitélio intestinal para a corrente sanguínea e, assim, atravessar barreiras restritivas, incluindo a barreira hematoencefálica e a placenta (Stinson et al., 2019), o que destaca a importância do PPA como um metabólito regulador produzido por bactérias. Embora o papel potencial do PPA como fator de risco para o autismo esteja atualmente sob investigação, seus efeitos em indivíduos com autismo podem ir além da indução da diferenciação neural.
Sintomas gastrointestinais como diarreia e constipação são comuns em pacientes com distúrbios do neurodesenvolvimento (Cao et al., 2021). Estudos anteriores demonstraram que o microbioma de pacientes com transtornos do espectro autista (TEA) difere do de indivíduos saudáveis, sugerindo a presença de disbiose da microbiota intestinal (Finegold et al., 2010). Da mesma forma, as características do microbioma de pacientes com doenças inflamatórias intestinais, obesidade, doença de Alzheimer, etc., também diferem das de indivíduos saudáveis (Turnbaugh et al., 2009; Vogt et al., 2017; Henke et al., 2019). No entanto, até o momento, nenhuma relação causal foi estabelecida entre o microbioma intestinal e doenças ou sintomas neurológicos (Yap et al., 2021), embora se acredite que diversas espécies bacterianas desempenhem um papel em alguns desses estados patológicos. Por exemplo, Akkermansia, Bacteroides, Clostridium, Lactobacillus, Desulfovibrio e outros gêneros são mais abundantes na microbiota de pacientes com autismo (Tomova et al., 2015; Golubeva et al., 2017; Cristiano et al., 2018; Zurita et al., 2020). Notavelmente, sabe-se que espécies pertencentes a alguns desses gêneros possuem genes associados à produção de PPA (Reichardt et al., 2014; Yun e Lee, 2016; Zhang et al., 2019; Baur e Dürre, 2023). Dadas as propriedades antimicrobianas do PPA, o aumento de sua abundância pode ser benéfico para o crescimento de bactérias produtoras de PPA (Jacobson et al., 2018). Assim, um ambiente rico em PPA pode levar a alterações na microbiota intestinal, incluindo patógenos gastrointestinais, que podem ser fatores potenciais que levam a sintomas gastrointestinais.
Uma questão central na pesquisa do microbioma é se as diferenças na composição microbiana são causa ou sintoma de doenças subjacentes. O primeiro passo para elucidar a complexa relação entre dieta, microbioma intestinal e doenças neurológicas é avaliar os efeitos da dieta na composição microbiana. Para tanto, utilizamos sequenciamento metagenômico de leitura longa para comparar os microbiomas intestinais da prole de camundongos alimentados com uma dieta rica em PPA ou com uma dieta pobre em PPA. A prole recebeu a mesma dieta que suas mães. Nossa hipótese era de que uma dieta rica em PPA resultaria em alterações na composição da microbiota intestinal e nas vias funcionais microbianas, particularmente aquelas relacionadas ao metabolismo e/ou à produção de PPA.
Este estudo utilizou camundongos transgênicos FVB/N-Tg(GFAP-GFP)14Mes/J (Jackson Laboratories) que superexpressam a proteína fluorescente verde (GFP) sob o controle do promotor GFAP específico para células da glia, seguindo as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Flórida Central (UCF-IACUC) (Número da Permissão para Uso de Animais: PROTO202000002). Após o desmame, os camundongos foram alojados individualmente em gaiolas, com 1 a 5 animais de cada sexo por gaiola. Os animais foram alimentados ad libitum com uma dieta controle purificada (dieta padrão modificada de rótulo aberto, 16% de kcal de gordura) ou com uma dieta suplementada com propionato de sódio (dieta padrão modificada de rótulo aberto, 16% de kcal de gordura, contendo 5.000 ppm de propionato de sódio). A quantidade de propionato de sódio utilizada foi equivalente a 5.000 mg de PFA/kg de peso total da ração. Esta é a maior concentração de PPA aprovada para uso como conservante alimentar. Para preparar este estudo, camundongos reprodutores foram alimentados com ambas as dietas por 4 semanas antes do acasalamento e continuaram com a mesma dieta durante toda a gestação. Os filhotes [22 camundongos, 9 controles (6 machos, 3 fêmeas) e 13 alimentados com PPA (4 machos, 9 fêmeas)] foram desmamados e continuaram com a mesma dieta das mães por 5 meses. Os filhotes foram sacrificados aos 5 meses de idade e o conteúdo fecal intestinal foi coletado e inicialmente armazenado em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml a -20 °C e, em seguida, transferido para um freezer a -80 °C até que o DNA do hospedeiro fosse esgotado e os ácidos nucleicos microbianos fossem extraídos.
O DNA do hospedeiro foi removido de acordo com um protocolo modificado (Charalampous et al., 2019). Resumidamente, o conteúdo fecal foi transferido para 500 µl de InhibitEX (Qiagen, Cat#/ID: 19593) e armazenado congelado. Processe no máximo 1 a 2 pellets fecais por extração. O conteúdo fecal foi então homogeneizado mecanicamente usando um pistilo de plástico dentro do tubo para formar uma suspensão. Centrifugue as amostras a 10.000 RCF por 5 minutos ou até que as amostras se separem em pellets, aspire o sobrenadante e resuspenda o pellet em 250 µl de PBS 1×. Adicione 250 µl de solução de saponina a 4,4% (TCI, número do produto S0019) à amostra como detergente para soltar as membranas celulares eucarióticas. As amostras foram misturadas suavemente até ficarem homogêneas e incubadas à temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, para romper as células eucarióticas, adicionaram-se 350 μl de água livre de nucleases à amostra, incubou-se por 30 s e, então, adicionaram-se 12 μl de NaCl 5 M. As amostras foram centrifugadas a 6000 RCF por 5 min. Aspirou-se o sobrenadante e o pellet foi ressuspendido em 100 μl de PBS 1X. Para remover o DNA da célula hospedeira, adicionaram-se 100 μl de tampão HL-SAN (12,8568 g de NaCl, 4 ml de MgCl2 1 M, 36 ml de água livre de nucleases) e 10 μl da enzima HL-SAN (ArticZymes P/N 70910-202). As amostras foram homogeneizadas por pipetagem e incubadas a 37 °C por 30 min a 800 rpm em um ThermoMixer C da Eppendorf™. Após a incubação, foram centrifugadas a 6000 RCF por 3 min e lavadas duas vezes com 800 µl e 1000 µl de PBS 1X. Finalmente, o sedimento foi ressuspendido em 100 µl de PBS 1X.
O DNA bacteriano total foi isolado utilizando o kit de purificação de DNA genômico Monarch da New England Biolabs (New England Biolabs, Ipswich, MA, Cat# T3010L). O procedimento operacional padrão fornecido com o kit foi ligeiramente modificado. Incube e mantenha a água livre de nucleases a 60 °C antes da operação para a eluição final. Adicione 10 µl de Proteinase K e 3 µl de RNase A a cada amostra. Em seguida, adicione 100 µl de tampão de lise celular e misture suavemente. As amostras foram então incubadas em um ThermoMixer C da Eppendorf™ a 56 °C e 1400 rpm por pelo menos 1 hora e até 3 horas. As amostras incubadas foram centrifugadas a 12.000 RCF por 3 minutos e o sobrenadante de cada amostra foi transferido para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 400 µL de solução de ligação. Os tubos foram então agitados em vórtex por 5 a 10 segundos, com intervalos de 1 segundo. Transfira todo o conteúdo líquido de cada amostra (aproximadamente 600 a 700 µL) para um cartucho de filtro colocado em um tubo de coleta de fluxo contínuo. Os tubos foram centrifugados a 1.000 RCF por 3 minutos para permitir a ligação inicial do DNA e, em seguida, centrifugados a 12.000 RCF por 1 minuto para remover o líquido residual. A coluna de amostra foi transferida para um novo tubo de coleta e lavada duas vezes. Para a primeira lavagem, adicione 500 µL de tampão de lavagem a cada tubo. Inverta o tubo de 3 a 5 vezes e centrifugue a 12.000 RCF por 1 minuto. Descarte o líquido do tubo de coleta e coloque o cartucho de filtro de volta no mesmo tubo de coleta. Para a segunda lavagem, adicione 500 µL de tampão de lavagem ao filtro sem inverter. As amostras foram centrifugadas a 12.000 RCF por 1 minuto. O filtro foi transferido para um tubo LoBind® de 1,5 mL e adicionados 100 µL de água pré-aquecida livre de nucleases. Os filtros foram incubados à temperatura ambiente por 1 minuto e, em seguida, centrifugados a 12.000 RCF por 1 minuto. O DNA eluído foi armazenado a -80 °C.
A concentração de DNA foi quantificada utilizando um fluorômetro Qubit™ 4.0. O DNA foi preparado utilizando o kit Qubit™ 1X dsDNA High Sensitivity (Cat. nº Q33231) de acordo com as instruções do fabricante. A distribuição do comprimento dos fragmentos de DNA foi medida utilizando um TapeStation Agilent™ 4150 ou 4200. O DNA foi preparado utilizando os reagentes de DNA genômico Agilent™ (Cat. nº 5067-5366) e a fita de triagem de DNA genômico (Cat. nº 5067-5365). A preparação da biblioteca foi realizada utilizando o kit Oxford Nanopore Technologies™ (ONT) Rapid PCR Barcoding (SQK-RPB004) de acordo com as instruções do fabricante. O DNA foi sequenciado utilizando um sequenciador ONT GridION™ Mk1 com uma célula de fluxo Min106D (R 9.4.1). As configurações de sequenciamento foram: chamada de bases de alta precisão, valor q mínimo de 9, configuração de código de barras e remoção de código de barras. As amostras foram sequenciadas por 72 horas, após o que os dados de chamada de bases foram submetidos para processamento e análise adicionais.
O processamento bioinformático foi realizado utilizando métodos previamente descritos (Greenman et al., 2024). Os arquivos FASTQ obtidos do sequenciamento foram divididos em diretórios para cada amostra. Antes da análise bioinformática, os dados foram processados utilizando o seguinte pipeline: primeiro, os arquivos FASTQ das amostras foram mesclados em um único arquivo FASTQ. Em seguida, as leituras com menos de 1000 pb foram filtradas utilizando o Filtlong v. 0.2.1, com o único parâmetro alterado sendo –min_length 1000 (Wick, 2024). Antes de qualquer filtragem adicional, a qualidade das leituras foi verificada utilizando o NanoPlot v. 1.41.3 com os seguintes parâmetros: –fastq –plots dot –N50 -o
Para a classificação taxonômica, as leituras e os contigs montados foram classificados usando o Kraken2 v. 2.1.2 (Wood et al., 2019). Gere relatórios e arquivos de saída para leituras e montagens, respectivamente. Use a opção `--use-names` para analisar leituras e montagens. As opções `--gzip-compressed` e `--paired` são especificadas para segmentos de leitura. A abundância relativa de táxons em metagenomas foi estimada usando o Bracken v. 2.8 (Lu et al., 2017). Primeiro, criamos um banco de dados de k-mers contendo 1000 bases usando o bracken-build com os seguintes parâmetros: `-d`
A anotação de genes e a estimativa de abundância relativa foram realizadas utilizando uma versão modificada do protocolo descrito por Maranga et al. (Maranga et al., 2023). Primeiramente, contigs com menos de 500 pb foram removidos de todas as montagens utilizando o SeqKit v. 2.5.1 (Shen et al., 2016). As montagens selecionadas foram então combinadas em um pan-metagenoma. As regiões de leitura aberta (ORFs) foram identificadas utilizando o Prodigal v. 1.0.1 (uma versão paralela do Prodigal v. 2.6.3) com os seguintes parâmetros: -d
Os genes foram inicialmente agrupados de acordo com os identificadores de ortólogos (KO) da Enciclopédia de Genes e Genomas de Kyoto (KEGG) atribuídos pelo eggNOG para comparar a abundância das vias gênicas. Genes sem deleções ou com múltiplas deleções foram removidos antes da análise. A abundância média de cada KO por amostra foi então calculada e a análise estatística foi realizada. Os genes do metabolismo do PPA foram definidos como qualquer gene que recebeu a linha ko00640 na coluna KEGG_Pathway, indicando uma função no metabolismo do propionato de acordo com o KEGG. Os genes identificados como associados à produção de PPA estão listados na Tabela Suplementar 1 (Reichardt et al., 2014; Yang et al., 2017). Testes de permutação foram realizados para identificar os genes do metabolismo e da produção de PPA que eram significativamente mais abundantes em cada tipo de amostra. Mil permutações foram realizadas para cada gene analisado. Um valor de p de 0,05 foi usado como limite para determinar a significância estatística. Anotações funcionais foram atribuídas a genes individuais dentro de um cluster com base nas anotações de genes representativos dentro do cluster. Táxons associados ao metabolismo e/ou produção de PPA puderam ser identificados pela correspondência dos IDs de contigs nos arquivos de saída do Kraken2 com os mesmos IDs de contigs retidos durante a anotação funcional usando o eggNOG. O teste de significância foi realizado utilizando o teste U de Mann-Whitney, conforme descrito anteriormente. A correção para testes múltiplos foi realizada utilizando o procedimento de Benjamini-Hochberg. Um valor de p ≤ 0,05 foi utilizado como limite para determinar a significância estatística.
A diversidade da microbiota intestinal dos camundongos foi avaliada utilizando o índice de diversidade de Simpson. Não foram observadas diferenças significativas entre as amostras controle e as amostras com PPA em termos de diversidade de gênero e espécie (valor p para gênero: 0,18, valor p para espécie: 0,16) (Figura 1). A composição microbiana foi então comparada utilizando a análise de componentes principais (PCA). A Figura 2 mostra o agrupamento das amostras por seus filos, indicando que houve diferenças na composição de espécies da microbiota entre as amostras com PPA e as amostras controle. Esse agrupamento foi menos pronunciado no nível de gênero, sugerindo que a PPA afeta certas bactérias (Figura Suplementar 1).
Figura 1. Diversidade alfa de gêneros e composição de espécies do microbioma intestinal de camundongos. Gráficos de caixa mostrando os índices de diversidade de Simpson de gêneros (A) e espécies (B) em amostras de PPA e controle. A significância foi determinada pelo teste U de Mann-Whitney e a correção para comparações múltiplas foi realizada pelo procedimento de Benjamini-Hochberg. ns, valor de p não significativo (p>0,05).
Figura 2. Resultados da análise de componentes principais da composição do microbioma intestinal de camundongos em nível de espécie. O gráfico da análise de componentes principais exibe a distribuição das amostras em seus dois primeiros componentes principais. As cores indicam o tipo de amostra: camundongos expostos ao PPA são representados em roxo e camundongos do grupo controle em amarelo. Os componentes principais 1 e 2 são plotados nos eixos x e y, respectivamente, e expressos como a proporção da variância explicada.
Utilizando dados de contagem transformados por RLE, observou-se uma diminuição significativa na mediana da razão Bacteroidetes/Bacilli em camundongos controle e PPA (controle: 9,66, PPA: 3,02; valor de p = 0,0011). Essa diferença foi atribuída à maior abundância de Bacteroidetes em camundongos PPA em comparação com os controles, embora a diferença não tenha sido significativa (média da razão Bacteroidetes/Bacilli no grupo controle: 5,51, média da razão Bacteroidetes/Bacilli no grupo PPA: 6,62; valor de p = 0,054), enquanto a abundância de Bacteroidetes foi semelhante (média da razão Bacteroidetes/Bacilli no grupo controle: 7,76, média da razão Bacteroidetes/Bacilli no grupo PPA: 7,60; valor de p = 0,18).
A análise da abundância de membros taxonômicos do microbioma intestinal revelou que 1 filo e 77 espécies diferiram significativamente entre as amostras de PPA e as amostras de controle (Tabela Suplementar 2). A abundância de 59 espécies nas amostras de PPA foi significativamente maior do que nas amostras de controle, enquanto a abundância de apenas 16 espécies nas amostras de controle foi maior do que nas amostras de PPA (Figura 3).
Figura 3. Abundância diferencial de táxons no microbioma intestinal de camundongos com PPA e controles. Os gráficos de vulcão mostram as diferenças na abundância de gêneros (A) ou espécies (B) entre as amostras de PPA e controle. Os pontos cinza indicam ausência de diferença significativa na abundância de táxons. Os pontos coloridos indicam diferenças significativas na abundância (valor de p ≤ 0,05). Os 20 táxons com as maiores diferenças de abundância entre os tipos de amostra são mostrados em vermelho e azul claro (amostras de controle e PPA, respectivamente). Os pontos amarelos e roxos apresentaram abundância pelo menos 2,7 vezes maior nas amostras de controle ou PPA do que nos controles. Os pontos pretos representam táxons com abundâncias significativamente diferentes, com diferenças médias de CLR entre -1 e 1. Os valores de p foram calculados usando o teste U de Mann-Whitney e corrigidos para testes múltiplos usando o procedimento de Benjamini-Hochberg. As diferenças médias de CLR em negrito indicam diferenças significativas na abundância.
Após analisar a composição da microbiota intestinal, realizamos uma anotação funcional do microbioma. Após filtrar genes de baixa qualidade, um total de 378.355 genes únicos foram identificados em todas as amostras. A abundância transformada desses genes foi utilizada para análise de componentes principais (PCA), e os resultados mostraram um alto grau de agrupamento dos tipos de amostra com base em seus perfis funcionais (Figura 4).
Figura 4. Resultados da PCA utilizando o perfil funcional do microbioma intestinal de camundongos. O gráfico da PCA exibe a distribuição das amostras em seus dois primeiros componentes principais. As cores indicam o tipo de amostra: camundongos expostos ao PPA são representados em roxo e camundongos do grupo controle em amarelo. Os componentes principais 1 e 2 são plotados nos eixos x e y, respectivamente, e expressos como a proporção da variância explicada.
Em seguida, examinamos a abundância de genes nocauteados (knockouts) do KEGG em diferentes tipos de amostra. Um total de 3648 knockouts únicos foram identificados, dos quais 196 foram significativamente mais abundantes em amostras controle e 106 foram mais abundantes em amostras com PPA (Figura 5). Um total de 145 genes foram detectados em amostras controle e 61 genes em amostras com PPA, com abundâncias significativamente diferentes. Vias metabólicas relacionadas ao metabolismo de lipídios e aminoaçúcares foram significativamente mais enriquecidas em amostras com PPA (Tabela Suplementar 3). Vias metabólicas relacionadas ao metabolismo de nitrogênio e sistemas de transferência de enxofre foram significativamente mais enriquecidas em amostras controle (Tabela Suplementar 3). A abundância de genes relacionados ao metabolismo de aminoaçúcares/nucleotídeos (ko:K21279) e ao metabolismo de inositol fosfato (ko:K07291) foi significativamente maior em amostras com PPA (Figura 5). As amostras de controle apresentaram significativamente mais genes relacionados ao metabolismo do benzoato (ko:K22270), ao metabolismo do nitrogênio (ko:K00368) e à glicólise/gliconeogênese (ko:K00131) (Figura 5).
Figura 5. Abundância diferencial de KOs no microbioma intestinal de camundongos PPA e controle. O gráfico de vulcão representa as diferenças na abundância de grupos funcionais (KOs). Os pontos cinza indicam KOs cuja abundância não foi significativamente diferente entre os tipos de amostra (valor p > 0,05). Os pontos coloridos indicam diferenças significativas na abundância (valor p ≤ 0,05). Os 20 KOs com as maiores diferenças de abundância entre os tipos de amostra são mostrados em vermelho e azul claro, correspondendo às amostras controle e PPA, respectivamente. Os pontos amarelos e roxos indicam KOs que foram pelo menos 2,7 vezes mais abundantes nas amostras controle e PPA, respectivamente. Os pontos pretos indicam KOs com abundâncias significativamente diferentes, com diferenças médias de CLR entre -1 e 1. Os valores de p foram calculados usando o teste U de Mann-Whitney e ajustados para comparações múltiplas usando o procedimento de Benjamini-Hochberg. NaN indica que o KO não pertence a uma via metabólica no KEGG. Os valores de diferença média de CLR em negrito indicam diferenças significativas na abundância. Para informações detalhadas sobre as vias metabólicas às quais os KOs listados pertencem, consulte a Tabela Suplementar 3.
Entre os genes anotados, 1601 apresentaram abundâncias significativamente diferentes entre os tipos de amostra (p ≤ 0,05), com cada gene sendo pelo menos 2,7 vezes mais abundante. Desses genes, 4 foram mais abundantes nas amostras controle e 1597 nas amostras com PPA. Como o PPA possui propriedades antimicrobianas, examinamos a abundância de genes relacionados ao metabolismo e à produção de PPA entre os tipos de amostra. Entre os 1332 genes relacionados ao metabolismo do PPA, 27 foram significativamente mais abundantes nas amostras controle e 12 nas amostras com PPA. Entre os 223 genes relacionados à produção de PPA, 1 foi significativamente mais abundante nas amostras com PPA. A Figura 6A demonstra ainda a maior abundância de genes envolvidos no metabolismo do PPA, com abundância significativamente maior nas amostras controle e grandes tamanhos de efeito, enquanto a Figura 6B destaca genes individuais com abundância significativamente maior observada nas amostras com PPA.
Figura 6. Abundância diferencial de genes relacionados ao PPA no microbioma intestinal de camundongos. Os gráficos de vulcão representam as diferenças na abundância de genes associados ao metabolismo do PPA (A) e à produção de PPA (B). Os pontos cinza indicam genes cuja abundância não foi significativamente diferente entre os tipos de amostra (valor p > 0,05). Os pontos coloridos indicam diferenças significativas na abundância (valor p ≤ 0,05). Os 20 genes com as maiores diferenças de abundância são mostrados em vermelho e azul claro (amostras controle e PPA), respectivamente. A abundância dos pontos amarelos e roxos foi pelo menos 2,7 vezes maior nas amostras controle e PPA do que nas amostras controle. Os pontos pretos representam genes com abundâncias significativamente diferentes, com diferenças médias de CLR entre -1 e 1. Os valores de p foram calculados usando o teste U de Mann-Whitney e corrigidos para comparações múltiplas usando o procedimento de Benjamini-Hochberg. Os genes correspondem a genes representativos no catálogo de genes não redundantes. Os nomes dos genes consistem no símbolo KEGG que denota um gene KO. As diferenças em negrito nos valores médios de CLR indicam abundâncias significativamente diferentes. Um traço (-) indica que não há símbolo para o gene no banco de dados KEGG.
Os táxons com genes relacionados ao metabolismo e/ou produção de PPA foram identificados pela correspondência entre a identidade taxonômica dos contigs e o ID do contig do gene. No nível de gênero, 130 gêneros apresentaram genes relacionados ao metabolismo de PPA e 61 gêneros apresentaram genes relacionados à produção de PPA (Tabela Suplementar 4). No entanto, nenhum gênero apresentou diferenças significativas na abundância (p > 0,05).
Em nível de espécie, 144 espécies bacterianas apresentaram genes associados ao metabolismo do PPA e 68 espécies bacterianas apresentaram genes associados à produção de PPA (Tabela Suplementar 5). Entre os metabolizadores de PPA, oito bactérias apresentaram aumentos significativos na abundância entre os tipos de amostra, e todas apresentaram alterações significativas no efeito (Tabela Suplementar 6). Todos os metabolizadores de PPA identificados com diferenças significativas na abundância foram mais abundantes nas amostras de PPA. A classificação em nível de espécie revelou representantes de gêneros que não diferiram significativamente entre os tipos de amostra, incluindo várias espécies de Bacteroides e Ruminococcus, bem como Duncania dubois, Myxobacterium enterica, Monococcus pectinolyticus e Alcaligenes polymorpha. Entre as bactérias produtoras de PPA, quatro bactérias apresentaram diferenças significativas na abundância entre os tipos de amostra. As espécies com diferenças significativas na abundância incluíram Bacteroides novorossi, Duncania dubois, Myxobacterium enteritidis e Ruminococcus bovis.
Neste estudo, examinamos os efeitos da exposição ao PPA na microbiota intestinal de camundongos. O PPA pode desencadear diferentes respostas nas bactérias, pois é produzido por certas espécies, utilizado como fonte de alimento por outras ou possui efeitos antimicrobianos. Portanto, sua adição ao ambiente intestinal por meio de suplementação alimentar pode ter efeitos diferentes, dependendo da tolerância, da suscetibilidade e da capacidade de utilizá-lo como fonte de nutrientes. Espécies bacterianas sensíveis podem ser eliminadas e substituídas por aquelas mais resistentes ao PPA ou capazes de utilizá-lo como fonte de alimento, levando a alterações na composição da microbiota intestinal. Nossos resultados revelaram diferenças significativas na composição microbiana, mas nenhum efeito na diversidade microbiana geral. Os maiores efeitos foram observados no nível de espécie, com mais de 70 táxons com abundância significativamente diferente entre as amostras expostas ao PPA e as amostras controle (Tabela Suplementar 2). Uma avaliação mais aprofundada da composição das amostras expostas ao PPA revelou maior heterogeneidade de espécies microbianas em comparação com as amostras não expostas, sugerindo que o PPA pode melhorar as características de crescimento bacteriano e limitar as populações bacterianas que podem sobreviver em ambientes ricos em PPA. Assim, o PPA pode induzir mudanças seletivas em vez de causar uma perturbação generalizada da diversidade da microbiota intestinal.
Conservantes alimentares como o PPA já demonstraram alterar a abundância de componentes da microbiota intestinal sem afetar a diversidade geral (Nagpal et al., 2021). Neste estudo, observamos diferenças marcantes entre as espécies de Bacteroidetes dentro do filo Bacteroidetes (anteriormente conhecido como Bacteroidetes), que apresentaram enriquecimento significativo em camundongos expostos ao PPA. O aumento da abundância de espécies de Bacteroides está associado ao aumento da degradação do muco, o que pode aumentar o risco de infecção e promover inflamação (Cornick et al., 2015; Desai et al., 2016; Penzol et al., 2019). Um estudo constatou que camundongos machos neonatos tratados com Bacteroides fragilis exibiram comportamentos sociais que lembram o transtorno do espectro autista (TEA) (Carmel et al., 2023), e outros estudos demonstraram que espécies de Bacteroides podem alterar a atividade imunológica e levar à cardiomiopatia inflamatória autoimune (Gil-Cruz et al., 2019). Espécies pertencentes aos gêneros Ruminococcus, Prevotella e Parabacteroides também apresentaram aumento significativo em camundongos expostos ao PPA (Coretti et al., 2018). Certas espécies de Ruminococcus estão associadas a doenças como a doença de Crohn, por meio da produção de citocinas pró-inflamatórias (Henke et al., 2019), enquanto espécies de Prevotella, como Prevotella humani, estão associadas a doenças metabólicas como hipertensão e resistência à insulina (Pedersen et al., 2016; Li et al., 2017). Por fim, observamos que a proporção de Bacteroidetes (anteriormente conhecidos como Firmicutes) em relação a Bacteroidetes foi significativamente menor em camundongos expostos ao PPA do que em camundongos do grupo controle, devido a uma maior abundância total de espécies de Bacteroidetes. Esta proporção já foi demonstrada como um importante indicador da homeostase intestinal, e distúrbios nessa proporção foram associados a vários estados patológicos (Turpin et al., 2016; Takezawa et al., 2021; An et al., 2023), incluindo doenças inflamatórias intestinais (Stojanov et al., 2020). Coletivamente, as espécies do filo Bacteroidetes parecem ser as mais afetadas pela elevação do PPA dietético. Isso pode ser devido a uma maior tolerância ao PPA ou à capacidade de utilizá-lo como fonte de energia, o que já foi comprovado para pelo menos uma espécie, Hoylesella enocea (Hitch et al., 2022). Alternativamente, a exposição materna ao PPA pode promover o desenvolvimento fetal, tornando o intestino da prole de camundongos mais suscetível à colonização por Bacteroidetes; no entanto, o desenho do nosso estudo não permitiu tal avaliação.
A avaliação do conteúdo metagenômico revelou diferenças significativas na abundância de genes associados ao metabolismo e à produção de PPA. Camundongos expostos ao PPA apresentaram maior abundância de genes responsáveis pela produção de PPA, enquanto camundongos não expostos ao PPA apresentaram maior abundância de genes responsáveis pelo metabolismo de PAA (Figura 6). Esses resultados sugerem que o efeito do PPA na composição microbiana pode não ser devido exclusivamente ao seu uso; caso contrário, a abundância de genes associados ao metabolismo do PPA deveria ter sido maior no microbioma intestinal de camundongos expostos ao PPA. Uma explicação possível é que o PPA influencia a abundância bacteriana principalmente por meio de seus efeitos antimicrobianos, e não por meio de seu uso pelas bactérias como nutriente. Estudos anteriores demonstraram que o PPA inibe o crescimento de Salmonella Typhimurium de maneira dose-dependente (Jacobson et al., 2018). A exposição a concentrações mais elevadas de PPA pode selecionar bactérias resistentes às suas propriedades antimicrobianas e que podem não ser capazes de metabolizá-lo ou produzi-lo. Por exemplo, várias espécies de Parabacteroides apresentaram abundância significativamente maior nas amostras de PPA, mas nenhum gene relacionado ao metabolismo ou à produção de PPA foi detectado (Tabelas Suplementares 2, 4 e 5). Além disso, a produção de PPA como subproduto da fermentação é amplamente distribuída entre diversas bactérias (Gonzalez-Garcia et al., 2017). A maior diversidade bacteriana pode ser a razão para a maior abundância de genes relacionados ao metabolismo de PPA nas amostras de controle (Averina et al., 2020). Ademais, apenas 27 (2,14%) dos 1332 genes foram previstos como genes associados exclusivamente ao metabolismo de PPA. Muitos genes associados ao metabolismo de PPA também estão envolvidos em outras vias metabólicas. Isso demonstra ainda que a abundância de genes envolvidos no metabolismo de PPA foi maior nas amostras de controle; esses genes podem funcionar em vias que não resultam na utilização ou formação de PPA como subproduto. Nesse caso, apenas um gene associado à geração de PPA apresentou diferenças significativas na abundância entre os tipos de amostra. Em contraste com os genes associados ao metabolismo do PPA, os genes marcadores para a produção de PPA foram selecionados por estarem diretamente envolvidos na via bacteriana de produção de PPA. Em camundongos expostos ao PPA, todas as espécies apresentaram aumento significativo na abundância e na capacidade de produzir PPA. Isso corrobora a previsão de que os PPAs selecionariam os produtores de PPA e, portanto, preveriam um aumento na capacidade de produção de PPA. No entanto, a abundância de genes não se correlaciona necessariamente com a expressão gênica; assim, embora a abundância de genes associados ao metabolismo do PPA seja maior nas amostras de controle, a taxa de expressão pode ser diferente (Shi et al., 2014). Para confirmar a relação entre a prevalência de genes produtores de PPA e a produção de PPA, são necessários estudos da expressão de genes envolvidos na produção de PPA.
A anotação funcional dos metagenomas de PPA e controle revelou algumas diferenças. A análise de componentes principais (PCA) do conteúdo gênico revelou agrupamentos distintos entre as amostras de PPA e controle (Figura 5). O agrupamento dentro de cada amostra revelou que o conteúdo gênico do grupo controle era mais diverso, enquanto as amostras de PPA se agruparam. O agrupamento por conteúdo gênico foi comparável ao agrupamento por composição de espécies. Assim, as diferenças na abundância de vias metabólicas são consistentes com as mudanças na abundância de espécies e cepas específicas dentro delas. Nas amostras de PPA, duas vias com abundância significativamente maior estavam relacionadas ao metabolismo de aminoaçúcares/nucleotídeos (ko:K21279) e a múltiplas vias do metabolismo lipídico (ko:K00647, ko:K03801; Tabela Suplementar 3). Os genes associados a ko:K21279 são conhecidos por estarem associados ao gênero Bacteroides, um dos gêneros com um número significativamente maior de espécies nas amostras de PPA. Essa enzima pode evadir a resposta imune por meio da expressão de polissacarídeos capsulares (Wang et al., 2008). Isso pode explicar o aumento de Bacteroidetes observado em camundongos expostos ao PPA. Tal achado complementa o aumento da síntese de ácidos graxos observado no microbioma de camundongos expostos ao PPA. As bactérias utilizam a via FASIIko:K00647 (fabB) para produzir ácidos graxos, o que pode influenciar as vias metabólicas do hospedeiro (Yao e Rock, 2015; Johnson et al., 2020), e alterações no metabolismo lipídico podem desempenhar um papel no neurodesenvolvimento (Yu et al., 2020). Outra via que apresentou aumento de abundância nas amostras de camundongos expostos ao PPA foi a biossíntese de hormônios esteroides (ko:K12343). Há evidências crescentes de que existe uma relação inversa entre a capacidade da microbiota intestinal de influenciar os níveis hormonais e de ser influenciada por hormônios, de modo que níveis elevados de esteroides podem ter consequências para a saúde (Tetel et al., 2018).
Este estudo apresenta algumas limitações e considerações. Uma distinção importante é que não realizamos avaliações fisiológicas nos animais. Portanto, não é possível concluir diretamente se as alterações no microbioma estão associadas a alguma doença. Outra consideração é que os camundongos deste estudo receberam a mesma dieta que suas mães. Estudos futuros poderão determinar se a transição de uma dieta rica em PPA para uma dieta isenta de PPA melhora seus efeitos sobre o microbioma. Uma limitação do nosso estudo, assim como de muitos outros, é o tamanho reduzido da amostra. Embora seja possível extrair conclusões válidas, uma amostra maior proporcionaria maior poder estatístico na análise dos resultados. Também somos cautelosos ao tirar conclusões sobre uma associação entre alterações no microbioma intestinal e qualquer doença (Yap et al., 2021). Fatores de confusão, incluindo idade, sexo e dieta, podem influenciar significativamente a composição dos microrganismos. Esses fatores podem explicar as inconsistências observadas na literatura em relação à associação do microbioma intestinal com doenças complexas (Johnson et al., 2019; Lagod e Naser, 2023). Por exemplo, membros do gênero Bacteroidetes demonstraram estar aumentados ou diminuídos em animais e humanos com TEA (Angelis et al., 2013; Kushak et al., 2017). Da mesma forma, estudos da composição intestinal em pacientes com doenças inflamatórias intestinais encontraram tanto aumentos quanto diminuições nos mesmos táxons (Walters et al., 2014; Forbes et al., 2018; Upadhyay et al., 2023). Para limitar o impacto do viés de gênero, buscamos garantir a representação igualitária dos sexos, de modo que as diferenças fossem provavelmente impulsionadas pela dieta. Um desafio da anotação funcional é a remoção de sequências gênicas redundantes. Nosso método de agrupamento de genes requer 95% de identidade de sequência e 85% de similaridade de comprimento, bem como 90% de cobertura de alinhamento para eliminar agrupamentos falsos. No entanto, em alguns casos, observamos COGs com as mesmas anotações (por exemplo, MUT) (Fig. 6). São necessários estudos adicionais para determinar se esses ortólogos são distintos, associados a gêneros específicos ou se isso representa uma limitação da abordagem de agrupamento de genes. Outra limitação da anotação funcional é a potencial classificação incorreta; o gene bacteriano mmdA é uma enzima conhecida envolvida na síntese de propionato, mas o KEGG não o associa à via metabólica do propionato. Em contraste, os ortólogos scpB e mmcD são relacionados. O grande número de genes sem deleções designadas pode resultar na incapacidade de identificar genes relacionados à PPA ao avaliar a abundância gênica. Estudos futuros se beneficiarão da análise do metatranscriptoma, que pode proporcionar uma compreensão mais profunda das características funcionais da microbiota intestinal e vincular a expressão gênica a potenciais efeitos subsequentes. Para estudos envolvendo distúrbios específicos do neurodesenvolvimento ou doenças inflamatórias intestinais, são necessárias avaliações fisiológicas e comportamentais em animais para relacionar as alterações na composição do microbioma a esses distúrbios. Estudos adicionais transplantando o microbioma intestinal para camundongos livres de germes também seriam úteis para determinar se o microbioma é um fator determinante ou uma característica da doença.
Em resumo, demonstramos que o PPA dietético atua como um fator na alteração da composição da microbiota intestinal. O PPA é um conservante aprovado pelo FDA, amplamente encontrado em diversos alimentos, que, após exposição prolongada, pode levar à disrupção da flora intestinal normal. Observamos alterações na abundância de várias bactérias, sugerindo que o PPA pode influenciar a composição da microbiota intestinal. Alterações na microbiota podem levar a mudanças nos níveis de certas vias metabólicas, o que pode resultar em alterações fisiológicas relevantes para a saúde do hospedeiro. Estudos adicionais são necessários para determinar se os efeitos do PPA dietético na composição microbiana podem levar à disbiose ou outras doenças. Este estudo estabelece as bases para futuras pesquisas sobre como os efeitos do PPA na composição intestinal podem impactar a saúde humana.
Os conjuntos de dados apresentados neste estudo estão disponíveis em repositórios online. O nome do repositório e o número de acesso são: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, PRJNA1092431.
Este estudo com animais foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade da Flórida Central (UCF-IACUC) (Número da Permissão de Uso de Animais: PROTO202000002). Este estudo está em conformidade com as leis, regulamentos e requisitos institucionais locais.
NG: Conceitualização, Curadoria de dados, Análise formal, Investigação, Metodologia, Software, Visualização, Redação (rascunho original), Redação (revisão e edição). LA: Conceitualização, Curadoria de dados, Metodologia, Recursos, Redação (revisão e edição). SH: Análise formal, Software, Redação (revisão e edição). SA: Investigação, Redação (revisão e edição). Juiz-chefe: Investigação, Redação (revisão e edição). SN: Conceitualização, Administração do projeto, Recursos, Supervisão, Redação (revisão e edição). TA: Conceitualização, Administração do projeto, Supervisão, Redação (revisão e edição).
Os autores declararam que não receberam nenhum apoio financeiro para a pesquisa, autoria e/ou publicação deste artigo.
Os autores declaram que a pesquisa foi conduzida na ausência de quaisquer relações comerciais ou financeiras que possam ser interpretadas como um potencial conflito de interesses. Não aplicável.
Todas as opiniões expressas neste artigo são exclusivamente dos autores e não refletem necessariamente as opiniões de suas instituições, editoras, editores ou revisores. Quaisquer produtos avaliados neste artigo, ou quaisquer alegações feitas por seus fabricantes, não são garantidos ou endossados pela editora.
O material suplementar deste artigo pode ser encontrado online: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/frmbi.2024.1451735/full#supplementary-material
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Data da publicação: 18/04/2025