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Ao contrário dos vertebrados, acredita-se que os insetos não possuam hormônios esteroides sexuais com expressão predominantemente masculina. Em Anopheles gambiae, o esteroide ecdisona 20-hidroxiecdisona (20E) parece ter evoluído para controlar o desenvolvimento dos ovos quando sintetizado pelas fêmeas² e para induzir um período refratário ao acasalamento quando transferido sexualmente pelos machos³. Como o desenvolvimento dos ovos e o acasalamento são características reprodutivas essenciais, compreender como as fêmeas do mosquito Anopheles integram esses sinais hormonais pode facilitar o desenvolvimento de novos programas de controle da malária. Aqui, revelamos que essas funções reprodutivas são reguladas por diferentes esteroides sexuais por meio de uma complexa rede de enzimas ativadoras/inativadoras de ecdisteroides. Identificamos uma ecdisona oxidada específica do sexo masculino, a 3-deidro-20E (3D20E), que protege a paternidade ao suprimir a receptividade sexual feminina após a transferência sexual e a ativação por desfosforilação. Notavelmente, a transferência de 3D20E também induziu a expressão de genes reprodutivos que mantêm o desenvolvimento dos ovos durante a infecção por Plasmodium, garantindo a saúde dos indivíduos infectados. A 20E derivada das fêmeas não desencadeia uma resposta sexual, mas permite que os indivíduos em acasalamento depositem ovos após a inibição das quinases inibidoras da 20E. A identificação desse hormônio esteroide específico do macho e seu papel na regulação da receptividade sexual feminina, fertilidade e interação com o Plasmodium sugerem o potencial para reduzir o sucesso reprodutivo dos mosquitos transmissores da malária.
Os casos e mortes por malária estão aumentando novamente⁴ devido à resistência generalizada aos inseticidas em mosquitos Anopheles, o único vetor dos parasitas da malária humana. A biologia reprodutiva desses mosquitos é um alvo particularmente atraente para novas intervenções de controle da malária, porque as fêmeas acasalam apenas uma vez⁵; tornar esse único acasalamento estéril teria grande potencial para reduzir as populações de mosquitos no campo.
As mulheres tornam-se sexualmente incapacitadas após receberem altas doses de hormônios esteroides dos homens. Estudos demonstraram que o gatilho para a dificuldade em acasalar novamente é o 20-hidroxiecdisona (20E), um hormônio esteroide mais conhecido como regulador do ciclo de muda na fase larval. A capacidade dos machos de sintetizar e transferir 20E evoluiu especificamente em espécies de Anopheles que fazem parte do subgênero Cellia7, distribuído na África e que inclui os vetores mais perigosos da malária, como o Anopheles gambiae. Isso é especialmente relevante porque, nessas espécies, as fêmeas também produzem 20E após cada refeição de sangue, e o 20E impulsiona o ciclo da ovogênese (ver ref. 8). No entanto, pouco se sabe sobre como as fêmeas integram os sinais de duas fontes diferentes de ecdisona (transferência masculina e indução da alimentação sanguínea) sem comprometer sua própria capacidade de acasalar. De fato, se o 20E produzido pelas fêmeas desencadear intolerância sexual, isso levará à infertilidade em indivíduos que se alimentam de fêmeas virgens. um comportamento muito comum nesses mosquitos5.
Uma possível explicação é que os machos de A. gambiae transferem uma ecdisona modificada específica do sexo masculino, que ativa uma cascata de sinalização no trato reprodutivo feminino, resultando em instabilidade de acasalamento. No entanto, embora os vertebrados possuam múltiplos hormônios esteroides, como estrogênio e androgênio (revisado na ref. 9), até onde sabemos, esteroides com viés androgênico não foram identificados em insetos.
Nosso objetivo foi determinar o repertório de hormônios esteroides na glândula acessória masculina (GAM) de A. gambiae sexualmente maduros, em busca de possíveis esteroides modificadores. Utilizando cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas em tandem (HPLC-MS/MS), em vez do método menos específico usado anteriormente, detectamos ecdisona (E) e 20E nesse tecido, confirmando resultados anteriores. No entanto, a amostra foi dominada por esteroides fosforilados oxidados, consistentes com a fórmula 3-desidro-20E-22-fosfato (3D20E22P)¹² (Figura 1). Outras formas incluem 3-desidro-20E (3D20E) e 20E-22-fosfato (20E22P). A intensidade do sinal de HPLC-MS/MS de 3D20E22P foi duas ordens de magnitude maior que a de sua forma desfosforilada, 3D20E, e três ordens de magnitude maior que a de E e 20E (Figura 1). Embora em outras partes do corpo e no trato reprodutivo inferior (TRI; Figura Suplementar 1a). Também analisamos ecdisteroides em machos e fêmeas recém-fechados (<1 dia de idade) e detectamos 3D20E e 3D20E22P apenas no MAG; E, 20E e 20E22P estavam presentes em ambos os sexos (Figura Suplementar 1b). Esses dados sugerem que machos adultos de A. gambiae produzem altos níveis de hormônios modificadores em seus MAGs que não são sintetizados pelas fêmeas.
O trato reprodutivo masculino (TRM) e feminino (incluindo átrios, vesículas seminais e parovário) foi dissecado de machos virgens de 4 dias de idade e de fêmeas virgens e acasaladas (0,5, 3 e 12 horas após o acasalamento). A ecdisona nesses tecidos foi analisada por HPLC-MS/MS (média ± erro padrão da média; teste t não pareado, bicaudal, com correção da taxa de falsos positivos (FDR); NS, não significativo; *P < 0,05, **P < 0,01). 3D20E: 3 horas vs. 0,5 horas, P = 0,035; 12 horas vs. 3 horas, P = 0,0015; 12 horas vs. 0,5 horas, P = 0,030. 3D20E22P: 3 horas vs. 0,5 horas, P = 0,25; 12 horas vs. 3 horas, P = 0,0015. = 0,0032; 12 horas vs. 0,5 horas, P = 0,015). Os dados são provenientes de três réplicas biológicas. A área do pico para cada ecdisona de interesse foi calculada e normalizada pelo número de mosquitos. A ecdisona é representada por cores da seguinte forma: E, verde; 20E, laranja; 20E22P, roxo; 3D20E, azul; 3D20E22P, rosa. O gráfico inserido aumenta a escala no eixo y para mostrar níveis mais baixos de ecdisona.
Para investigar se 3D20E22P e 3D20E são transferidos durante o acasalamento, dissecamos os tratos linfáticos laterais (TLL) de fêmeas em vários momentos após o acasalamento. Embora a ecdisona não tenha sido encontrada em fêmeas virgens, observamos quantidades substanciais de 3D20E22P no TLL imediatamente após o acasalamento (0,5 h pós-acasalamento, hpm), diminuindo ao longo do tempo, enquanto os níveis de 3D20E aumentaram significativamente (Fig. 1). Usando 3D20E sintetizado quimicamente como padrão, determinamos que os níveis desse hormônio esteroide nos TLLs durante o acasalamento eram pelo menos 100 vezes maiores que os de 20E (Tabela de Dados Estendidos 1). Assim, 3D20E22P é a principal ecdisona masculina transferida para o TLL feminino durante o acasalamento, e sua forma desfosforilada, 3D20E, torna-se altamente abundante logo após o acasalamento. Isso sugere um papel importante para esta última ecdisona na biologia feminina pós-acasalamento.
Após gerar um novo conjunto de dados de sequenciamento de RNA (RNA-seq) (Fig. 2a), utilizando um pipeline de bioinformática personalizado, buscamos genes para a ecdisona quinase (EcK), a ecdisona oxidase (EO) e a fosfatase modificada por 20E que codifica a ecdisona. A EPP é expressa em tecidos reprodutivos. Identificamos um gene candidato para EPP e dois genes potenciais para EcK (EcK1 e EcK2), mas não conseguimos encontrar um bom gene candidato para EO. Notavelmente, os genes individuais de EPP foram expressos em altos níveis (percentil 98,9) em MAGs gambianos, mas não em LRTs femininos (Fig. 2b), contrariando nossas expectativas, visto que a desfosforilação de 3D20E22P ocorreu nesse tecido feminino. Portanto, acreditamos que a EPP masculina pode ser transferida durante o acasalamento. De fato, utilizamos marcação isotópica estável in vivo para mascarar a proteína feminina após o acasalamento, uma enzima identificada por espectrometria de massas no átrio feminino. (Fig. 2c e Tabela Suplementar 1). A presença de EPP em MAG e LRT de fêmeas acasaladas (mas não virgens) também foi confirmada usando anticorpos específicos (Fig. 2d).
a, Um pipeline bioinformático personalizado para buscar genes que codificam EcKs, EOs e EPPs nos tecidos reprodutivos de cada sexo. Os números ao lado das setas indicam o número de candidatos masculinos e femininos em cada etapa. Esta análise identificou um gene EPP (EPP) e um gene EcK (EcK1) que são expressos em machos, e um gene EcK (EcK2) que é expresso em ambos os sexos, mas não produz um gene EO candidato. b, Mapa de calor comparando a expressão de genes candidatos em tecidos de Anopheles gambiae e Anopheles albicans virgens (V) e em acasalamento (M). Spca, fertilização; MAGs, glândulas acessórias em machos; outras partes do corpo, incluindo mamas, asas, pernas, corpos adiposos e órgãos internos em ambos os sexos, e ovários em fêmeas. EcK2 é altamente expresso tanto no MAG quanto nos átrios de Gambia, enquanto EPP é encontrado apenas no MAG. c, Análise proteômica da translocação do grupo de ejaculado masculino para os átrios femininos em 3, 12 e 24 hpm, mostrando as 67 proteínas mais abundantes. As fêmeas foram criadas com uma dieta contendo 15N para marcar (e mascarar) todas as proteínas. Machos não marcados foram acasalados com fêmeas marcadas, e os LRTs femininos foram dissecados em 3, 12 e 24 hpm para análise proteômica (consulte a Tabela Suplementar 1 para uma lista completa das proteínas ejaculatórias). Inserção: EPP, Eck1 e EcK2 foram detectados no MAG de machos virgens por análise proteômica desses tecidos. d, EPP foi detectado por Western blot no MAG e no LRT de fêmeas acasaladas, mas não em fêmeas virgens ou machos ou o restante do corpo da fêmea. As membranas foram sondadas simultaneamente com anticorpos anti-actina (controle de carregamento) e anti-EPP. Todos os machos são virgens. Consulte a Figura Suplementar 1 para obter os dados de origem do gel. Os Western blots foram realizados duas vezes com resultados semelhantes.
A atividade da fosfofosfatase de ecdisteroide do EPP foi verificada após incubação por HPLC-MS/MS com 3D20E22P isolado de MAG (Figura Suplementar 2a). Além disso, quando silenciamos o EPP por interferência mediada por RNA (RNAi), detectamos uma forte redução na atividade da fosfatase nos tecidos reprodutivos desses machos (Figura 3a), e as fêmeas acasaladas com machos com EPP silenciado apresentaram uma proporção significativamente menor de 3D20E desfosforilado (Figura 3b), apesar do silenciamento parcial do gene (Figura Suplementar 2b,c). Em contraste, não detectamos alterações significativas na razão 20E22P/20E nos mesmos mosquitos, o que pode sugerir que a enzima é específica para 3D20E22P (Figura 3b).
a, Diminuição da atividade da fosfatase em MAG causada pelo silenciamento de EPP usando RNA de EPP de fita dupla (dsEPP) ou RNA de GFP de fita dupla (dsGFP) como controles. Vinte pools de MAG foram usados ​​em cada réplica (P = 0,0046, teste t pareado, bicaudal), representados por pontos separados. b, Fêmeas acasaladas com machos com EPP silenciado apresentaram uma proporção significativamente menor de 3D20E desfosforilado em 3 hpm (P = 0,0043, teste t não pareado, bicaudal), enquanto os níveis de 20E não foram afetados (P = 0,063, não pareado). teste t, bicaudal). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) de três grupos de 13, 16 e 19 fêmeas cada. c, Fêmeas acasaladas com machos com EPP silenciado apresentaram taxas significativamente maiores de re-acasalamento (P = 0,0002, teste exato de Fisher, bicaudal). As fêmeas foram primeiro forçadas a acasalar para garantir seu status de acasalamento; Dois dias depois, eles foram contatados com outros machos portadores de esperma transgênico para avaliar as taxas de re-acasalamento por meio da detecção quantitativa do transgene por PCR. Fêmeas alimentadas com sangue e acasaladas com machos com o gene EPP silenciado apresentaram fertilidade significativamente reduzida (P < 0,0001; teste de Mann-Whitney, bicaudal) e número de ovos ligeiramente reduzido (P = 0,088, teste de Mann-Whitney, bicaudal), enquanto a taxa de desova não foi afetada (P = 0,94, teste exato de Fisher, bicaudal). Em todos os painéis, n representa o número de amostras de mosquitos biologicamente independentes. NS, não significativo. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Em seguida, avaliamos se a desfosforilação da ecdisona é importante para induzir resistência ao acasalamento em fêmeas. Notavelmente, fêmeas acasaladas com machos com deficiência de EPP acasalaram novamente com uma frequência muito maior (44,9%) do que fêmeas controle (10,4%) quando expostas a machos adicionais (transgênicos) (Fig. 3c). Também observamos uma diminuição significativa na fertilidade (Fig. 3d, esquerda) e uma leve diminuição no número de ovos postos por essas fêmeas (Fig. 3d, centro), enquanto a porcentagem de ovos postos pelas fêmeas (outra resposta desencadeada pelo acasalamento) não foi afetada (Fig. 3d, direita). Dada a especificidade observada do EPP para 3D20E22P, esses resultados sugerem que a ativação de 3D20E pelo EPP transferido durante o acasalamento pode ter um papel importante em interromper a receptividade feminina a novos acasalamentos, um comportamento anteriormente atribuído à transferência sexual de 20E. Portanto, esse hormônio específico do macho também afeta fortemente a receptividade. fertilidade feminina.
Em seguida, comparamos as atividades do 20E e do 3D20E em experimentos de injeção em virgens sexualmente maduras usando 3D20E sintetizado quimicamente (Fig. 4a–c) e 20E disponível comercialmente. Observamos que o 3D20E foi significativamente mais eficaz do que o 20E em bloquear a sensibilidade feminina ao acasalamento em ambas as concentrações (Fig. 4d). Notavelmente, metade do nível fisiológico de 3D20E no LRT (1.066 pg pós-injeção vs. 2.022 pg pós-acasalamento) induziu uma proporção de fêmeas refratárias 20 vezes maior do que o nível fisiológico de 20E (361 pg pós-injeção) 24 horas após a injeção na concentração mais alta de 18 pg pós-acasalamento; (Tabela de Dados Estendidos 1). Este resultado é consistente com a noção de que a transferência sexual de 20E não causa períodos refratários ao acasalamento e aponta ainda para o 3D20E como um fator importante na garantia da relação entre pais e filhos. O 3D20E também foi significativamente mais ativo do que o 20E em ensaios de postura de ovos em fêmeas virgens (Fig. 4e), sugerindo que a taxa normal de postura de ovos que observamos após o silenciamento parcial do EPP se deve à presença de atividade residual de 3D20E ainda produzida por fatores femininos induzidos pelo acasalamento.
(a,b) 3D20E sintetizado quimicamente a partir de 20E (a) com conversão/eficiência muito alta (dados apresentados como média ± erro padrão da média de três reações de síntese independentes) (b).c, O espectro de massa (metade inferior) corresponde exatamente à ecdisona encontrada no trato reprodutivo inferior (LRT) de fêmeas acasaladas (metade superior).d, Comparado com 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; teste exato de Fisher, bicaudal) e etanol a 10% (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; teste exato de Fisher, bicaudal), enquanto 20E foi significativamente maior que o controle apenas em doses mais altas (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Teste exato de Fisher, bicaudal).e, a injeção de 3D20E induziu taxas de desova significativamente maiores em fêmeas virgens do que os controles com 10% de etanol (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; teste exato de Fisher, bicaudal), enquanto 20E, em comparação com os controles, apresentou diferença significativa apenas em doses mais altas (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; teste exato de Fisher, bicaudal). 3D20E induziu taxas de desova significativamente maiores do que 20E em doses mais altas (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; teste exato de Fisher, bicaudal). Em todos os painéis, n representa o número de amostras de mosquitos biologicamente independentes. NS, não significativo. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Os dados são provenientes de três repetições.
Em estudos anteriores, determinamos que a transferência sexual de hormônios esteroides induz a expressão de MISO (Estimulador da Oogênese Induzido pelo Acasalamento 11), um gene reprodutivo feminino que protege as fêmeas de A. gambiae da infecção por P. falciparum, o parasita da malária humana mais letal. Dada a importância do MISO para o sucesso reprodutivo do Anopheles em áreas endêmicas de malária, decidimos determinar qual hormônio, 3D20E ou 20E, desencadeia a expressão desse gene. Descobrimos que, enquanto a injeção de 20E induziu especificamente ou mais potentemente alguns receptores de hormônios nucleares (RH), como HR3 e HR4, e alvos esteroides típicos a jusante, como os genes vitelogênicos Vg14, 15 e 16, o MISO foi induzido mais fortemente por 3D20E (Figura Suplementar 3). Assim, a transferência sexual desse hormônio esteroide androgênico parece induzir mecanismos que protegem as fêmeas dos custos impostos pelo parasita. Além disso, o 3D20E afeta diferencialmente ambas as isoformas do receptor EcR, induzindo o EcR-A e reprimindo o EcR-B, e ativando mais fortemente outros genes indutores do acasalamento, incluindo o HPX15, que afeta a fertilidade feminina. Isso poderia explicar a infertilidade significativa observada em fêmeas acasaladas com machos com EPP silenciado (Figura Suplementar 3). Esses dados sugerem a existência de vias de sinalização a jusante, preferencialmente ativadas por dois hormônios ecdisona, que podem estar na base da função específica do sexo.
Em seguida, testamos a função dos dois genes EcK identificados em nosso pipeline de bioinformática. O silenciamento de EcK1 ou EcK2 resultou em mortalidade significativa em machos (Figura Suplementar 4a), sugerindo que a fosforilação da ecdisona, e consequentemente sua inativação, é importante para a sobrevivência. Como EcK2 foi expresso em níveis mais altos que EcK1 e foi detectado em MAGs por proteômica (Figura 2b,c e Tabela Suplementar 2), validamos sua atividade de ecdisteroide quinase incubando-o com 20E, o que resultou na fosforilação de 20E22P (Figura Suplementar 2b). Ao usar 3D20E como substrato, não conseguimos detectar o produto fosforilado 3D20E22P (Figura Suplementar 4c), sugerindo que 20E, em vez de 3D20E, pode ser o alvo preferencial de EcK2.
De acordo com nossa análise de RNA-seq, EcK2 também apresentou alta expressão no trato reprodutivo inferior (LRT) de fêmeas virgens, sendo sua expressão reduzida após o acasalamento (Fig. 2b). Confirmamos esses dados e determinamos que a expressão de EcK2 não foi afetada pela alimentação sanguínea (Fig. Suplementar 5a). Ampliando nossos experimentos iniciais de espectrometria de massas (MS), determinamos que o pico de 20E22P estava intimamente relacionado ao pico de 20E (22-26 horas após a alimentação sanguínea; Fig. Suplementar 5b). O silenciamento de EcK2 em fêmeas virgens resultou em um aumento de 3 vezes na proporção relativa de 20E para 20E22P 26 horas após a alimentação sanguínea (Figs. Suplementares 2c e 5c), confirmando que EcK2 também fosforila 20E em fêmeas. Notavelmente, as fêmeas virgens com depleção de EcK2 mantiveram a receptividade sexual completa (Fig. Suplementar 5d,e), sugerindo ainda que a produção feminina de 20E não é afetada pela alimentação sanguínea. induzem períodos refratários ao acasalamento. No entanto, essas fêmeas apresentaram taxas de postura de ovos significativamente maiores em comparação com os controles, com mais de 30% das virgens pondo ovos (Figura Suplementar 5f). Se injeções de RNA de fita dupla de Eck2 (dsEcK2) fossem realizadas após a alimentação sanguínea, a desova não ocorria, momento em que o pico de 20E devido à ingestão de sangue já havia diminuído. No geral, esses resultados apoiam um modelo no qual o 20E produzido após a sucção sanguínea pode induzir a desova, mas somente quando o bloqueio da desova (EcK2 e possivelmente outros fatores) é desativado pelo acasalamento. Nem as injeções de 20E nem as de 3D20E inibiram a expressão de EcK2 em virgens (Figura Suplementar 5g), sugerindo que outros fatores medeiam a inibição dessa quinase. Entretanto, os níveis de 20E após a alimentação sanguínea não foram suficientes para induzir desconforto ao acasalamento, mas foram efetivamente desencadeados por altos títulos de 3D20E transferido sexualmente.
Nossos resultados fornecem informações importantes sobre os mecanismos que regulam o sucesso reprodutivo de A. gambiae. Um modelo emergiu no qual os machos evoluíram para sintetizar altos níveis de 3D20E, uma ecdisona modificada específica do sexo masculino que garante a paternidade ao dessensibilizar as fêmeas para acasalamentos subsequentes. Ao mesmo tempo, esses vetores da malária também desenvolveram um sistema eficiente para ativar o 3D20E nas fêmeas em resposta à transferência sexual do EPP específico do sexo masculino. Até onde sabemos, este é o primeiro exemplo de um sistema hormonal esteroide dominado por machos e fêmeas desempenhando uma função única e crítica em insetos. A função da ecdisona específica do sexo masculino foi postulada, mas não demonstrada definitivamente. Por exemplo, uma hipótese amplamente refutada¹⁸ é que essas funções podem ser desempenhadas pelo precursor E1 do 20E. É bem conhecido que, em Drosophila, a monogamia é desencadeada pela transferência sexual de pequenos peptídeos sexuais¹⁹,²⁰ que interagem com os neurônios que inervam o trato reprodutivo feminino por meio de receptores específicos de peptídeos sexuais²¹,²². Além disso, É necessário realizar estudos para determinar as cascatas de sinalização subsequentes controladas por 3D20E em fêmeas de A. gambiae e para verificar se essas cascatas podem ser conservadas entre mosquitos e Drosophila.
Considerando o importante papel do 3D20E na fertilidade e no comportamento feminino identificado em nosso estudo, as vias que levam à síntese e ativação do 3D20E oferecem novas oportunidades para futuras estratégias de controle de mosquitos, como a geração de machos estéreis competitivos em estratégias de tecnologia de insetos estéreis para uso em liberação na natureza ou para imitar o 3D20E em brincadeiras de virgindade. A função específica do 3D20E em machos pode ter evoluído quando A. gambiae e outras espécies de Cellia adquiriram a capacidade de coagular seu sêmen em tampões copulatórios, pois isso permite a transferência eficiente de um grande número de hormônios e enzimas ativadoras de hormônios. Por sua vez, a evolução do 3D20E implementando a monogamia fornece um mecanismo para as fêmeas (através da alta expressão de MISO) favorecerem seu sucesso reprodutivo em áreas de alta prevalência de malária, o que contribui indiretamente para a transmissão do Plasmodium. Dado que o 20E feminino demonstrou ter efeitos profundos na sobrevivência e no crescimento do P. falciparum em mosquitos Anopheles fêmeas,24 as vias de hormônios esteroides, tanto masculinas quanto femininas, são agora aspectos-chave do Interações mosquito-parasita.
As linhagens de A. gambiae G3 foram criadas em condições padrão para insetos (26-28 °C, 65-80% de umidade relativa, fotoperíodo de 12:12 h claro/escuro). As larvas foram alimentadas com ração em pó para peixes (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets e Tetra Pond Sticks na proporção de 7:7:2). Os mosquitos adultos foram alimentados ad libitum com solução de dextrose a 10% e semanalmente com sangue humano (componentes sanguíneos do estudo). Mosquitos virgens foram obtidos pela separação dos sexos no estágio pupal, após exame das extremidades por microscopia. Machos portadores do transgene DsRed já foram descritos anteriormente.
Experimentos de acasalamento forçado foram realizados de acordo com protocolos previamente descritos. Para o acasalamento natural, fêmeas virgens de 4 dias de idade foram mantidas em uma proporção de 1:3 com machos virgens sexualmente maduros por duas noites. Para os experimentos em que os machos receberam injeções de dsEPP, o confinamento coincidiu com os dias 3 e 4 após a injeção, quando a atividade da fosfatase estava maximamente silenciada (Figura Suplementar 2b).
Tecidos de mosquitos, cadáveres restantes (resto do corpo) ou o corpo inteiro foram dissecados em metanol a 100% e homogeneizados com um homogeneizador de esferas (esferas de vidro de 2 mm, 2.400 rpm, 90 segundos). As quantidades de tecido e os volumes de metanol foram os seguintes: resto do corpo, 50 em 1.000 µl; MAG, 50–100 em 80 µl; LRT feminino, 25–50 em 80 µl. O precipitado foi submetido a uma segunda extração com metanol, utilizando o mesmo volume. Os detritos celulares foram removidos por centrifugação. O metanol de ambas as extrações foi combinado e seco sob fluxo de nitrogênio, sendo então ressuspenso nos seguintes volumes de metanol a 80% em água: resto do corpo, 50 µl; MAGs e LRT feminino, 30 µl.
As amostras foram analisadas em um espectrômetro de massas (ID-X, Thermo Fisher) acoplado a um sistema de cromatografia líquida (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl da amostra foram injetados em uma coluna de 3 µm, 100 × 4,6 mm (Inspire C8, Dikma) mantida a 25 °C. As fases móveis para a cromatografia líquida foram A (água, 0,1% de ácido fórmico) e B (acetonitrila, 0,1% de ácido fórmico). O gradiente da cromatografia líquida foi o seguinte: 5% de B por 1 minuto, aumentando para 100% de B ao longo de 11 minutos. Após 8 minutos a 100%, a coluna foi reequilibrada a 5% de B por 4 minutos. A vazão foi de 0,3 ml min⁻¹. A ionização na fonte de espectrometria de massas foi realizada por ionização por eletrospray aquecido nos modos positivo e negativo.
O espectrômetro de massas mede dados na faixa m/z de 350 a 680 com resolução de 60.000 no modo MS completo. Os dados de MS/MS foram adquiridos em [M + H]+ (todos os alvos), [M - H2O + H]+ (todos os alvos) e [M - H]- (alvos fosforilados). Os dados de MS/MS foram usados ​​para confirmar as propriedades da ecdisona dos alvos para os quais não havia padrão disponível. Para identificar ecdisteroides não-alvo, os dados de MS/MS para todos os picos de HPLC com abundância relativa >15% foram analisados. A quantificação foi realizada usando curvas padrão criadas a partir de padrões puros (20E, 3D20E) para calcular as quantidades absolutas ou diluições de uma amostra específica (todos os outros alvos) para calcular sua equivalência às quantidades encontradas em um indivíduo do sexo masculino. Para 3D20E, a quantificação foi realizada usando a soma dos seguintes adutos: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Os dados foram extraídos e quantificados usando o Tracefinder (versão 4.1). Os dados de MS/MS foram analisados ​​usando o Xcalibur (versão 4.4). Os espectros de MS de E, 20E e 3D20E foram comparados aos respectivos padrões. O 3D20E22P foi analisado por derivatização com o reagente de Girard. O 20E22P foi analisado pela razão m/z.
O composto 3D20E22P foi purificado a partir de MAG. A purificação foi realizada em escala analítica utilizando um cromatógrafo líquido de ultra-alta eficiência (UHPLC, Acquity, Waters) com um detector de massa quadrupolar (QDa, Acquity, Waters) sob as mesmas condições de LC da análise por HPLC-MS/MS. A coleta da fração foi iniciada quando o m/z correspondente a 3D20E22P foi detectado no mesmo tempo de retenção previamente determinado. A pureza dos compostos extraídos foi então verificada por HPLC-MS/MS, conforme descrito acima.
O RNA total foi extraído de 10 a 12 tecidos reprodutivos ou outras partes do corpo (sem cabeça) usando o reagente TRI (Thermo Fisher), seguindo as instruções do fabricante. O RNA foi tratado com TURBO DNase (Thermo Fisher). O cDNA foi sintetizado usando a transcriptase reversa do vírus da leucemia murina de Moloney (M-MLV RT; Thermo Fisher), seguindo as instruções do fabricante. Os primers para RT-qPCR (Tabela de Dados Estendidos 2) foram previamente publicados²⁴ ou projetados usando o Primer-BLAST²⁶, com preferência para produtos de 70 a 150 pb que abrangem junções éxon-éxon ou primers que separam éxons. Amostras de cDNA de três a quatro réplicas biológicas foram diluídas quatro vezes em água para RT-qPCR. A quantificação foi realizada em reações replicadas de 15 µl contendo 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), primers e 5 µl de cDNA diluído. cDNA. As reações foram realizadas em um sistema de PCR em tempo real QuantStudio 6 Pro (Thermo Fisher) e os dados foram coletados e analisados ​​usando Design and Analysis (versão 2.4.3). Como demonstrado neste estudo, as quantidades relativas foram normalizadas para o gene ribossômico RpL19 (AGAP004422), cuja expressão não mudou significativamente com a alimentação sanguínea 27 ou acasalamento 3 .
A qualidade do RNA foi verificada usando um Bioanalyzer 2100 da Agilent. Bibliotecas de sequenciamento pareado da Illumina foram preparadas e executadas no Broad Institute do MIT e Harvard. As sequências de leitura foram alinhadas ao genoma de A. gambiae (cepa PEST, versão 4.12) usando o HISAT2 (versão 2.0.5) com parâmetros padrão. Sequências com pontuação de qualidade de mapeamento (MAPQ) <30 foram removidas usando o Samtools (versão 1.3.1). O número de sequências mapeadas para genes foi contabilizado usando o htseq-count (versão 0.9.1) com parâmetros padrão. As contagens de sequências normalizadas foram calculadas e a expressão gênica diferencial foi analisada usando o pacote DESeq2 (versão 1.28.1) no R (versão 4.0.3).
Os genes candidatos a modificadores de ecdisona foram identificados inicialmente por meio de uma busca no genoma de A. gambiae utilizando o algoritmo PSI-BLAST (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), com os parâmetros padrão e as seguintes sequências de proteínas de consulta: de Bombyx mori (Número de Acesso NP_001038956.1), Musca domestica (Números de Acesso XP_005182020.1, XP_005175332.1 e XP_011294434.1) e Microplitis demolitor (Números de Acesso XP_008552646.1 e XP_008552645.1), EcK de B. mori (Número de Acesso NP_001036900) e Drosophila melanogaster (Número de Acesso NP_651202). Apis mellifera (Número de Acesso XP_394838) e Acyrthosiphon pisum (Número de Acesso XP_001947166); e EPP de B. mori (Número de Acesso XP_001947166) NP_001177919.1 e NP_001243996.1) e EO de D. melanogaster (Número de Acesso NP_572986.1) (etapa 1). Em seguida, filtre os resultados com base na alta expressão de mRNA (>100 fragmentos/quilobase de exons por milhão de leituras mapeadas (FPKM) ou >85%) em tecido reprodutivo (LRT feminino ou MAG) na Gâmbia (etapa 2). Para melhorar a especificidade, selecionamos enzimas candidatas que também são expressas no tecido reprodutivo de A. albimanus, uma espécie de anopheles que não sintetiza nem transfere ecdisona durante o acasalamento. Os genes candidatos foram filtrados com base na baixa expressão (<100 FPKM ou <85º percentil) no tecido reprodutivo de A. albimanus (etapa 3). Como filtro final (etapa 4), os genes candidatos precisam satisfazer pelo menos um dos seguintes critérios: (1) superexpressão significativa após o acasalamento (P < 0,05) de acordo com a análise de genes diferencialmente expressos e (2) em tecidos não reprodutivos (< 85% ou <100 FPKM).
Modificamos métodos previamente descritos 28,29,30 para obter a marcação isotópica do organismo inteiro. Resumidamente, a levedura Saccharomyces cerevisiae tipo II (YSC2, Sigma) do tipo selvagem foi testada em meio de cultura com base de nitrogênio para levedura (BD Difco, DF0335) contendo (p/v) 2% de glicose (G7528, Sigma), 1,7% de sulfato de amônio livre de aminoácidos e 5% de sulfato de amônio 15N (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) como única fonte de nitrogênio. A levedura foi recuperada por centrifugação e as larvas de mosquito foram alimentadas ad libitum até a pupação. Foi adicionado suplemento de farinha de peixe (0,5 mg por 300 larvas) para prevenir a mortalidade no quarto instar. Somente fêmeas foram então utilizadas em experimentos de acasalamento com machos não marcados para analisar o proteoma masculino transferido durante o acasalamento.
Fêmeas virgens marcadas com 15N, com 4 a 6 dias de idade, foram forçadas a acasalar com machos virgens não marcados da mesma idade. O acasalamento bem-sucedido foi verificado pela detecção de tampões copulatórios sob microscopia de epifluorescência. Às 3, 12 e 24 horas após o acasalamento (hpm), os átrios de 45 a 55 fêmeas acasaladas foram dissecados em 50 µl de tampão de bicarbonato de amônio (pH 7,8) e homogeneizados com um pistilo. O homogeneizado foi centrifugado e o sobrenadante misturado com 50 µl de RapiGest 0,1% (186001860, Waters) em bicarbonato de amônio 50 mM. O sobrenadante e o sedimento de cada amostra foram congelados instantaneamente em gelo seco e enviados durante a noite para o laboratório MacCoss na Universidade de Washington, onde a preparação da amostra para LC-MS/MS foi concluída. O sedimento foi ressuspendido em 50 µl de tampão de bicarbonato de amônio 0,1%. RapiGest foi homogeneizado em bicarbonato de amônio 50 mM e sonicado em banho-maria. A concentração proteica do precipitado e do sobrenadante foi determinada pelo ensaio BCA. As amostras foram reduzidas com ditiotreitol (DTT; Sigma) 5 mM, alquiladas com iodoacetamida 15 mM (Sigma) e incubadas a 37 °C (1:0:50) por 1 hora com tripsinização (razão tripsina:substrato). O RapiGest foi lisado pela adição de HCl 200 mM, seguida de incubação a 37 °C por 45 minutos e centrifugação a 14.000 rpm por 10 minutos a 4 °C para remoção de detritos. As amostras foram lavadas por extração em fase sólida de modo duplo (cartuchos Oasis MCX, Waters) e ressuspensas em ácido fórmico 0,1% para uma concentração proteica final de 0,33 µg. µl-1. Os proteomas MAG não marcados foram analisados ​​de forma semelhante em machos virgens. Duas réplicas analíticas foram analisadas para cada amostra. Em seguida, 1 µg de cada amostra foi analisado usando uma coluna de sílica fundida de 25 cm com partículas de 75 µm, com uma armadilha de sílica fundida Kasil1 (PQ) de 4 cm preenchida com resina de fase reversa Jupiter C12 (Phenomenex) e cromatografia líquida de 180 minutos. Digestão das amostras – A MS/MS foi realizada em um espectrômetro de massas Q-Exactive HF (Thermo Fisher) com um sistema nanoACQUITY UPLC (Waters). Os dados de aquisição gerados para cada execução foram convertidos para o formato mzML usando o Proteowizard (versão 3.0.20287) e o Comet31 (versão 3.2) contra o banco de dados FASTA contendo sequências de proteínas de Anopheles gambiae (VectorBase versão 54), Anopheles coluzzi. Uma busca foi realizada no Mali-NIH (VectorBase versão 54), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, março de 2021), RNA-seq de A. gambiae e traduções em três quadros de leitura de contaminantes humanos conhecidos. As taxas de falsos positivos (FDRs) correspondentes ao mapa de peptídeos foram determinadas usando o Percolator32 (versão 3.05) com um limiar de 0,01, e os peptídeos foram agrupados em identificações de proteínas usando parcimônia de proteínas no Limelight33 (versão 2.2.0). A abundância de proteínas foi estimada usando o fator de abundância espectral normalizado (NSAF) calculado para cada proteína em cada análise, conforme descrito anteriormente. O NSAF relativo a cada proteína foi calculado pela média das amostras de duas réplicas biológicas diferentes. A marcação com 15N mascarou com sucesso o proteoma feminino, embora uma pequena quantidade de proteína não marcada pudesse ser detectada nas fêmeas virgens marcadas. Registramos a detecção de redução de proteínas masculinas (1-5 espectros) em amostras brutas femininas apenas em análises técnicas, nas quais as amostras brutas foram analisadas após as amostras masculinas/de acasalamento, como resultado do efeito de "contaminação residual" da HPLC. As proteínas encontradas ocasionalmente como "contaminantes" nas fêmeas virgens marcadas estão listadas na Tabela Suplementar 1.
Dois peptídeos antigênicos, QTTDRVAPAPDQQQ (dentro do isótipo PA) e MESDGTTPSGDSEQ (dentro dos isótipos PA e PB) da Genscript, foram combinados, conjugados à proteína carreadora KLH e injetados em coelhos da raça Nova Zelândia. Os coelhos foram sacrificados após a quarta injeção, e a IgG total foi isolada por purificação por afinidade. A IgG do coelho mais específico para EPP foi utilizada para posterior análise por Western blotting.
Para os Western blots, foram utilizados MAG (n = 10, onde n representa o número de amostras de mosquitos biologicamente independentes) e LRT de fêmeas (n = 30) de machos virgens de 4 dias e fêmeas virgens ou forçadas a acasalar (<10 dias pós-acasalamento). O tampão de extração de proteínas (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% desoxicolato de sódio; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× coquetel inibidor de proteases (Roche)) foi adicionado separadamente. As amostras foram homogeneizadas imediatamente após a dissecção com um homogeneizador de esferas (esferas de vidro de 2 mm, 2.400 rpm, 90 segundos). Os detritos insolúveis foram removidos por centrifugação a 20.000 g a 4 °C. As proteínas foram quantificadas pelo ensaio de Bradford (Bio-Rad). Em seguida, 20 µg de proteína MAG, 40 µg de proteína LRT e 20 µg de proteína residual foram desnaturados e separados por eletroforese em gel de poliacrilamida com 10% de Bis-Tris usando tampão MOPS. As proteínas foram transferidas para membranas de fluoreto de polivinilideno usando o sistema de transferência iBlot2 (Thermo Fisher). As membranas foram lavadas duas vezes em PBS-T 1× (0,1% de Tween-20 em PBS) e, em seguida, bloqueadas em tampão de bloqueio Odyssey (Li-Cor) por 1 hora a 22 °C. As membranas foram incubadas sob agitação durante a noite a 4 °C com anticorpo primário policlonal anti-EPP de coelho (1:700 em tampão de bloqueio) e anticorpo primário monoclonal anti-actina de rato MAC237 (Abeam; 1:4.000). As membranas foram lavadas com PBS-T e, em seguida, incubadas com anticorpos secundários (anti-coelho de burro 800CW e anti-rato de cabra 680LT (Li-Cor), ambos 1:20.000) em tampão de bloqueio contendo As membranas foram incubadas com 0,01% de SDS e 0,2% de Tween-20 por 1 hora a 22 °C. Em seguida, foram lavadas com PBS-T e as imagens foram obtidas com um scanner Odyssey CLx. As imagens foram coletadas e processadas no Image Studio (versão 5.2). Não foi detectada nenhuma banda específica correspondente à isoforma EPP-RA (82 kDa).
As regiões codificadoras de EPP (como isoforma AGAP002463-RB contendo domínio de fosfatase de histidina, busca de domínio conservado NCBI 34) e EcK2 (AGAP002181) foram clonadas no plasmídeo pET-21a(+) (Novagen Millipore Sigma); Os primers estão listados na Tabela de Dados Estendidos 2. Oito ligantes GS4 (em tandem) foram inseridos antes da sequência 6xHis C-terminal do construto pET-21a(+)-EcK2. As proteínas recombinantes foram produzidas utilizando a reação de síntese de proteínas em E. coli livre de células NEBExpress (New England BioLabs). As proteínas recombinantes foram purificadas utilizando colunas de centrifugação NEBExpress Ni (New England BioLabs). A proteína controle diidrofolato redutase (DHFR) foi produzida utilizando DNA molde do kit de síntese de proteínas em E. coli livre de células NEBExpress. As proteínas foram armazenadas em glicerol a 50% em PBS a -20 °C por até 3 meses.
A atividade da fosfatase do EPP e dos extratos de tecido foi medida utilizando 4-nitrofenil fosfato (pNPP; Sigma-Aldrich). O tampão de reação continha 25 mM Tris, 50 mM ácido acético, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA e 1 mM DTT. O tecido foi homogeneizado no tampão de reação e os detritos celulares foram removidos por centrifugação. A reação foi iniciada adicionando-se a enzima ou o extrato de tecido ao tampão de reação contendo 2,5 mg ml⁻¹ de pNPP. A mistura de reação foi incubada à temperatura ambiente no escuro, e a quantidade de pNP convertida a partir do pNPP foi quantificada medindo-se a absorbância a 405 nm em diferentes intervalos de tempo.
Para a atividade da EcK in vitro, a proteína foi incubada com 0,2 mg de 20E ou 3D20E em 200 µl de tampão (pH 7,5) contendo 10 mM de HEPES-NaOH, 0,1% de BSA, 2 mM de ATP e 10 mM de MgCl₂ por 2 h a 27 °C. A reação foi interrompida pela adição de 800 µl de metanol, resfriada a -20 °C por 1 hora e centrifugada a 20.000 g por 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi então analisado por HPLC-MS/MS. Para inativar as proteínas utilizadas no grupo controle por meio de incubação térmica, as proteínas foram incubadas em 50% de glicerol em PBS por 20 min a 95 °C.
Para a atividade EPP in vitro, a proteína foi incubada com 3D20E22P (equivalente à quantidade encontrada em 18 pares de MAG, purificados por HPLC-MS/MS) em 100 µl de tampão (pH 7,5) contendo 25 mM Tris, 50 mM ácido acético, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA e 1 mM DTT por 3 horas a 27 °C. A reação foi interrompida pela adição de 400 µl de metanol e resfriada a -20 °C por 1 hora, sendo então centrifugada a 20.000 g por 10 minutos a 4 °C. O sobrenadante foi analisado por HPLC-MS/MS.
Fragmentos de PCR para EPP (362 pb), EcK1 (AGAP004574, 365 pb) e EcK2 (556 pb) foram amplificados a partir de cDNA preparado de cadáveres de mosquitos sem cabeça de ambos os sexos. O fragmento de PCR do controle eGFP (495 pb) foi amplificado a partir do pCR2.1-eGFP descrito anteriormente; As sequências dos primers de PCR estão listadas na Tabela de Dados Estendidos 2. O fragmento de PCR foi inserido entre os promotores T7 invertidos no plasmídeo pL4440. Os plasmídeos foram obtidos de células competentes de E. coli NEB 5-α (New England Biolabs) e verificados por sequenciamento de DNA antes do uso (consulte os Dados Suplementares 1 para a sequência do inserto). Primers correspondentes ao promotor T7 (Tabela de Dados Estendidos 2) foram usados ​​para amplificar o inserto a partir do plasmídeo baseado em pL4440. O tamanho do produto de PCR foi confirmado por eletroforese em gel de agarose. O dsRNA foi transcrito a partir dos moldes de PCR usando o kit de transcrição Megascript T7 (Thermo Fisher) e purificado de acordo com as instruções do fabricante, com as modificações descritas anteriormente.
Para a injeção de dsRNA, 1.380 ng de dsRNA (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) foram injetados a uma concentração de 10 ng nl-1 no tórax de machos ou fêmeas adultos (Nanoject III, Drummond) dentro de 1 dia após a eclosão. Os níveis de silenciamento gênico foram determinados em pelo menos três réplicas biológicas por extração de RNA, síntese de cDNA e RT-qPCR. Para a injeção de ecdisona, fêmeas virgens de 4 ou 6 dias de idade, alimentadas com sangue, receberam injeções de 0,13, 0,21 ou 0,63 µg de 20E ou 3D20E (Nanoject III, Drummond) em concentrações de 1,3, 2,1, respectivamente, dependendo do delineamento experimental, ou 6,3 ng nl-1. Injetar 100 nl de 10% (v/v) etanol em água; 100 nl de 3D20E22P em etanol a 10% (equivalente a 75% da quantidade encontrada em um par de MAGs). Os mosquitos foram aleatoriamente designados para o grupo de injeção.
Para os ensaios de desova, fêmeas com 3 dias de idade foram alimentadas ad libitum com sangue humano. Mosquitos parcialmente alimentados ou não alimentados foram removidos. Dependendo do tratamento, as fêmeas foram colocadas em recipientes de desova separados por quatro noites, pelo menos 48 horas após a alimentação sanguínea. Os ovos foram contados sob um estereomicroscópio (Stemi 508, Zeiss); para fêmeas acasaladas, os ovos que eclodiram em larvas foram considerados férteis.
Para os testes de acasalamento, as fêmeas tiveram pelo menos 2 dias, dependendo do tratamento, para desenvolver resistência ao acasalamento, e machos selvagens da mesma idade foram subsequentemente introduzidos na mesma gaiola. Duas noites depois, as vesículas fertilizadas das fêmeas foram dissecadas e o DNA genômico foi liberado por congelamento-descongelamento e sonicação em um tampão contendo 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA e 25 mM NaCl (pH 8,2). As amostras foram incubadas com Proteinase K (0,86 µg µl-1) por 15 minutos a 55 °C, seguidos por 10 minutos a 95 °C. As preparações de DNA genômico bruto foram diluídas 10 vezes e submetidas à detecção por qPCR das sequências do cromossomo Y; os primers estão listados na Tabela de Dados Estendidos 2. A ausência da sequência do cromossomo Y indica que não houve acasalamento.
Para os ensaios de re-acasalamento, as fêmeas forçadas a acasalamento foram examinadas quanto à presença de tampões copulatórios para confirmar o estado de acasalamento e deixadas por 2 dias para desenvolverem refratariedade ao acasalamento na ausência de machos, conforme descrito anteriormente 36 . Machos portadores de espermatozoides transgênicos DsRed foram então introduzidos nas gaiolas das fêmeas. Duas noites depois, as vesículas de fertilização foram dissecadas das fêmeas e o DNA genômico foi preparado conforme descrito acima e submetido à detecção por qPCR do transgene DsRed; os primers estão listados na Tabela de Dados Estendidos 2. A ausência do transgene DsRed indicou que não ocorreu re-acasalamento.
O 3D20E foi sintetizado conforme descrito anteriormente³⁷. Resumidamente, 10 mg de 20E (Sigma-Aldrich) foram dissolvidos em 10 mL de água, seguidos da adição de 30 mg de platina negra (em pó, Sigma-Aldrich). Um fluxo suave de O₂ foi borbulhado continuamente na mistura reacional, que foi agitada à temperatura ambiente. Após 6 horas, 30 mL de metanol foram adicionados para interromper a reação. A mistura foi centrifugada para remover as partículas do catalisador. O sobrenadante foi evaporado até a secura sob vácuo à temperatura ambiente. O produto da reação seco foi dissolvido em uma solução de 10% de etanol e metanol para injeção em análise por HPLC-MS/MS. A taxa de conversão (de 20E para 3D20E) foi de aproximadamente 97% (Fig. 4b), e o espectro de massas do 3D20E sintetizado correspondeu ao encontrado em fêmeas acasaladas (Fig. 4c).
A legenda contém detalhes específicos dos testes estatísticos realizados. O GraphPad (versão 9.0) foi utilizado para realizar o teste exato de Fisher, o teste de Mantel-Cox e o teste t de Student. Os testes de Cochran-Mantel-Haenszel foram realizados utilizando um script personalizado em R (disponível em https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). A distribuição dos dados foi testada quanto à normalidade utilizando o teste de Shapiro-Wilk com um limiar de significância de 0,05. Quando os dados não passaram no teste de normalidade, o teste de Mann-Whitney foi realizado. Os dados de sobrevida foram analisados ​​utilizando o teste de Mantel-Cox. O pacote DESeq2 (versão 1.28.1) foi utilizado para realizar a análise de expressão diferencial em nível gênico por RNA-seq. A barra horizontal no gráfico representa a mediana. Um valor de significância de P = 0,05 foi utilizado como limiar para todos os testes.
Para obter mais informações sobre o desenho do estudo, consulte o resumo do relatório de pesquisa da Nature Research Report, cujo link está disponível neste artigo.
Os dados proteômicos de MS foram depositados no ProteomeXchange Consortium (http://proteomecentral.proteomexchange.org) através do PRIDE Partner Repository (https://www.ebi.ac.uk/pride/) com o identificador de conjunto de dados PXD032157.
O conjunto de dados de RNA-seq está depositado na Gene Expression Comprehensive Library (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) sob o registro serial GSE198665.
Conjuntos de dados adicionais gerados e/ou analisados ​​durante o presente estudo podem ser obtidos junto aos autores correspondentes mediante solicitação razoável. Este artigo fornece os dados de origem.
De Loof, A. Ecdisteroides: esteroides sexuais de insetos negligenciados? Macho: Caixa Preta. Ciência dos Insetos. 13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroxiecdisona e desenvolvimento ovariano em Anopheles stephens. J. Insect Physiology. 28, 97–109 (1982).