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Os grânulos Ban-Lan-Gen atenuam a colite crônica recidivante induzida por sulfato de dextrano sódico em camundongos, modulando a microbiota intestinal e restaurando a produção intestinal de GLP-1 derivado de ácidos graxos de cadeia curta.
Jiao Peng,1-3,*Li Xi,4,*Zheng Lin,3,5 Duan Lifang,1 Gao Zhengxian,2,5 Diehu,1 Li Jie,6 Li Xiaofeng,6 Shen Xiangchun,5 Xiao Haitao21Departamento de Farmácia do Hospital Universitário de Shenzhen da Universidade de Pequim, Shenzhen, República Popular da China; 2Escola de Farmácia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade de Shenzhen, Shenzhen, República Popular da China; 3Centro de Pesquisa em Tecnologia de Engenharia de Medicina Étnica e Desenvolvimento e Aplicação da Medicina Tradicional Chinesa da Universidade Médica de Guizhou, Ministério da Educação, Laboratório-Chave Provincial de Farmácia de Guizhou, Universidade Médica de Guizhou, Guiyang, República Popular da China; 4Departamento de Gastroenterologia, Hospital Universitário de Shenzhen da Universidade de Pequim, Shenzhen, República Popular da China; 5Escola de Farmácia, Universidade Médica de Guizhou, Laboratório-Chave Estadual de Função e Aplicação de Plantas Medicinais, Guiyang; 6 Departamento de Medicina Laboratorial, Hospital da Universidade de Pequim em Shenzhen, Shenzhen, China [email protected] Shen Xiangchun, Faculdade de Farmácia, Universidade Médica de Guizhou, Guizhou, República Popular da China, 550004, E-mail [email protected] Objetivo: A terapia baseada em GLP-1 é uma nova opção de tratamento para doenças inflamatórias intestinais. Os grânulos de Ban-Lan-Gen (BLG) são uma formulação antiviral conhecida da Medicina Tradicional Chinesa (MTC) que apresenta potencial atividade anti-inflamatória no tratamento de diversas condições inflamatórias. No entanto, seu efeito anti-inflamatório na colite e seu mecanismo de ação ainda não estão claros. MÉTODOS: Para induzir colite crônica recidivante por sulfato de dextrano sódico (DSS) em camundongos, foram utilizados índices de atividade da doença, marcadores histológicos de lesão e níveis de citocinas pró-inflamatórias para avaliar o efeito protetor do BLG. Os efeitos do BLG na microbiota intestinal e no intestino foram caracterizados pelos níveis séricos de GLP-1 e pela expressão de Gcg, GPR41 e GRP43 no cólon. Composição da microbiota intestinal, níveis de AGCC fecais e liberação de GLP-1 de células epiteliais colônicas primárias de camundongos. Produção de GLP-1 derivada de AGCC. Resultados: O tratamento com BLG reduziu significativamente a perda de peso corporal, o DAI, o encurtamento do cólon, os danos ao tecido colônico e os níveis de citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-1β e IL-6 no tecido colônico. Além disso, o tratamento com BLG restaurou significativamente a expressão de Gcg, GPR41 e GRP43 no cólon e os níveis séricos de GLP-1 em camundongos com colite, aumentando bactérias produtoras de AGCC, como Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001, e reduzindo a abundância de bactérias como Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas e Oscillibacter. Ademais, o tratamento com BLG aumentou significativamente o nível de AGCC nas fezes de camundongos com colite. Ao mesmo tempo, experimentos in vitro também mostraram que o extrato fecal de camundongos tratados com BLG pode estimular significativamente a secreção de GLP-1 por pequenas células epiteliais colônicas murinas primárias. Conclusões: Esses achados sugerem que o BLG possui efeito anti-colite. O BLG tem potencial para ser desenvolvido como terapia, pelo menos em parte, pela modulação da microbiota intestinal e restauração da produção intestinal de GLP-1 derivado de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), representando um fármaco promissor para colite crônica recidivante. Palavras-chave: colite, grânulos Ban-Lan-Gen, microbiota intestinal, ácidos graxos de cadeia curta, GLP-1
A colite ulcerativa (CU) é uma doença inflamatória crônica do cólon e do reto, caracterizada por diarreia recorrente, dor abdominal, perda de peso e fezes mucopurulentas com sangue.¹ Recentemente, a prevalência de CU tem aumentado em países anteriormente com baixa incidência, incluindo a China, devido à crescente popularidade do estilo de vida ocidental.² Esse aumento representa um grande problema para a saúde pública e tem sérias implicações para a capacidade de trabalho e a qualidade de vida dos pacientes. Notavelmente, a patogênese da CU permanece em grande parte desconhecida, mas é geralmente aceito que fatores genéticos, ambientais, a microbiota intestinal e o sistema imunológico contribuem para o desenvolvimento da CU.³ Mesmo agora, não há cura para a CU, e o objetivo do tratamento é controlar os sintomas clínicos, induzir e manter a remissão, promover a cicatrização da mucosa e reduzir a recorrência. Os tratamentos clássicos incluem aminosalicilatos, corticosteroides, imunossupressores e biológicos. No entanto, esses medicamentos não conseguem atingir o efeito desejado devido aos seus diversos efeitos colaterais.⁴ Recentemente, muitos estudos de caso têm demonstrado que A medicina tradicional chinesa (MTC) tem demonstrado grande potencial no alívio da colite ulcerativa com baixa toxicidade, sugerindo que o desenvolvimento de novas terapias de MTC é uma estratégia de tratamento promissora para a colite ulcerativa.5-7
Os Grânulos de Banlangen (BLG) são uma preparação da medicina tradicional chinesa feita a partir do extrato aquoso da raiz de Banlangen.8 Além de sua eficácia antiviral, o BLG apresenta potencial atividade anti-inflamatória no tratamento de diversas condições inflamatórias.9,10 Adicionalmente, glucosinolatos (R,S-goitrina, progoitrina, epiprorubina e glicosídeo foram isolados e identificados a partir de extratos aquosos de Radix isatidis) e nucleosídeos (hipoxantina, adenosina, uridina e guanosina) e alcaloides índigo, como o índigo e a indirubina.11,12 Estudos anteriores documentaram que os compostos adenosina, uridina e indirubina exibem potentes efeitos anti-colite em diferentes modelos animais de colite.13-17 No entanto, nenhum estudo baseado em evidências foi conduzido para avaliar a eficácia do BLG na colite. No presente estudo, investigamos o efeito protetor do BLG na colite crônica recidivante induzida por sulfato de dextrano sódico (DSS). Em camundongos C57BL/6, observou-se que a administração oral de BLG atenuou significativamente a inflamação crônica recidivante do cólon induzida por DSS nesses animais. A inflamação e seus mecanismos regulatórios estão associados à modulação da microbiota intestinal e à restauração da produção do peptídeo semelhante ao glucagon-1 (GLP-1) derivado do intestino.
Grânulos de BLG (sem açúcar, aprovados pela NMPA Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Pequim, China; número do lote: 20110966) foram adquiridos em farmácias. DSS (peso molecular: 36.000–50.000 Daltons) foi adquirido da MP Biologicals (Santa Ana, EUA). Sulfassalazina (SASP) (pureza ≥ 98%), hematoxilina e eosina foram adquiridas da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Kits de ensaio ELISA Luminex para TNF-α, IL-1β e IL-6 de camundongo foram adquiridos da R&D Systems (Minneapolis, MN, EUA). Ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico foram adquiridos da Aladdin Industries (Xangai, China). Ácido 2-etilbutírico foi adquirido da Merck KGaA. (Darmstadt, Alemanha).
Camundongos machos C57BL/6 de 6 a 8 semanas de idade (peso corporal de 18 a 22 g) foram adquiridos da Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pequim, China) e mantidos em um ambiente com temperatura de 22 ± 2 °C e ciclo claro/escuro de 12 horas. Os camundongos receberam uma dieta padrão para roedores com livre acesso à água potável durante uma semana para se aclimatarem ao novo ambiente. Em seguida, os camundongos foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: grupo controle, grupo modelo DSS, grupo tratado com SASP (200 mg/kg, via oral) e grupo tratado com BLG (1 g/kg, via oral). Como mostrado na Figura 1A, de acordo com nosso estudo anterior, a colite crônica recidivante experimental foi induzida em camundongos por três ciclos de 1,8% de DSS por 5 dias, seguidos por água destilada por 7 dias.¹⁸ Os camundongos dos grupos tratados com SASP e BLG receberam SASP e BLG, respectivamente, diariamente a partir do dia 0. De acordo com experimentos preliminares, a dose de BLG foi definida em 1 g/kg. Enquanto isso, a dose de SASP foi definida em 200 mg/kg, de acordo com a literatura.4 Os grupos controle e modelo DSS receberam o mesmo volume de água durante todo o experimento.
Figura 1. BLG atenua a colite crônica recidivante induzida por DSS em camundongos. (A) Desenho experimental da colite crônica recorrente e tratamento, (B) alteração do peso corporal, (C) escore do índice de atividade da doença (DAI), (D) comprimento do cólon, (E) imagem representativa do cólon, (F) coloração H&E do cólon (ampliação, ×100) e (G) escore histológico. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (n = 6). ##p < 0,01 ou ###p < 0,001 vs grupo controle (Con); *p < 0,05 ou **p < 0,01 ou ***p < 0,001 vs grupo DSS.
O peso corporal, a consistência das fezes e o sangramento retal foram registrados diariamente. O índice de atividade da doença (DAI) foi determinado pela combinação dos escores de peso corporal, consistência das fezes e sangramento retal, conforme descrito anteriormente.19 Ao final do experimento, todos os camundongos foram eutanasiados e amostras de sangue, fezes e cólon foram coletadas para experimentos posteriores.
O tecido do cólon foi fixado em formalina e incluído em parafina. Seções de 5 micrômetros foram feitas e coradas com hematoxilina-eosina (H&E), e então classificadas de forma cega, conforme descrito anteriormente.19
O RNA total do tecido do cólon foi extraído com reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA), seguido de extração de cDNA com transcriptase reversa (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japão). A PCR quantitativa foi realizada utilizando um sistema de PCR em tempo real com SYBR Green Master (Roche, Basel, Suíça). Os transcritos dos genes-alvo foram normalizados para β-actina e os dados foram analisados ​​utilizando o método 2-ΔΔCT. As sequências dos primers dos genes estão apresentadas na Tabela 1.
O isolamento e a cultura de células epiteliais colônicas primárias de camundongos foram realizados conforme descrito anteriormente.²⁰ Resumidamente, os cólons de camundongos de 6 a 8 semanas de idade foram excisados ​​após o sacrifício por deslocamento cervical, abertos longitudinalmente, tratados com solução salina balanceada de Hanks (HBSS, sem cálcio e magnésio) e cortados em pequenos pedaços de 0,5 a 1 mm. Posteriormente, os tecidos foram digeridos com 0,4 mg/mL de colagenase XI (Sigma, Poole, Reino Unido) em meio DMEM livre e centrifugados a 300 xg por 5 min à temperatura ambiente. O pellet foi ressuspenso em meio DMEM (suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades/mL de penicilina e 100 µg/mL de estreptomicina) a 37 °C e passado através de uma malha de náilon (tamanho do poro ~250 µm). Alíquotas de células epiteliais colônicas foram colocadas em placas de fundo de vidro e incubadas. com ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico e extratos fecais de camundongos por 2 horas a 37°C, 5% de CO2.
O tecido do cólon foi homogeneizado com PBS e os níveis das citocinas IL-6, TNF-α e IL-1β no tecido do cólon foram detectados usando kits de ensaio ELISA Luminex (R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA). Da mesma forma, os níveis de GLP-1 no soro e no meio de cultura de células epiteliais colônicas murinas primárias foram determinados com um kit ELISA (Bioswamp, Wuhan, China) de acordo com as instruções do fabricante.
O DNA total das fezes foi extraído utilizando um kit de extração de DNA (Tiangen, China). A qualidade e a quantidade do DNA foram medidas nas razões 260 nm/280 nm e 260 nm/230 nm, respectivamente. Posteriormente, utilizando cada DNA extraído como molde, os primers específicos 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) e 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) foram utilizados para amplificar as regiões V3-V4 do gene 16S rRNA em diferentes regiões. Os produtos de PCR foram purificados utilizando o kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN, Alemanha), quantificados por PCR em tempo real e sequenciados utilizando a plataforma de sequenciamento Illumina MiSeq PE300 (Illumina Inc., CA, EUA). Para a análise bioinformática, o processamento dos dados foi realizado seguindo protocolos previamente descritos.^21,22 Resumidamente, utilizou-se o Cutadapt (V1.9.1) para filtrar os arquivos brutos do Express. Os OTUs foram agrupados utilizando o UPARSE. (versão 7.0.1001) com um limite de similaridade de 97%, e o UCHIME foi usado para remover sequências quiméricas. A análise e classificação da composição da comunidade foram realizadas usando o classificador RDP (http://rdp.cme.msu.edu/) com base no banco de dados de genes de RNA ribossômico SILVA.
Os níveis de ácidos graxos de cadeia curta (ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico) foram medidos conforme descrito anteriormente por Tao et al., com algumas modificações.23 Resumidamente, 100 mg de fezes foram inicialmente suspensos em 0,4 mL de água deionizada, seguidos por 0,1 mL de ácido sulfúrico a 50% e 0,5 mL de ácido 2-etilbutírico (padrão interno), homogeneizados e aquecidos a 4°C. Centrifugue a 12.000 rpm por 15 minutos a C. O sobrenadante foi extraído com 0,5 mL de éter e injetado no GC para análise. Para a análise por cromatografia gasosa (GC), as amostras foram analisadas utilizando um cromatógrafo gasoso GC-2010 Plus (Shimadzu, Inc.) equipado com um detector de ionização de chama (FID). A separação foi realizada utilizando uma coluna ZKAT-624, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., China). Os dados foram adquiridos utilizando o software GC Solution (Shimadzu, Inc.). A razão de divisão foi de 10:1, o gás de arraste foi nitrogênio e a vazão foi de 6 mL/min. O volume de injeção foi de 1 μL. A temperatura do injetor e do detector foi de 300 °C. A temperatura do forno foi mantida a 140 °C por 13,5 minutos e, em seguida, A temperatura foi aumentada para 250°C a uma taxa de 120°C/min; essa temperatura foi mantida por 5 minutos.
Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM). A significância dos dados foi avaliada por ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Duncan. O software GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA) foi utilizado para todos os cálculos e p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
É bem conhecido que a colite ulcerativa (CU) é uma doença crônica recidivante caracterizada por dor abdominal intensa, diarreia e sangramento. Portanto, um modelo de colite crônica recidivante induzida por DSS foi estabelecido em camundongos para avaliar a eficácia anti-colite do BLG (Figura 1A). Comparados ao grupo controle, os camundongos do grupo modelo DSS apresentaram redução significativa no peso corporal e maior índice de atividade da doença (DAI), e essas alterações foram revertidas significativamente após 24 dias de tratamento com BLG (Figuras 1B e C). O encurtamento do cólon é uma característica importante da CU. Como mostrado nas Figuras 1D e E, o comprimento do cólon dos camundongos que receberam DSS estava significativamente reduzido, mas foi atenuado pelo tratamento com BLG. Posteriormente, foi realizada análise histopatológica para avaliar a inflamação colônica. Imagens coradas com hematoxilina e eosina (H&E) e escores patológicos mostraram que a administração de DSS interrompeu significativamente a arquitetura colônica e resultou em destruição das criptas, enquanto o tratamento com BLG reduziu significativamente a destruição das criptas e os escores patológicos (Figuras 1F e G). Notavelmente, o efeito protetor do BLG na dose de 1 A concentração de BLG em g/Kg foi comparável à de SASP na dose de 200 mg/Kg. Em conjunto, esses resultados sugerem que a BLG é eficaz na redução da gravidade da colite crônica recidivante induzida por DSS em camundongos.
TNF-α, IL-1β e IL-6 são importantes marcadores inflamatórios da inflamação colônica. Como mostrado na Figura 2A, o DSS induziu um aumento significativo na expressão gênica de TNF-α, IL-1β e IL-6 no cólon em comparação com o grupo controle. A administração de BLG reverteu significativamente essas alterações mediadas por DSS. Em seguida, utilizamos ELISA para determinar os níveis das citocinas inflamatórias TNF-α, IL-1β e IL-6 no tecido colônico. Os resultados também mostraram que os níveis colônicos de TNF-α, IL-1β e IL-6 estavam significativamente aumentados em camundongos tratados com DSS, enquanto o tratamento com BLG atenuou esses aumentos (Figura 2B).
Figura 2. BLG inibe a expressão gênica e a produção das citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-1β e IL-6 no cólon de camundongos tratados com DSS. (A) Expressão gênica colônica de TNF-α, IL-1β e IL-6; (B) níveis proteicos colônicos de TNF-α, IL-1β e IL-6. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (n = 4–6). #p < 0,05 ou ##p < 0,01 ou ###p < 0,001 vs. grupo controle (Con); *p < 0,05 ou **p < 0,01 vs. grupo DSS.
A disbiose intestinal é crucial na patogênese da colite ulcerativa (CU).²⁴ Para investigar se a BLG modula a microbiota intestinal de camundongos tratados com DSS, o sequenciamento do rRNA 16S foi realizado para analisar a comunidade bacteriana do conteúdo intestinal. O diagrama de Venn mostra que os três grupos compartilham 385 OTUs. Ao mesmo tempo, cada grupo apresentou OTUs únicas (Figura 3A). Além disso, os índices de Chao1 e Shannon, mostrados nas Figuras 3B e 3C, demonstraram que a diversidade da comunidade da microbiota intestinal foi reduzida em camundongos tratados com BLG, visto que o índice de Shannon diminuiu significativamente no grupo tratado com BLG. A análise de componentes principais (PCA) e a análise de coordenadas principais (PCoA) foram utilizadas para determinar os padrões de agrupamento entre os três grupos e mostraram que a estrutura da comunidade de camundongos tratados com DSS foi claramente separada após o tratamento com BLG (Figuras 3D e 3E). Esses dados sugerem que o tratamento com BLG afetou significativamente a estrutura da comunidade de camundongos com colite induzida por DSS.
Figura 3. BLG altera a diversidade da microbiota intestinal em camundongos com colite induzida por DSS. (A) Diagrama de Venn de OTUs, (B) Índice de Chao1, (C) Índice de riqueza de Shannon, (D) Gráfico de escores da Análise de Componentes Principais (PCA) de OTUs, (E) Gráfico de escores da Análise de Coordenadas Principais (PCoA) de OTUs. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (n = 6). **p < 0,01 vs. grupo DSS.
Para avaliar alterações específicas na microbiota fecal, analisamos a composição da microbiota intestinal em todos os níveis taxonômicos. Como mostrado na Figura 4A, os principais filos em todos os grupos foram Firmicutes e Bacteroidetes, seguidos por Verrucomicrobia. A abundância relativa de Firmicutes e a razão Firmicutes/Bacteroidetes aumentaram significativamente nas comunidades microbianas fecais de camundongos tratados com DSS em comparação com camundongos do grupo controle, e essas alterações foram revertidas significativamente após o tratamento com BLG. Em particular, o tratamento com BLG aumentou significativamente a abundância relativa de Verrucobacterium nas fezes de camundongos com colite induzida por DSS. No nível da microbiota intestinal, as comunidades microbianas fecais eram compostas por Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae e Prevotellaceae (Figura 4B). Em comparação com o grupo DSS, a depleção de BLG aumentou a abundância de Akkermansiaceae, mas diminuiu a abundância de Lachnospiraceae e Ruminococcaceae. Notavelmente, em Em nível de gênero, a microbiota fecal era composta por Lachnospira_NK4A136_group, Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001 (Fig. 4C). Este achado também demonstrou que o tratamento com BLG reverteu efetivamente o desequilíbrio da microbiota em resposta ao desafio com DSS, caracterizado por uma diminuição em Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas e Oscillibacter, e um aumento em Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001.
Figura 4. BLG altera a abundância da microbiota intestinal em camundongos com colite induzida por DSS. (A) Abundância da microbiota intestinal em nível de filo; (B) Abundância da microbiota intestinal em nível de família; (C) Abundância da microbiota intestinal em nível de gênero. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (n = 6). #p < 0,05 ou ###p < 0,001 vs. grupo controle (Con); *p < 0,05 ou **p < 0,01 ou ***p < 0,001 vs. grupo DSS.
Considerando que os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) são os principais metabólitos de Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001, e que acetato, propionato e butirato são os AGCC mais abundantes no lúmen intestinal, 25-27 ainda estamos em nosso estudo. Como mostrado na Figura 5, as concentrações fecais de acetato, propionato e butirato foram significativamente reduzidas no grupo tratado com DSS, enquanto o tratamento com BLG conseguiu suprimir amplamente essa redução.
Figura 5. BLG aumenta os níveis de AGCC nas fezes de camundongos com colite induzida por DSS. (A) Conteúdo de ácido acético nas fezes; (B) conteúdo de ácido propiônico nas fezes; (C) conteúdo de ácido butírico nas fezes. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (n = 6). #p < 0,05 ou ##p < 0,01 vs grupo controle (Con); *p < 0,05 ou **p < 0,01 vs grupo DSS.
Calculamos ainda o coeficiente de correlação de Pearson entre os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) diferenciais em nível de gênero e a microbiota fecal. Como mostrado na Figura 6, Akkermansia apresentou correlação positiva com a produção de ácido propiônico (Pearson = 0,4866) e ácido butírico (Pearson = 0,6192). Em contraste, tanto Enteromonas quanto Oscillobacter apresentaram associação negativa com a produção de acetato, com coeficientes de Pearson de 0,4709 e 0,5104, respectivamente. Da mesma forma, Ruminococcaceae_UCG-014 apresentou correlação negativa com a produção de ácido propiônico (Pearson = 0,4508) e ácido butírico (Pearson = 0,5842).
Figura 6. Análise de correlação de Pearson entre os diferentes ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e os microrganismos colônicos. (A) Enteromonas com ácido acético; (B) Bacilo da concussão com ácido acético; (C) Akkermansia com ácido propiônico; (D) Ruminococcus_UCG-014 com ácido propiônico; (E) Akkermansia com ácido butírico; (F) Ruminococcus_UCG-014 com ácido butírico.
O peptídeo semelhante ao glucagon-1 (GLP-1) é um produto pós-translacional específico de cada tipo celular, derivado do proglucagon (Gcg), com propriedades anti-inflamatórias.²⁸ Como mostrado na Figura 7, o DSS induziu uma diminuição significativa na expressão do mRNA do Gcg. O tratamento do cólon com BLG reverteu significativamente a redução do Gcg induzida pelo DSS em comparação com o grupo controle (Fig. 7A). Ao mesmo tempo, o nível de GLP-1 no soro foi significativamente reduzido no grupo tratado com DSS, e o tratamento com BLG preveniu amplamente essa redução (Fig. 7B). Como os ácidos graxos de cadeia curta podem estimular a secreção de GLP-1 por meio da ativação dos receptores acoplados à proteína G 43 (GRP43) e 41 (GRP41), também examinamos o GRP41 e o GRP43 no cólon de camundongos com colite e descobrimos que a expressão do mRNA colônico de GRP43 e GRP41 diminuiu significativamente após o desafio com DSS, e o tratamento com BLG reverteu efetivamente esse efeito. essas diminuições (Figura 7C e D).
Figura 7. BLG aumenta os níveis séricos de GLP-1 e a expressão de mRNA de Gcg, GPR41 e GRP43 no cólon de camundongos tratados com DSS. (A) Expressão de mRNA de Gcg no tecido do cólon; (B) Nível de GLP-1 no soro; (C) Expressão de mRNA de GPR41 no tecido do cólon; (D) Expressão de mRNA de GPR43 no tecido do cólon. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (n = 5–6). #p < 0,05 ou ##p < 0,01 vs. grupo controle (Con); *p < 0,05 vs. grupo DSS.
Como o tratamento com BLG pode aumentar os níveis séricos de GLP-1, a expressão de mRNA de Gcg no cólon e os níveis fecais de SCFA em camundongos tratados com DSS, examinamos ainda o efeito do acetato, propionato e butirato, bem como de camundongos controle (F-Con), com colite induzida por DSS (F-Con) e com colite tratada com BLG (F-BLG), na liberação de GLP-1 de células epiteliais colônicas primárias de camundongos. Como mostrado na Figura 8A, as células epiteliais colônicas primárias de camundongos tratadas com 2 mM de ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico, respectivamente, estimularam significativamente a liberação de GLP-1, o que está de acordo com estudos anteriores.^29,30 Da mesma forma, todos os grupos F-Con, F-DSS e F-BLG (equivalente a 0,25 g de fezes) estimularam consideravelmente a liberação de GLP-1 das células epiteliais colônicas primárias de camundongos. Notavelmente, a quantidade de GLP-1 liberada pelas células epiteliais colônicas primárias de camundongos tratadas com F-DSS foi muito menor do que a liberada pelos grupos controle (F-Con), F-DSS e F-BLG. que em células epiteliais colônicas primárias de camundongos tratadas com F-Con e F-BLG (Figura 8B). Esses dados sugerem que o tratamento com BLG restaurou significativamente a produção intestinal de GLP-1 derivado de AGCC.
Figura 8. Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) derivados de BLG estimulam a liberação de GLP-1 em células epiteliais colônicas primárias de camundongos. (A) O ácido acético, o ácido propiônico e o ácido butírico estimularam a liberação de GLP-1 em células epiteliais colônicas primárias de camundongos; (B) os extratos fecais F-Con, F-DSS e F-BLG estimularam a liberação de GLP-1 em células epiteliais colônicas primárias de camundongos. Quantidade de GLP-1 liberada. Alíquotas de células epiteliais colônicas foram colocadas em placas de Petri com fundo de vidro e tratadas com 2 mM de ácido acético, ácido propiônico, ácido butírico e extratos fecais F-Con, F-DSS e F-BLG (equivalentes a 0,25 g de fezes), respectivamente. 2 horas a 37 °C e 5% de CO2, respectivamente. A quantidade de GLP-1 liberada pelas células epiteliais colônicas primárias de camundongos foi detectada por ELISA. Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (n = 3). #p < 0,05 ou ##p < 0,01 vs. controle negativo ou F-Con; *p < 0,05 vs. F-DSS.
Abreviações: Ace, ácido acético; Pro, ácido propiônico; Pro, ácido butírico; F-Con, extrato fecal de camundongos controle; F-DSS, extrato fecal de camundongos com colite; F-BLG, extrato fecal de cólon de camundongos com inflamação tratados com BLG.
Classificada pela Organização Mundial da Saúde como uma doença refratária, a colite ulcerativa está se tornando um perigo global; Entretanto, os métodos eficazes para prever, prevenir e tratar a doença ainda são limitados. Portanto, há uma necessidade urgente de explorar e desenvolver novas estratégias terapêuticas seguras e eficazes para a colite ulcerativa (CU). Os preparados da medicina tradicional chinesa são uma opção promissora, pois muitos deles têm demonstrado eficácia no tratamento da CU na população chinesa ao longo dos séculos, sendo todos compostos por materiais orgânicos e naturais, em sua maioria inofensivos para humanos e animais.31,32 Este estudo teve como objetivo buscar um preparado da medicina tradicional chinesa seguro e eficaz para o tratamento da CU e explorar seu mecanismo de ação. O BLG é uma fórmula fitoterápica chinesa bem conhecida, utilizada para tratar a gripe.8,33 Trabalhos em nosso laboratório e em outros demonstraram que o índigo, um produto processado da medicina tradicional chinesa a partir da mesma matéria-prima do BLG, apresenta eficácia significativa no tratamento da CU em humanos e animais.4,34 Entretanto, os efeitos anti-colite do BLG e seu mecanismo de ação ainda não estão claros. No presente estudo, nossos resultados demonstram que o BLG atenua eficazmente a inflamação colônica induzida por DSS, que está associada a Modulação da microbiota intestinal e restauração da produção de GLP-1 derivado do intestino.
É bem conhecido que a colite ulcerativa (CU) é caracterizada por períodos de recidiva com características clínicas típicas, como perda de peso, diarreia, sangramento retal e danos extensos à mucosa colônica.35 Assim, a colite recidivante crônica foi induzida pela administração de três ciclos de 1,8% de DSS por cinco dias, seguidos por sete dias de água potável. Como mostrado na Figura 1B, a perda de peso flutuante e os escores do Índice de Atividade da Doença (DAI) indicaram a indução bem-sucedida da colite recidivante crônica. Os camundongos do grupo tratado com BLG apresentaram recuperação acelerada a partir do 8º dia, com diferença significativa em relação ao 24º dia. As mesmas alterações também foram observadas no escore do DAI, sugerindo uma melhora no quadro clínico da colite. Em termos de lesão colônica e estado inflamatório, o comprimento do cólon, os danos ao tecido colônico e a expressão gênica e produção das citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-1β e IL-6 no tecido colônico também apresentaram melhora significativa após o tratamento com BLG. Em conjunto, esses resultados demonstram claramente que o BLG é eficaz no tratamento da colite recidivante crônica. colite em camundongos.
Como o BLG exerce seus efeitos farmacológicos? Numerosos estudos anteriores demonstraram que a microbiota intestinal desempenha um papel fundamental na patogênese da colite ulcerativa (CU), e terapias baseadas no microbioma e terapias direcionadas ao microbioma surgiram como uma estratégia muito atraente para o tratamento da CU. No presente estudo, demonstramos que o tratamento com BLG resultou em alterações significativas na composição da microbiota intestinal, sugerindo que o efeito protetor do BLG contra a colite induzida por DSS está relacionado à modulação da microbiota intestinal. Essa observação está de acordo com a noção de que reprogramar a homeostase da microbiota intestinal é uma abordagem importante para compreender a eficácia de preparações da Medicina Tradicional Chinesa (MTC).36,37 Notavelmente, a Akkermansia é uma bactéria Gram-negativa e estritamente anaeróbica que vive na camada de muco do intestino, degradando mucinas, produzindo ácido propiônico, estimulando a diferenciação de células caliciformes e mantendo a mucosa. função de integridade da barreira.26 Múltiplos dados clínicos e em animais sugerem que Akkermansia está altamente associada à mucosa saudável,38 e a administração oral de Akkermansia spp. pode melhorar significativamente a inflamação da mucosa.39 Nossos dados atuais sugerem que a abundância relativa de Akkermansia aumenta significativamente após o tratamento com BLG. Além disso, Prevotellaceae_UCG-001 é uma bactéria produtora de AGCC.27 Vários estudos mostraram que Prevotellaceae_UCG-001 foi encontrada em baixa abundância relativa nas fezes de animais com colite.40,41 Nossos dados atuais também mostram que o tratamento com BLG pode aumentar significativamente a abundância relativa de Prevotellaceae_UCG-001 no cólon de camundongos tratados com DSS. Em contraste, Oscillibacter é uma bactéria mesofílica, estritamente anaeróbica.42 relataram que a abundância relativa de Oscillibacter aumentou significativamente em camundongos com RCUI e apresentou correlação positiva significativa com os níveis de IL-6 e IL-1β e escores patológicos.43,44 Notavelmente, o tratamento com BLG reduziu significativamente a abundância relativa de Oscillibacter nas fezes de camundongos tratados com DSS. Notavelmente, essas bactérias alteradas por BLG foram as A maioria das bactérias produtoras de AGCC. Numerosos estudos anteriores demonstraram os potenciais efeitos benéficos dos AGCC na inflamação do cólon e na proteção da integridade do epitélio intestinal.45,46 Nossos dados atuais também observaram que as concentrações de acetato, propionato e butirato de AGCC nas fezes tratadas com DSS aumentaram significativamente em camundongos tratados com BLG. Em conjunto, esses achados demonstram claramente que o tratamento com BLG pode aumentar efetivamente as bactérias produtoras de AGCC induzidas por DSS em camundongos com colite crônica recidivante.
O GLP-1 é uma incretina produzida principalmente no íleo e no cólon e desempenha um papel importante no retardo do esvaziamento gástrico e na redução da glicemia pós-prandial.47 Evidências sugerem que a dipeptidil peptidase (DPP)-4, um agonista do receptor de GLP-1, e uma nanomedicina de GLP-1 podem aliviar eficazmente a inflamação intestinal em camundongos.48-51 Como relatado em estudos anteriores, altas concentrações de AGCC foram associadas aos níveis plasmáticos de GLP-1 em humanos e camundongos.52 Nossos dados atuais mostram que, após o tratamento com BLG, os níveis séricos de GLP-1 e a expressão de mRNA de Gcg aumentaram significativamente. Da mesma forma, a secreção de GLP-1 aumentou significativamente em culturas de cólon após estimulação com extratos fecais de camundongos com colite tratados com BLG, em comparação com a estimulação com extratos fecais de camundongos com colite tratados com DSS. Como os AGCC afetam a liberação de GLP-1? Gwen Tolhurst et al. Relataram que os AGCC podem estimular a secreção de GLP-1 através de GRP43 e GPR41.29 Nossos dados atuais também mostram que o tratamento com BLG aumenta significativamente a expressão de mRNA de GRP43 e GPR41 no cólon de camundongos tratados com DSS. Esses dados sugerem que o tratamento com BLG pode restaurar a produção de GLP-1 promovida por AGCC através da ativação de GRP43 e GPR41.
BLG é um medicamento de venda livre (OTC) de uso prolongado na China. A dose máxima tolerada de BLG em camundongos Kunming é de 80 g/kg, e nenhuma toxicidade aguda foi observada.⁵³ Atualmente, a dose recomendada de BLG (sem açúcar) em humanos é de 9 a 15 g/dia (3 vezes ao dia). Nosso estudo mostrou que BLG a 1 g/kg melhorou a colite crônica recidivante induzida por DSS em camundongos. Essa dose é próxima da dose de BLG usada clinicamente. Nosso estudo também descobriu que seu mecanismo de ação é mediado, pelo menos em parte, por alterações na microbiota intestinal, especificamente bactérias produtoras de AGCC, como Akkermansia e Prevotellaceae_UCG-001, para restaurar a produção de GLP-1 derivado do intestino. Essas descobertas sugerem que o BLG merece consideração adicional como um potencial agente terapêutico para o tratamento clínico da colite. No entanto, o mecanismo exato pelo qual ele modula a microbiota intestinal ainda precisa ser confirmado por meio de camundongos com deficiência de microbiota e transplante bacteriano fecal.
Ace, ácido acético; but, ácido butírico; BLG, pandano; DSS, sulfato de dextrano sódico; DAI, índice de atividade da doença; DPP, dipeptidil peptidase; FID, detector de ionização de chama; F-Con, extratos fecais de controle de camundongos; F-DSS, extratos fecais de camundongos com colite induzida por DSS; F-BLG, extratos fecais de camundongos com colite tratados com BLG; GLP-1, peptídeo semelhante ao glucagon-1; Gcg, glucagon; cromatografia gasosa; GRP43, receptor 43 acoplado à proteína G; GRP41, receptor 41 acoplado à proteína G; H&E, hematoxilina-eosina; HBSS, solução salina balanceada de Hanks; OTC; PCA, análise de componentes principais; PCoA, análise de coordenadas principais; Pro, ácido propiônico; SASP, sulfassalazina. SCFA, ácidos graxos de cadeia curta; Medicina chinesa, medicina tradicional chinesa; RC, colite ulcerativa.
Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal do Centro Médico da Universidade de Ciência e Tecnologia de Shenzhen-Hong Kong da Universidade de Pequim (Shenzhen, China), de acordo com as Diretrizes Institucionais e Regulamentos de Uso de Animais (número de aprovação ética A2020157).
Todos os autores contribuíram significativamente para a concepção e o planejamento, a coleta de dados ou a análise e interpretação dos dados; participaram da redação do artigo ou da revisão crítica do conteúdo intelectual importante; concordaram em submeter o manuscrito à presente revista; aprovaram a versão final para publicação; e foram responsáveis ​​por todos os aspectos do trabalho.
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81560676 e 81660479), pelo projeto de primeira classe da Universidade de Shenzhen (86000000210), pelo Fundo do Comitê de Inovação em Ciência e Tecnologia de Shenzhen (JCYJ20210324093810026), pelo Fundo de Pesquisa em Ciência e Tecnologia Médica da Província de Guangdong (A2020157 e A2020272), pelo Laboratório Principal de Farmácia da Universidade Médica de Guizhou, financiado pela Província de Guizhou (YWZJ2020-01) e pelo Hospital da Universidade de Pequim em Shenzhen (JCYJ2018009).
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