A triagem de proteínas na via secretora é essencial para a manutenção da compartimentalização e homeostase celular. Além da triagem mediada pela cápsula lipídica, o papel dos lipídios na triagem mediada pela cinesina durante o transporte secretor é uma questão fundamental de longa data que ainda não foi respondida. Neste estudo, realizamos imagens 3D simultâneas multicoloridas de alta resolução em tempo real para demonstrar in vivo que proteínas recém-sintetizadas, imobilizadas em glicosilfosfatidilinositol e com longas cadeias de ceramida, são agrupadas e classificadas em sítios de saída especializados no retículo endoplasmático, diferentes daqueles utilizados por proteínas transmembranares. Além disso, mostramos que o comprimento da cadeia de ceramida na membrana do retículo endoplasmático é crucial para essa seletividade de triagem. Nosso estudo fornece a primeira evidência direta in vivo para a classificação de cargas proteicas com base no comprimento da cadeia lipídica em sítios de exportação seletivos na via secretora.
Em células eucarióticas, as proteínas sintetizadas no retículo endoplasmático (RE) são então classificadas durante o transporte pela via secretora para serem entregues ao seu destino celular apropriado (1). Além da classificação mediada por revestimento, especula-se há muito tempo que certos lipídios também podem servir como pontos de saída seletivos, agrupando-os em domínios de membrana específicos que contêm proteínas específicas (2-5). No entanto, ainda faltam evidências diretas in vivo para comprovar esse possível mecanismo baseado em lipídios. Para solucionar esse problema fundamental, estudamos em levedura como proteínas ancoradas por glicosilfosfatidilinositol (GPI-APs) são exportadas diferencialmente do RE. As GPI-APs são uma variedade de proteínas de superfície celular conectadas por lipídios (6, 7). Uma GPI-AP é uma proteína secretada que se liga à camada externa da membrana plasmática por meio da porção glicolipídica (âncora GPI). Elas aceitam âncoras GPI como modificações pós-traducionais conservativas no lúmen do RE (8). Após a ligação, o GPI-AP atravessa o aparelho de Golgi (5, 9) do retículo endoplasmático (RE) para a membrana plasmática. A presença de âncoras GPI faz com que o GPI-AP seja transportado separadamente de proteínas secretadas transmembranares (incluindo outras proteínas da membrana plasmática) ao longo da via secretora (5, 9, 10). Em células de levedura, os GPI-APs são separados de outras proteínas secretadas no retículo endoplasmático e, em seguida, empacotados em vesículas únicas envoltas pelo complexo proteico de revestimento II (COPII) (6, 7). Os determinantes desse processo de classificação na exportação do RE não são claros, mas especula-se que esse mecanismo possa requerer lipídios, especialmente a remodelação estrutural da porção lipídica da âncora GPI (5, 8). Em leveduras, a remodelação lipídica do GPI começa imediatamente após a ligação do GPI e, em muitos casos, leva à ligação da ceramida ao ácido graxo saturado de cadeia longa de 26 carbonos (C26:0) (11, 12). A ceramida C26 é a principal ceramida produzida pelas células de levedura até o momento. Ela é sintetizada no retículo endoplasmático (RE) e a maior parte é exportada para o complexo de Golgi através de vesículas COPII (13). A exportação do GPI-AP do RE requer especificamente a síntese contínua de ceramida (14, 15) e, por sua vez, a conversão de ceramida em inositol fosfato ceramida (IPC) no complexo de Golgi depende da síntese da âncora GPI (16). Estudos biofísicos com membranas artificiais mostraram que ceramidas com cadeias acil muito longas podem coalescer para formar domínios ordenados com propriedades físicas únicas (17, 18). Esses dados levam à hipótese de que a ceramida C26 e o ​​GPI-AP com ceramida C26 utilizam suas propriedades físicas para coalescer em regiões ordenadas ou regiões no ambiente lipídico relativamente desorganizado da membrana do RE. Ela é composta principalmente de glicerolipídios curtos e insaturados (C16:1 e C18:1) (19, 20). Essas regiões serão seletivamente focadas em locais de saída do RE específicos (ERES), onde a ceramida e o GPI-AP baseado em ceramida podem ser cotransportados para o Golgi na mesma vesícula COPII dedicada (5).
Neste estudo, testamos diretamente esse mecanismo baseado em lipídios usando microscopia confocal de super-resolução em tempo real (SCLIM), uma técnica de microscopia de ponta que pode observar simultaneamente proteínas marcadas fluorescentemente. As imagens tridimensionais (3D) e tricolores têm resolução e velocidade extremamente altas em células vivas (21, 22).
Aplicamos inicialmente a tecnologia SCLIM para definir melhor como a GPI-AP normal com grupo ceramida C26 é separada das proteínas secretadas transmembranares após sair do RE em S. cerevisiae. Para verificar a classificação do RE, utilizamos um sistema genético capaz de visualizar diretamente a carga recém-sintetizada entrando no ERES in vivo (7, 23). Como carga, escolhemos a GPI-AP Gas1, baseada em ceramida C26 e marcada com proteína fluorescente verde (GFP), e a proteína secretada transmembranar Mid2, marcada com proteína fluorescente no infravermelho próximo (iRFP), ambas direcionadas à membrana plasmática (24–26). No mutante termossensível sec31-1, essas duas cargas são expressas sob um promotor induzível por galactose e um marcador constitutivo de ERES. Na temperatura extrema (37 °C), como a mutação sec31-1 afeta a função do componente do revestimento COPII, Sec31, de inibir a germinação do COPII e a exportação do RE, a carga recém-sintetizada se acumula no RE (23). Após o resfriamento a uma temperatura baixa (24 °C), as células mutantes sec31-1 se recuperaram da área secretora e a nova carga sintética acumulada começou a ser exportada do RE. A visualização por CLIM mostrou que a maior parte do Gas1-GFP e do Mid2-iRFP recém-sintetizados ainda se acumulava no RE das células mutantes sec31-1 após incubação a 37 °C e posterior liberação a 24 °C por 5 minutos (Figura 1). Como o Mid2-iRFP está distribuído por toda a membrana do RE, e o Gas1-GFP está concentrado e agrupado na área descontínua da membrana do RE, sua distribuição é completamente diferente (Figura 1, A a C e Vídeo S1). Além disso, como mostrado na Figura 1D, o aglomerado de Gas1-GFP não apresenta Mid2-iRFP. Esses resultados indicam que as proteínas GPI-AP e transmembranares se separam em diferentes regiões da membrana do RE precocemente. O cluster Gas1-GFP é adjacente a um ERES específico marcado com a proteína de revestimento COPII Sec13 do mCherry (Figura 1, E e F, e vídeo S1) (23).
As células sec31-1 expressam secreções induzidas por galactose, uma ceramida de cadeia acil longa (C26) GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, verde) e a proteína transmembranar Mid2-iRFP (TMP, azul). A marcação construtiva de ERES com Sec13-mCherry (ERES, magenta) foi realizada após incubação a 37 °C por 30 minutos, transferência para 24 °C e obtenção de imagens por SCLIM 5 minutos depois. (A a C) mostram uma imagem 2D representativa, composta ou única, de um plano (A), uma imagem de projeção 2D de 10 seções z (B) ou uma imagem 3D do hemisfério celular mostrando a carga e os marcadores de ERES (C). Barra de escala: 1 μm (A e B). A unidade de escala é 0,551 μm (C). Gas1-GFP foi detectado em regiões ou agrupamentos discretos do RE, enquanto Mid2-iRFP foi detectado e distribuído por toda a membrana do RE (C). (D) O gráfico mostra a intensidade de fluorescência relativa de Gas1-GFP e Mid2-iRFP no aglomerado de Gas1-GFP ao longo da linha da seta branca (esquerda). UA, unidade arbitrária. (E e F) representam a imagem 3D que combina a marca de Gas1-GFP e ERES. Aglomerados de Gas1-GFP foram detectados próximos ao ERES específico. A unidade de escala é 0,551 μm. (F) A seta branca sólida marca o aglomerado de Gas1-GFP associado ao ERES. Os painéis do meio e da direita mostram a imagem 3D ampliada e combinada e uma vista rotacionada do aglomerado de Gas1-GFP selecionado.
A estreita relação espacial entre o aglomerado Gas1-GFP e um ERES específico indica que o Gas1-GFP pode entrar em ERES seletivos, o que difere da seletividade utilizada pelo Mid2-iRFP para sair do RE. Para investigar essa possibilidade, quantificamos a proporção de ERES para apenas um ou dois tipos de carga (Figura 2, A a C). Descobrimos que a maioria dos ERES (70%) contém apenas um tipo de carga. A imagem inferior da Figura 2C mostra dois exemplos típicos de ERES com apenas Gas1-GFP (Figura 1) ou apenas Mid2-iRFP (Figura 2). Em contraste, aproximadamente 20% dos ERES contêm duas cargas que se sobrepõem na mesma área. Constatou-se que alguns ERES (10%) continham dois tipos de carga, mas estavam isolados em áreas claramente distintas. Portanto, essa análise estatística demonstra que, após a exportação do RE, o GPI-AP Gas1-GFP e a carga transmembranar Mid2-iRFP são separados em ERES diferentes (Figura 2D). Essa eficiência de triagem é bastante consistente com a análise bioquímica anterior (6) e a determinação morfológica (7). Também podemos observar o comportamento da carga em quarentena ao entrar no ERES (Figura 2E e Vídeo S2). A Figura 2E mostra que apenas uma pequena porção de Gas1-GFP (painel 3) ou Mid2-iRFP (painel 4) entra no ERES por um lado e fica confinada em uma área discreta. O painel 5 da Figura 2E mostra que Gas1-GFP e Mid2-iRFP são encontrados, às vezes, no mesmo ERES, mas entram por lados diferentes e se concentram em regiões separadas que podem representar diferentes vesículas COPII. Também confirmamos que a separação e a classificação observadas do GPI-AP Gas1, baseado em ceramida C26, como ERES seletivo é específica, pois outra carga de secreção transmembrana, a proteína de membrana plasmática Axl2 marcada com GFP (27), apresenta comportamento semelhante ao de Mid2-iRFP (Figura S1 e Vídeo S3). A proteína Axl2-GFP recém-sintetizada se distribui pela membrana do RE como a Mid2-iRFP (Figura S1, A e B) e se co-localiza com a Mid2-iRFP na maioria dos ERES (Figura S1, B a D). Os painéis 1 e 2 da Figura 1. S1C mostram dois exemplos típicos de ERES onde duas cargas transmembranares se sobrepõem. Nesses casos, ambas as cargas entram no ERES juntas (Figura S1E, painel 3 e vídeo S3).
As células sec31-1 expressando secreções induzíveis por galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) e Mid2-iRFP (TMP, azul) e marcação constitutiva de ERES Sec13-mCherry (ERES, magenta) foram colocadas a 37 °C. Após incubação por 30 minutos a 37 °C, foram transferidas para 24 °C para liberar o bloqueio de secreção e as imagens foram obtidas com SCLIM após 20 minutos. (A a C) Imagens representativas de projeção 2D (A; barra de escala, 1 μm) ou imagens 3D do hemisfério celular (B e C; unidade de escala, 0,456 μm) da carga e 10 seções z marcadas por ERES. O painel inferior em (B) e o painel em (C) exibem imagens processadas para mostrar apenas as substâncias presentes em ERES (magenta) [Gas1-GFP (cinza) e Mid2-iRFP (azul claro)]. (C) Seta aberta: ERES carrega apenas uma carga (1 a 4). Seta cinza: ERES contém carga segregada (5). Seta branca sólida: ERES contendo carga co-localizada. Abaixo: O ERES único selecionado contém apenas Gas1-GFP (1) ou Mid2-iRFP (2). Barra de escala, 100 nm. (D) Quantificação da fotomicrografia descrita em (C). A porcentagem média de ERES que contém apenas uma carga (Gas1-GFP ou Mid2-iRFP), carga segregada e carga sobreposta. Em três experimentos independentes, n=432 em 54 células. Barra de erro = DP. Teste t não pareado bicaudal. *** P = 0,0002. (E) Imagem 3D do ERES selecionado com carga em quarentena marcada com (C). Gas1-GFP (verde) (3) ou Mid2-iRFP (azul) (4) entra no ERES (magenta) por um lado e fica restrito a uma pequena área dentro do ERES. Às vezes, ambos os tipos de carga entram no mesmo ERES (5) pelo mesmo lado e ficam confinados a uma área isolada dentro do ERES. Barra de escala, 100 nm.
Em seguida, testamos a hipótese de que a ceramida de cadeia acil longa (C26) presente na membrana do RE direciona o agrupamento e a classificação específicos de Gas1 para os ERES seletivos. Para isso, utilizamos uma cepa de levedura modificada, GhLag1, na qual as duas ceramida sintases endógenas, Lag1 e Lac1, foram substituídas por GhLag1 (o homólogo de Lag1 do algodão), resultando em uma cepa de levedura com uma cadeia de ceramida na membrana celular mais curta do que a da cepa selvagem (Figura 3A) (28). A análise por espectrometria de massa (EM) mostrou que, nas cepas selvagens, 95% da ceramida total é ceramida de cadeia muito longa (C26), enquanto em GhLag1, 85% da ceramida é de cadeia muito longa (C18 e C16), e apenas 2% da ceramida é de cadeia muito longa (C26). Embora as ceramidas C18 e C16 sejam as principais ceramidas detectadas na membrana de GhLag1 até o momento, a análise por espectrometria de massas também confirmou que a âncora GPI de Gas1-GFP expressa na cepa GhLag1 contém ceramida C26, comparável aos lipídios do tipo selvagem. A qualidade é a mesma (Fig. 3A) (26). Portanto, isso significa que a enzima de remodelagem de ceramida Cwh43 é altamente seletiva para ceramida C26, como mostrado na Figura 26, incorporando preferencialmente a âncora GPI a partir de uma pequena quantidade de ceramida C26 na cepa GhLag1. S2 (29). No entanto, a membrana celular de GhLag1 contém basicamente apenas ceramidas C18-C16, enquanto Gas1-GFP ainda apresenta ceramida C26. Esse fato torna essa cepa uma ferramenta ideal para solucionar especificamente o problema do comprimento da cadeia acil da ceramida da membrana no retículo endoplasmático. O papel hipotético da classificação e da triagem. Em seguida, estudamos a capacidade da proteína Gas1-GFP marcada com C26 de se acumular em aglomerados em GhLag1 com um alelo mutante termossensível de sec31-1 por meio de microscopia de fluorescência convencional, onde apenas a cadeia longa (C18-C16) está presente na membrana do retículo endoplasmático (RE) rica em ceramida (Figura 3). Observamos que, em sec31-1, a maior parte da Gas1-GFP estava concentrada em aglomerados, enquanto que em GhLag1 com a membrana do RE rica em ceramida (C18-C16) e com a cadeia longa (C18-C16), a Gas1-GFP não se aglomerava, estando distribuída por toda a membrana do RE. Mais precisamente, como a aglomeração baseada em ceramida C26 está intimamente relacionada a sítios de exportação do RE (ERES) específicos (Figura 1), investigamos se esse processo também poderia envolver a função do mecanismo de exportação de proteínas do RE. A GPI-AP utiliza um sistema COPII especial para exportação do RE, que é ativamente regulado pela remodelação estrutural da porção glicana da âncora GPI promovida por Ted1 (30, 31). O GPI-glicano recombinante é então reconhecido pelo complexo receptor de carga transmembrana p24, que por sua vez recruta seletivamente Lst1, uma isoforma específica da principal subunidade de ligação à carga do COPII, Sec24, formando vesículas COPII ricas em GPI-AP (31-33). Portanto, construímos um mutante duplo que combinou a deleção dessas proteínas individuais (o componente Emp24 do complexo p24, a enzima de remodelação do GPI-glicano Ted1 e a subunidade específica do COPII Lst1) com a cepa mutante sec31-1 e estudamos a possibilidade de formação do cluster Gas1-GFP (Figura 3). Observamos que em sec31-1emp24Δ e sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP está principalmente não agrupado e distribuído por toda a membrana do RE, como visto anteriormente em sec31-1 GhLag1, enquanto em sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP se comporta como em sec31-1. Esses resultados indicam que, além da presença de ceramida C26 na membrana do RE, o agrupamento de Gas1-GFP também precisa se ligar ao complexo p24 e não requer o recrutamento específico de Lst1. Em seguida, exploramos a possibilidade de que o comprimento da cadeia de ceramida na membrana do RE possa regular a ligação de Gas1-GFP a p24. No entanto, descobrimos que a presença de ceramida C18-C16 na membrana não afeta os glicanos GPI reconstruídos pelo complexo p24 (Figuras S3 e S4, A e B) nem a ligação a GPI-AP e a capacidade de exportação de GPI-AP. Recrutar o subtipo COPII Lst1 (Figura S4C). Portanto, o agrupamento dependente de ceramida C26 não requer interações proteicas com diferentes mecanismos de proteínas de exportação do RE, mas suporta um mecanismo de classificação alternativo impulsionado pelo comprimento do lipídio. Em seguida, analisamos se o comprimento da cadeia acil da ceramida na membrana do RE é importante para a classificação eficaz de Gas1-GFP como ERES seletivo. Como Gas1 na cepa GhLag1 com ceramida de cadeia curta sai do RE e entra na membrana plasmática (Figura S5), acreditamos que, se a classificação for impulsionada pelo comprimento da cadeia acil da ceramida, Gas1 na cepa GhLag1 pode ser redirecionado e atravessar o ERES, apresentando a mesma membrana.
(A) A membrana celular de GhLag1 contém principalmente ceramidas C18-C16 mais curtas, enquanto a âncora GPI de Gas1-GFP ainda possui o mesmo IPC C26 que as células do tipo selvagem. Acima: análise do comprimento da cadeia acil da ceramida na membrana celular das cepas do tipo selvagem (Wt) e GhLag1p por espectrometria de massa (MS). Os dados representam a porcentagem da ceramida total. Média de três experimentos independentes. Barra de erro = DP. Teste t não pareado bicaudal. **** P < 0,0001. Painel inferior: análise por MS do comprimento da cadeia acil do IPC presente na âncora GPI de Gas1-GFP (GPI-IPC) expressa nas cepas do tipo selvagem e GhLag1p. Os dados representam a porcentagem do sinal total de IPC. Média de cinco experimentos independentes. Barra de erro = DP. Teste t não pareado bicaudal. ns, não significativo. P = 0,9134. (B) Micrografias de fluorescência de células sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ e sec31-1lst1Δ expressando Gas1-GFP induzido por galactose foram incubadas a 37 °C por 30 minutos e transferidas para 24 °C para realizar microscopia de fluorescência de rotina. Seta branca: aglomerado de Gas1-GFP no RE. Seta aberta: Gas1-GFP não aglomerado distribuído por toda a membrana do RE, mostrando a coloração característica do anel nuclear do RE. Barra de escala: 5 μm. (C) Quantificação da fotomicrografia descrita em (B). A porcentagem média de células com estrutura pontilhada de Gas1-GFP. Em três experimentos independentes, n ≥ 300 células. Barra de erro = DP. Teste t não pareado bicaudal. **** P < 0,0001.
Para solucionar diretamente esse problema, realizamos a visualização por SCLIM de Gas1-GFP e Mid2-iRFP em GhLag1 com o alelo mutante termossensível sec31-1 (Figura 4 e Vídeo S4). Após o RE ser mantido a 37 °C e posteriormente liberado a 24 °C, a maior parte do Gas1-GFP recém-sintetizado não estava agrupada e se distribuía por toda a membrana do RE, conforme observado por microscopias convencionais (Figura 4, A e B). Além disso, uma grande porcentagem de ERES (67%) inclui dois tipos de carga co-localizados (Figura 4D). Os painéis 1 e 2 da Figura 4C mostram dois exemplos típicos de ERES com Gas1-GFP e Mid2-GFP sobrepostos. Ademais, ambas as proteínas foram recrutadas para o mesmo ERES (Figura 4E, painel 3 e vídeo S4). Portanto, nossos resultados indicam que o comprimento da cadeia acil de ceramida na membrana do RE é um importante determinante da agregação e classificação de proteínas do RE.
Células Sec31-1 GhLag1 expressando secreções induzidas por galactose, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) e Mid2-iRFP (TMP, azul) e Sec13-mCherry constitutivamente marcado com ERES (ERES, magenta). Incubadas a 37 °C. Continuadas por 30 minutos, reduzidas para 24 °C para liberar as secreções e imagens obtidas com SCLIM após 20 minutos. (A a C) Imagens representativas de projeção 2D (A; barra de escala, 1 μm) ou imagens 3D do hemisfério celular (B e C; unidade de escala, 0,45 μm) das 10 seções z marcadas pela carga e pelo ERES. O painel inferior em (B) e o painel em (C) exibem imagens processadas para mostrar apenas as substâncias presentes no ERES (magenta) [Gas1-GFP (cinza) e Mid2-iRFP (azul claro)]. (C) Seta branca preenchida: sobreposição entre ERES e as substâncias. Seta aberta: ERES contém apenas um item. Painel inferior: O ERES selecionado possui cargas sobrepostas (1 e 2) marcadas em (C). Barra de escala, 100 nm. (D) Quantificação da fotomicrografia descrita em (C). Nas unidades sec31-1 e sec31-1 GhLag1, apenas uma carga (Gas1-GFP ou Mid2-iRFP) está incluída, e a porcentagem média de ERES para carga isolada e carga sobreposta. Em três experimentos independentes, n = 432 em 54 células (sec31-1) e n = 430 em 47 células (sec31-1 GhLag1). Barra de erro = DP. Teste t não pareado bicaudal. *** P = 0,0002 (sec31-1) e ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Imagem 3D do ERES selecionado com carga sobreposta (3) marcada em (C). Gas1-GFP (verde) e Mid2-iRFP (azul) aproximam-se do ERES (magenta) pelo mesmo lado e permanecem na mesma área restrita pelo ERES. Barra de escala: 100 nm.
Este estudo fornece evidências diretas in vivo de que proteínas lipídicas são classificadas em sítios de exportação seletivos na via secretora e revela a importância do comprimento da cadeia acil para a seletividade da classificação. Utilizando uma técnica de microscopia poderosa e de ponta chamada SCLIM, demonstramos a síntese recente de Gas1-GFP (uma importante GPI-AP da membrana plasmática com uma porção lipídica de ceramida de cadeia acil muito longa (C26)) em levedura. As regiões agrupadas em REs discretos estão associadas a ERES específicos, enquanto proteínas transmembranares secretadas são distribuídas por toda a membrana do RE (Figura 1). Além disso, esses dois tipos de proteínas entram seletivamente em diferentes ERES (Figura 2). O comprimento da cadeia acil da ceramida celular na membrana é reduzido de C26 para C18-C16, o agrupamento de Gas1-GFP é desfeito na região discreta do RE e Gas1-GFP é redirecionado para sair do RE com a proteína transmembranar através do mesmo ERES (Figura 3 e Figura 3.4).
Embora a GPI-AP utilize um mecanismo proteico especializado para sair do RE, descobrimos que a separação dependente de ceramida C26 não depende de interações proteicas diferenciais que possam levar à especialização do ERES (Figuras S4 e S5). Em vez disso, nossas descobertas apoiam um mecanismo de classificação alternativo impulsionado pelo agrupamento de proteínas baseado em lipídios e subsequente exclusão de outras cargas. Nossas observações indicam que a região ou o agrupamento Gas1-GFP associado a um ERES específico não possui a proteína secretada transmembrana Mid2-iRFP, o que indica que o agrupamento GPI-AP dependente de ceramida C26 facilitará sua entrada no ERES relevante e, ao mesmo tempo, impedirá que secreções transmembrana entrem nesse ERES específico (Figuras 1 e 2). Em contraste, a presença de ceramidas C18-C16 na membrana do RE não faz com que a GPI-AP forme regiões ou agrupamentos, portanto, elas não excluem nem substituem proteínas secretadas transmembrana no mesmo ERES (Figuras 3 e 4). Portanto, propomos que a ceramida C26 impulsiona a separação e a classificação, facilitando o agrupamento de proteínas ligadas a ERES específicos.
Como alcançar esse agrupamento dependente de ceramida C26 em uma área específica do RE? A tendência da ceramida da membrana de se separar lateralmente pode fazer com que GPI-AP e ceramida C26 formem pequenos aglomerados lipídicos instantaneamente ordenados no ambiente lipídico mais irregular da membrana do RE, que contém glicerolipídios mais curtos e insaturados. Aglomerados de qualidade (17, 18). Esses pequenos aglomerados temporários podem ser posteriormente fundidos em aglomerados maiores e mais estáveis ​​após a ligação ao complexo p24 (34). De acordo com isso, mostramos que C26 Gas1-GFP precisa interagir com o complexo p24 para formar aglomerados visíveis maiores (Figura 3). O complexo p24 é um oligômero heterozigoto composto por quatro proteínas transmembranares p24 diferentes em levedura (35), que proporciona ligação multivalente, a qual pode levar à reticulação de pequenos aglomerados de GPI-AP, gerando assim aglomerados estáveis ​​maiores (34). A interação entre os ectodomínios proteicos dos GPI-APs também pode contribuir para sua agregação, como demonstrado durante o transporte no complexo de Golgi em células epiteliais polarizadas de mamíferos (36). No entanto, quando a ceramida C18-C16 está presente na membrana do RE, ao se ligar ao complexo p24 e ao se ligar ao Gas1-GFP, não se formam grandes aglomerados separados. O mecanismo subjacente pode depender das propriedades físico-químicas específicas da ceramida de cadeia acil longa. Estudos biofísicos de membranas artificiais mostram que, embora tanto as ceramidas de cadeia acil longa (C24) quanto as de cadeia acil curta (C18-C16) possam causar separação de fases, apenas as ceramidas de cadeia acil longa (C24) podem promover alta curvatura e flexão do filme para remodelá-lo. Através de referência mútua (17, 37, 38). Foi demonstrado que a hélice transmembranar de TMED2, o homólogo humano de Emp24, interage seletivamente com a esfingomielina baseada em ceramida C18 nos lóbulos citoplasmáticos (39). Usando simulações de dinâmica molecular (DM), descobrimos que tanto as ceramidas C18 quanto as C26 se acumulam ao redor dos lóbulos citoplasmáticos da hélice transmembranar de Emp24, e que elas apresentam preferências semelhantes (Figura S6). Vale ressaltar que isso indica que a hélice transmembranar de Emp24 pode levar a uma distribuição assimétrica de lipídios na membrana. Este é um resultado recente baseado em células de mamíferos. Simulações de DM semelhantes também mostram a presença de lipídios éter (40). Portanto, especulamos que a ceramida C26 nos dois lóbulos de ER26 seja localmente enriquecida. Quando a GPI-AP nos lóbulos luminais se liga diretamente à p24 multivalente e ocorre o acúmulo de ceramida C26 ao redor da p24 nos lóbulos citoplasmáticos, isso pode promover a agregação proteica concomitante e a curvatura da membrana gerada através dos dedos (41), fazendo com que a GPI-AP se separe em regiões discretas adjacentes ao ERES, o que também favorece as regiões altamente curvadas da membrana do RE (42). Relatórios anteriores apoiaram o mecanismo proposto (43, 44). A ligação multivalente de oligolectinas, patógenos ou anticorpos a glicoesfingolipídios (GSL) à base de ceramida na membrana plasmática desencadeia grande agregação de GSL, aumenta a separação de fases e causa deformação e internalização da membrana (44). Iwabuchi etc. (43) Foi descoberto que na presença de cadeias acil longas (C24), mas não curtas (C16), o ligante multivalente ligado ao GSL lactosilceramida induziu a formação de grandes aglomerados e invaginação da membrana, e a transdução de sinal mediada por Lyn no citoplasma nas lâminas é interdigitada por cadeias acil em neutrófilos acoplados.
Em células epiteliais polarizadas de mamíferos, a concentração da rede anti-Golgi (TGN) no nível da membrana plasmática apical controla a separação e a classificação do GPI-AP (10, 45). Essa agregação é impulsionada pela oligomerização do GPI-AP (36), mas também pode depender do comprimento da cadeia de ceramida encontrada em leveduras. Embora o GPI-AP de mamíferos possua uma âncora lipídica à base de éter e sua estrutura química seja muito diferente da ceramida de cadeia acil muito longa, um estudo recente descobriu que ambos os lipídios têm propriedades físico-químicas e funções evolutivamente semelhantes (40). Portanto, a porção lipídica de éter em células de mamíferos pode ser semelhante à ceramida C26 em leveduras, e seu papel é associar-se à ceramida de cadeia longa na membrana para promover a agregação e a classificação do GPI-AP. Embora essa possibilidade ainda precise ser testada diretamente, descobertas anteriores apoiam a ideia de que o transporte da ceramida de cadeia acil longa para o complexo de Golgi não é realizado por proteínas de transferência citoplasmáticas, mas depende da síntese de âncoras GPI, como ocorre em leveduras. Portanto, o mecanismo evolutivamente conservado parece ser capaz de cotransportar seletivamente ceramida de cadeia acil muito longa e GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) na mesma vesícula de transporte.
Em sistemas de células epiteliais polarizadas de leveduras e mamíferos, a agregação e a separação de GPI-AP de outras proteínas da membrana plasmática ocorrem antes de atingirem a superfície celular. Paladino et al. (48) descobriram que, no TGN de ​​células epiteliais polarizadas de mamíferos, o agrupamento de GPI-AP não é apenas necessário para a classificação seletiva de GPI-APs na membrana plasmática apical, mas também regula a organização do agrupamento de GPI-APs e sua atividade biológica na superfície celular. Em leveduras, este estudo mostrou que o agrupamento de GPI-AP dependente de ceramida C26 no RE pode regular a organização do agrupamento e a atividade funcional de GPI-AP na membrana plasmática (24, 49). De acordo com esse modelo, as células hLag1 são alérgicas a inibidores de GPI ou a drogas que afetam a integridade da parede celular (28), e a necessidade de agrupamentos funcionais de Gas1-GFP (49) da ceramida apical projetada no acasalamento de células de levedura indica possíveis consequências fisiológicas do erro de GPI-AP nas células hLag1. No entanto, testar mais a fundo se a organização funcional da superfície celular foi programada a partir do retículo endoplasmático por um método de triagem baseado no comprimento dos lipídios será o tema de nossa pesquisa futura.
As linhagens de Saccharomyces cerevisiae utilizadas neste trabalho estão listadas na Tabela S1. As linhagens MMY1583 e MMY1635 de SCLIM para imageamento de células vivas foram construídas no fundo genético de W303. Essas linhagens, que expressam Sec13-mCherry com uma etiqueta de proteína fluorescente, foram construídas utilizando um método baseado em reação em cadeia da polimerase (PCR) com o plasmídeo pFA6a como molde (23). A linhagem que expressa Mid2-iRFP marcado com proteína fluorescente sob o controle do promotor GAL1 foi construída da seguinte forma: amplificação por PCR da sequência iRFP-KanMx do vetor pKTiRFP-KAN (gentilmente cedido por E. O'Shea, número do plasmídeo Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identificador de recurso de pesquisa (RRID): Addgene_64687) e inserção na extremidade C-terminal de Mid2 endógeno. Após a sequência do genoma Mid2-iRFP ser amplificada e clonada no promotor GAL1, ela foi integrada no sítio Not I-Sac I do plasmídeo de integração pRS306. O plasmídeo resultante, pRGS7, foi linearizado com Pst I para integração no lócus URA3.
O gene de fusão Gas1-GFP é expresso sob o controle do promotor GAL1 no plasmídeo centromérico (CEN), construído da seguinte forma. A sequência Gas1-GFP foi amplificada por PCR a partir do plasmídeo pRS416-GAS1-GFP (24) (gentilmente cedido por L. Popolo) e clonada no sítio Xma I–Xho I do plasmídeo CEN pBEVY-GL LEU2 (gentilmente cedido por C. Miller; número do plasmídeo Addgene 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). O plasmídeo resultante foi denominado pRGS6. O gene de fusão Axl2-GFP também é expresso sob o controle do promotor GAL1 do vetor pBEVY-GL LEU2, e sua construção é descrita a seguir. A sequência Axl2-GFP foi amplificada a partir do plasmídeo pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) por PCR e clonada no sítio BamHI-PstI do vetor pBEVY-GL LEU2. O plasmídeo resultante foi denominado pRGS12. A sequência dos oligonucleotídeos utilizados neste estudo está listada na Tabela S2.
A cepa foi suplementada com 0,2% de adenina e 2% de glicose [YP-dextrose (YPD)], 2% de rafinose [YP-rafinose], meio de extrato de levedura rico em proteína p (YP) (1% de extrato de levedura e 2% de proteína ept) [YPR] ou 2% de galactose [YP-galactose (YPG)] como fonte de carbono, ou em um meio mínimo sintético (0,15% de base nitrogenada para levedura e 0,5% de sulfato de amônio) para suplementar os aminoácidos e bases apropriados necessários para a nutrição, e contendo 2% de glicose (meio mínimo sintético de glicose) ou 2% de galactose (meio mínimo sintético de galactose) como fonte de carbono.
Para a obtenção de imagens em tempo real, células mutantes sec31-1 sensíveis à temperatura, expressando o constructo sob o promotor GAL1, foram cultivadas em meio YPR a 24 °C durante a noite até atingirem a fase logarítmica média. Após a indução em YPG a 24 °C por 1 hora, as células foram incubadas em SG a 37 °C por 30 minutos e, em seguida, transferidas para 24 °C para a liberação do bloqueio de secreção. A concanavalina A foi utilizada para fixar as células em uma lâmina de vidro, e as imagens foram obtidas por SCLIM. O SCLIM é uma combinação de um microscópio de fluorescência invertido Olympus IX-71 e uma lente de imersão em óleo UPlanSApo 100×1,4 de abertura numérica (Olympus), um scanner confocal de disco rotativo de alta velocidade e alta relação sinal-ruído (Yokogawa Electric), um espectrômetro personalizado e um sistema de resfriamento personalizado. O intensificador de imagem do sistema (Hamamatsu Photonics) pode fornecer um sistema de lentes de aumento com uma ampliação final de ×266,7 e uma câmera CCD que multiplica elétrons (Hamamatsu Photonics) (21). A aquisição de imagens é realizada por um software personalizado (Yokogawa Electric). Para imagens 3D, utilizamos um atuador piezoelétrico personalizado para vibrar a lente objetiva verticalmente e coletamos as partes ópticas separadas por 100 nm em uma pilha. A imagem da pilha Z é convertida em dados de voxel 3D, e a função de dispersão de ponto teórica usada para o microscópio confocal de disco rotativo é utilizada para o processamento de deconvolução pelo software Volocity (PerkinElmer). Utilizando o software Volocity para definir automaticamente o limiar para a análise de colocalização, o ERES, incluindo a carga, foi medido. A análise de varredura linear foi realizada utilizando o software MetaMorph (Molecular Devices).
Utilize o software GraphPad Prism para determinar a significância estatística. Para o teste t de Student bicaudal e para a análise de variância (ANOVA) de uma via, as diferenças entre os grupos são consideradas significativas quando P < 0,05 (*).
Para microscopia de fluorescência de Gas1-GFP, as células em fase logarítmica foram cultivadas durante a noite em YPD e coletadas por centrifugação, lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato e incubadas em gelo por pelo menos 15 minutos, e então processadas ao microscópio conforme descrito anteriormente Check (24). O microscópio Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 óleo PH3 CS) equipado com uma lente objetiva, filtro L5 (GFP), câmera Hamamatsu e software Application Suite X (LAS X) foi usado para aquisição. .
As amostras foram desnaturadas com tampão de amostra SDS a 65 °C por 10 minutos e, em seguida, separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE). Para a análise por immunoblotting, 10 μl de amostra foram aplicados em cada poço. Anticorpo primário: Utilizar anticorpo policlonal de coelho anti-Gas1 na diluição de 1:3000, anticorpo policlonal de coelho anti-Emp24 na diluição de 1:500 e anticorpo policlonal de coelho anti-GFP (gentilmente cedido por H. Riezman) na diluição de 1:3000. O anticorpo monoclonal de camundongo anti-Pgk1 foi utilizado na diluição de 1:5000 (gentilmente cedido por J. de la Cruz). Anticorpo secundário: Imunoglobulina G (IgG) de cabra anti-coelho conjugada com peroxidase de rábano (HRP) na diluição de 1:3000 (Pierce). Utilizou-se IgG anti-rato conjugada com HRP na diluição de 1:3000 (Pierce). A zona de resposta imune foi observada pelo método de quimioluminescência com o reagente SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Conforme descrito em (31), um experimento de imunoprecipitação natural foi realizado na fração ER enriquecida. Resumidamente, as células de levedura foram lavadas duas vezes com tampão TNE [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fluoreto de fenilmetilsulfonil e mistura de inibidores de protease] a 600 nm (DO600) com densidade óptica de 100. As células foram rompidas com esferas de vidro e, em seguida, os detritos celulares e as esferas de vidro foram removidos por centrifugação. O sobrenadante foi então centrifugado a 17.000 g por 15 minutos a 4 °C. O precipitado foi ressuspendido em TNE e saponina digital foi adicionada até uma concentração final de 1%. A suspensão foi incubada por 1 hora com agitação a 4 °C e, em seguida, os componentes insolúveis foram removidos por centrifugação a 13.000 g a 4 °C por 60 minutos. Para a imunoprecipitação de Gas1-GFP, primeiro pré-incube a amostra com esferas de agarose vazias (ChromoTek) a 4°C por 1 hora e, em seguida, incube com GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4°C por 3 horas. As esferas imunoprecipitadas foram lavadas cinco vezes com TNE contendo 0,2% de digoxigenina, eluídas com tampão de amostra SDS, separadas por SDS-PAGE e analisadas por immunoblotting.
Conforme descrito em (31), a determinação da reticulação foi realizada na fração ER enriquecida. Resumidamente, a fração ER enriquecida foi incubada com 0,5 mM de ditiobis(succinimidil propionato) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA; 20°C, 20 min). A reação de reticulação foi interrompida pela adição de glicina (concentração final de 50 mM, 5 minutos, 20°C).
Conforme descrito anteriormente (50), foi realizada a análise de MS da ceramida em cepas selvagens e GhLag1. Resumidamente, as células foram cultivadas até a fase exponencial (3 a 4 unidades OD600/ml) em YPD a 30°C, e 25×107 células foram coletadas. Seu metabolismo foi interrompido com ácido tricloroacético. Utilizou-se solvente de extração [etanol, água, éter, piridina e hidróxido de amônio 4,2 N (15:15:5:1:0,018 v/v)] e 1,2 nmol de ceramida C17 padrão interna (860517, Avanti polar lipid). Utilizou-se reagente de monometilamina [metanol, água, n-butanol e solução de metilamina (4:3:1:5 v/v)] para realizar a hidrólise alcalina suave do extrato e, em seguida, utilizou-se n-butanol saturado com água para dessalinizar. Por fim, o extrato foi ressuspendido em solvente para modo positivo [clorofórmio/metanol/água (2:7:1) + 5 mM de acetato de amônio] e injetado no espectrômetro de massas. O monitoramento de múltiplas reações (MRM) foi realizado para a identificação e quantificação de moléculas de esfingolipídios. O espectrômetro de massas de quadrupolo terciário TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) está equipado com uma fonte de íons de nanofluxo robótica Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) para análise de lipídios. A energia de colisão foi otimizada para cada categoria de ceramida. Os dados de MS foram obtidos no modo positivo. Para cada réplica biológica, o sinal lipídico representa a mediana de três medições independentes.
Conforme descrito em (31), as células (800×107) que expressam Gas1-GFP foram submetidas à imunoprecipitação natural. O Gas1-GFP purificado foi separado por SDS-PAGE e transferido para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF). A proteína foi visualizada pela coloração do PVDF com preto amida. A banda de Gas1-GFP foi recortada do PVDF e lavada 5 vezes com metanol e uma vez com água para cromatografia líquida-espectrometria de massas (LC-MS). Incubando-se a tira de membrana com 500 μl de NaOAc 0,3 M (pH 4,0), tampão e 500 μl de uma mistura de nitrito de sódio 1 M recém-dissolvida a 37 °C por 3 horas, a fração lipídica é liberada do Gas1-GFP e lisada. Liberação de ceramida de fosfato de inosina entre glucosamina e inositol (51). Após isso, a tira de membrana foi lavada quatro vezes com água de grau LC-MS, seca à temperatura ambiente e armazenada em atmosfera de nitrogênio a -80 °C até a análise. Como controle, uma amostra em branco de membrana de PVDF foi utilizada em cada experimento. O lipídio extraído de Gas1-GFP foi então analisado por MS conforme descrito (50). Resumidamente, as tiras de PVDF contendo o lipídio GPI foram ressuspensas em 75 μl de solvente de modo negativo [clorofórmio/metanol (1:2) + 5 mM de acetato de amônio] e submetidas à análise de espécies de esfingolipídios por ionização por eletrospray (ESI)-MRM/MS (TSQ Vantage). Nesse caso, os dados de MS foram obtidos no modo de íons negativos.
Como mencionado anteriormente, a porção lipídica da âncora GPI foi separada do GPI-AP marcado com [3H]-inositol (16). Os lipídios foram separados por cromatografia em camada fina usando um sistema de solventes (55:45:10 clorofórmio-metanol-0,25% KCl) e visualizados usando FLA-7000 (Fujifilm).
As células que expressavam Gas1-GFP (600×10⁷) foram lavadas duas vezes com tampão TNE, rompidas com esferas de vidro e centrifugadas para remover detritos celulares e as esferas. O sobrenadante foi então centrifugado a 17.000 g por 1 hora a 4 °C. O precipitado foi lavado em TNE e incubado com 1 U de PI-PLC (Invitrogen) em TNE contendo 0,2% de saponina digitalis por 1 hora a 37 °C. Após o tratamento enzimático, a membrana foi removida por centrifugação a 17.000 g a 4 °C por 1 hora. Para imunoprecipitar Gas1-GFP, o sobrenadante foi incubado com GFP-Trap_A (ChromoTek) a 4 °C durante a noite. O Gas1-GFP purificado, separado por SDS-PAGE, foi corado com azul brilhante de Coomassie. A banda de coloração Gas1-GFP foi recortada da região cinza ao redor do aqueduto e, após alquilação com iodoacetamida e redução com ditiotreitol, foi realizada digestão in-gel com tripsina. Os peptídeos trípticos e os peptídeos com glicanos GPI foram extraídos e secos. O peptídeo seco foi dissolvido em 20 μl de água. Uma alíquota (8 μl) foi injetada no sistema de cromatografia líquida (LC). Uma coluna de octadecilsilano (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diâmetro interno 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Prefeitura de Aichi, Japão) foi utilizada para separar os peptídeos sob condições específicas de gradiente. A fase móvel consistia em solvente A (0,08% de ácido fórmico) e solvente B (0,15% de ácido fórmico em 80% de acetonitrila). Um sistema HPLC Accela (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) foi utilizado para eluir a coluna com o solvente A em 55 minutos, a uma vazão de 50 μl min⁻¹ durante 5 minutos, e então a concentração do solvente B foi aumentada para 40%. O eluato foi continuamente introduzido na fonte de íons ESI, e os peptídeos trípticos e os peptídeos com glicanos GPI foram analisados ​​por LTQ Orbitrap XL (espectrômetro de massas híbrido de armadilha iônica linear-orbitrap; Thermo Fisher Scientific). Na configuração do MS, a voltagem da fonte capilar foi ajustada para 4,5 kV e a temperatura do capilar de transferência foi mantida a 300 °C. A voltagem do capilar e a voltagem da lente do tubo foram ajustadas para 15 V e 50 V, respectivamente. Os dados de MS foram obtidos no modo de íons positivos (resolução de 60.000; precisão de massa de 10 partes por milhão) em uma faixa de massa de 300/m/z e relação massa/carga (m/z) de 3000. Os dados de MS/MS foram obtidos através da armadilha de íons no LTQ Orbitrap XL [os 3 primeiros dígitos dos quais os dados dependem indicam dissociação induzida por colisão (CID)].
Simulações de dinâmica molecular (MD) foram realizadas utilizando o software GROMACS (52) e o campo de força MARTINI 2 (53-55). O construtor de membranas CHARMM GUI (56, 57) foi então utilizado para construir uma bicamada contendo dioleoilfosfatidilcolina (DOPC) e Cer C18 ou DOPC e Cer C26. A topologia e as coordenadas de Cer C26 foram derivadas do DXCE pela remoção das partículas extras da cauda de esfingosina. O processo descrito abaixo foi utilizado para balancear a bicamada e executá-la, e então as últimas coordenadas do sistema foram utilizadas para construir um sistema contendo Emp24. O domínio transmembranar da proteína Emp24 de levedura (resíduos 173 a 193) foi construído como uma α-hélice utilizando a ferramenta de estrutura molecular VMD (Visual MD Tool) (58). Em seguida, após a remoção dos lipídios sobrepostos, a proteína foi grosseiramente granulada e inserida na bicamada utilizando o CHARMM GUI. O sistema final contém 1202 moléculas de DOPC e 302 moléculas de Cer C26 ou 1197 moléculas de DOPC e 295 moléculas de Cer C18 e Emp24. Ionize o sistema até uma concentração de 0,150 M. Quatro réplicas independentes foram feitas para duas composições de bicamada.
A bicamada lipídica é balanceada usando o processo CHARMM GUI, que envolve a minimização e o balanceamento de 405.000 etapas, onde as restrições de posição são gradualmente reduzidas e eliminadas, e o intervalo de tempo é aumentado de 0,005 ps para 0,02 ps. Após o equilíbrio, são produzidos 6 µs com um intervalo de tempo de 0,02 ps. Após a inserção de Emp24, o mesmo processo CHARMM GUI é usado para minimizar e balancear o sistema, e então a simulação é executada por 8 s em produção.
Para todos os sistemas, durante o processo de balanceamento, a pressão é controlada pelo barostato de Berendsen (59) e, durante o processo de produção, pelo barostato de Parrinello-Rahman (60). Em todos os casos, a pressão média é de 1 bar e utiliza-se um esquema de acoplamento de pressão semi-isotrópico. Nos processos de balanceamento e produção, um termostato (61) com recalibração de velocidade é utilizado para acoplar a temperatura das partículas de proteína, lipídio e solvente, respectivamente. Durante toda a operação, a temperatura alvo é de 310 K. A interação não covalente é calculada gerando-se uma lista de pareamento utilizando o esquema de Verlet com tolerância de 0,005 no tampão. O termo de Coulomb é calculado utilizando o campo de reação e uma distância de corte de 1,1 nm. O termo de van der Waals utiliza um esquema de corte com uma distância de corte de 1,1 nm, e o esquema de corte de Verlet é utilizado para a deriva potencial (62).
Usando VMD, o comprimento de onda de corte entre as esferas de fosfato de DOPC ou as esferas de ceramida AM1 e a proteína é de 0,7 nm, e o número de lipídios que interagem com a proteína é calculado. De acordo com a seguinte fórmula, calcula-se o fator de depleção-enriquecimento (DE) como em (63): Fator DE = (quantidade de lipídios totais na proteína 0,7) na proteína 0,7 (quantidade de Cer nos lipídios totais)
O valor apresentado é obtido como uma média, e as barras de erro representam quatro cópias independentes do erro padrão (EP). A significância estatística do fator DE é calculada pelo teste t [(médiaDE - fator - 1)/EP]. Calcule o valor de p a partir da distribuição unilateral.
A ferramenta GROMACS foi utilizada para calcular o mapa de densidade lateral 2D do sistema contendo Emp24 nos últimos 250 ns do traçado. Para obter o mapa de enriquecimento/depleção de ceramida, o mapa de densidade de Cer é dividido pela soma dos mapas de Cer e DOPC, e então dividido pela concentração de Cer no organismo. A mesma escala de cores do mapa é utilizada.
Para acessar o material complementar deste artigo, visite http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Atribuição-NãoComercial, que permite o uso, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o uso final não seja para fins comerciais e que a obra original esteja correta. Referência.
Observação: Pedimos apenas o seu endereço de e-mail para que a pessoa que você indicar saiba que você deseja que ela veja o e-mail e que não se trata de spam. Não coletaremos nenhum endereço de e-mail.
Esta pergunta serve para verificar se você é um visitante e evitar o envio automático de spam.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako) Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Imagens tridimensionais de alta resolução em tempo real revelam a importância do comprimento da cadeia de ceramida para a triagem de proteínas em locais de saída seletivos.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Linero), Sergio Lopez (Sergio Lopez), Miho Waga (Miho Waga), Misako Arman (Misako) Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Imagens tridimensionais de alta resolução em tempo real revelam a importância do comprimento da cadeia de ceramida para a triagem de proteínas em locais de saída seletivos.
©2020 Associação Americana para o Avanço da Ciência. todos os direitos reservados. AAAS é parceira de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef e COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.