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O sulfeto de hidrogênio (H₂S) possui múltiplos efeitos fisiológicos e patológicos no corpo humano. O hidrossulfeto de sódio (NaHS) é amplamente utilizado como ferramenta farmacológica para avaliar os efeitos do H₂S em experimentos biológicos. Embora a perda de H₂S de soluções de NaHS ocorra em poucos minutos, essas soluções têm sido utilizadas como doadoras de H₂S em água potável em alguns estudos com animais. Este estudo investigou se a água potável com concentração de NaHS de 30 μM, preparada em bebedouros para ratos/camundongos, poderia permanecer estável por pelo menos 12 a 24 horas, conforme sugerido por alguns autores. Preparou-se uma solução de NaHS (30 μM) em água potável e imediatamente a vertida em bebedouros para ratos/camundongos. Amostras foram coletadas da ponta e do interior dos bebedouros nos tempos 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 e 24 horas para medir o teor de sulfeto utilizando o método do azul de metileno. Além disso, ratos machos e fêmeas foram injetados com NaHS (30 μM) durante duas semanas, e as concentrações séricas de sulfeto foram medidas em dias alternados durante a primeira semana e ao final da segunda semana. A solução de NaHS na amostra obtida da ponta do bebedouro mostrou-se instável, apresentando uma redução de 72% e 75% após 12 e 24 horas, respectivamente. Nas amostras obtidas do interior dos bebedouros, a redução de NaHS não foi significativa nas primeiras 2 horas; entretanto, houve uma redução de 47% e 72% após 12 e 24 horas, respectivamente. A injeção de NaHS não afetou os níveis séricos de sulfeto em ratos machos e fêmeas. Em conclusão, soluções de NaHS preparadas a partir da água potável não devem ser utilizadas para a doação de H₂S, devido à instabilidade da solução. Essa via de administração expõe os animais a quantidades irregulares e menores do que as esperadas de NaHS.
O sulfeto de hidrogênio (H2S) tem sido usado como toxina desde 1700; no entanto, seu possível papel como molécula de biossinalização endógena foi descrito por Abe e Kimura em 1996. Nas últimas três décadas, inúmeras funções do H2S em diversos sistemas humanos foram elucidadas, levando à constatação de que moléculas doadoras de H2S podem ter aplicações clínicas no tratamento ou controle de certas doenças; veja Chirino et al. para uma revisão recente.
O hidrossulfeto de sódio (NaHS) tem sido amplamente utilizado como ferramenta farmacológica para avaliar os efeitos do H2S em muitos estudos com culturas de células e animais5,6,7,8. No entanto, o NaHS não é um doador ideal de H2S, pois se converte rapidamente em H2S/HS- em solução, é facilmente contaminado com polissulfetos e oxida-se e volatiliza-se com facilidade4,9. Em muitos experimentos biológicos, o NaHS é dissolvido em água, resultando em volatilização passiva e perda de H2S10,11,12, oxidação espontânea de H2S11,12,13 e fotólise14. O sulfeto na solução original se perde muito rapidamente devido à volatilização do H2S11. Em um recipiente aberto, a meia-vida (t1/2) do H2S é de cerca de 5 minutos e sua concentração diminui em cerca de 13% por minuto10. Embora a perda de sulfeto de hidrogênio das soluções de NaHS leve apenas alguns minutos, alguns estudos em animais utilizaram soluções de NaHS como fonte de sulfeto de hidrogênio na água potável por 1 a 21 semanas, substituindo a solução contendo NaHS a cada 12 a 24 horas.15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 Essa prática não é consistente com os princípios da pesquisa científica, uma vez que as dosagens de medicamentos devem ser baseadas em seu uso em outras espécies, especialmente em humanos.27
A pesquisa pré-clínica em biomedicina visa melhorar a qualidade do atendimento ao paciente ou os resultados do tratamento. No entanto, os resultados da maioria dos estudos em animais ainda não foram transpostos para humanos28,29,30. Uma das razões para essa falha na transposição para humanos é a falta de atenção à qualidade metodológica dos estudos em animais30. Portanto, o objetivo deste estudo foi investigar se soluções de NaHS a 30 μM, preparadas em bebedouros para ratos/camundongos, poderiam permanecer estáveis ​​na água potável por 12 a 24 horas, conforme afirmado ou sugerido em alguns estudos.
Todos os experimentos deste estudo foram conduzidos de acordo com as diretrizes publicadas para o cuidado e uso de animais de laboratório no Irã31. Todos os relatórios experimentais deste estudo também seguiram as diretrizes ARRIVE32. O Comitê de Ética do Instituto de Ciências Endócrinas da Universidade de Ciências Médicas Shahid Beheshti aprovou todos os procedimentos experimentais deste estudo.
O acetato de zinco di-hidratado (CAS: 5970-45-6) e o cloreto férrico anidro (CAS: 7705-08-0) foram adquiridos da Biochem, Chemopharama (Cosne-sur-Loire, França). O hidrossulfeto de sódio hidratado (CAS: 207683-19-0) e a N,N-dimetil-p-fenilenodiamina (DMPD) (CAS: 535-47-0) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O isoflurano foi adquirido da Piramal (Bethlehem, PA, EUA). O ácido clorídrico (HCl) foi adquirido da Merck (Darmstadt, Alemanha).
Prepare uma solução de NaHS (30 μM) em água potável e despeje-a imediatamente nos bebedouros dos ratos/camundongos. Essa concentração foi escolhida com base em diversas publicações que utilizam NaHS como fonte de H2S; veja a seção Discussão. O NaHS é uma molécula hidratada que pode conter quantidades variáveis ​​de água de hidratação (ou seja, NaHS•xH2O); de acordo com o fabricante, a porcentagem de NaHS utilizada em nosso estudo foi de 70,7% (ou seja, NaHS•1,3 H2O), e levamos esse valor em consideração em nossos cálculos, onde utilizamos uma massa molecular de 56,06 g/mol, que é a massa molecular do NaHS anidro. A água de hidratação (também chamada de água de cristalização) são as moléculas de água que compõem a estrutura cristalina33. Os hidratos possuem propriedades físicas e termodinâmicas diferentes em comparação com os anidros34.
Antes de adicionar NaHS à água potável, meça o pH e a temperatura do solvente. Despeje imediatamente a solução de NaHS no bebedouro do rato/camundongo na gaiola do animal. Amostras foram coletadas da ponta e do interior do bebedouro em 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12 e 24 horas para medir o teor de sulfeto. As medições de sulfeto foram feitas imediatamente após cada coleta. Obtivemos amostras da ponta do tubo porque alguns estudos mostraram que o pequeno tamanho dos poros do tubo de água pode minimizar a evaporação de H2S15,19. Esse problema parece se aplicar também à solução no interior do bebedouro. No entanto, isso não ocorreu com a solução no gargalo do bebedouro, que apresentou uma taxa de evaporação maior e sofreu auto-oxidação; na verdade, os animais beberam essa água primeiro.
Ratos Wistar machos e fêmeas foram utilizados no estudo. Os ratos foram alojados em gaiolas de polipropileno (2–3 ratos por gaiola) em condições padrão (temperatura de 21–26 °C, umidade de 32–40%) com 12 horas de luz (das 7h às 19h) e 12 horas de escuridão (das 19h às 7h). Os ratos tiveram livre acesso à água da torneira e foram alimentados com ração padrão (Khorak Dam Pars Company, Teerã, Irã). Ratos Wistar fêmeas (n=10, peso corporal: 190–230 g) e machos (n=10, peso corporal: 320–370 g) com idade correspondente (6 meses) foram divididos aleatoriamente em grupos controle e tratados com NaHS (30 μM) (n=5 por grupo). Para determinar o tamanho da amostra, utilizamos a abordagem KISS (Keep It Simple, Stupid), que combina experiência prévia e análise de poder estatístico35. Inicialmente, realizamos um estudo piloto com 3 ratos e determinamos o nível médio de sulfeto total no soro e o desvio padrão (8,1 ± 0,81 μM). Em seguida, considerando um poder de 80% e assumindo um nível de significância bilateral de 5%, determinamos um tamanho amostral preliminar (n = 5, com base em literatura prévia) que correspondesse a um tamanho de efeito padronizado de 2,02, com o valor predefinido sugerido por Festing para o cálculo do tamanho amostral de animais experimentais³⁵. Após multiplicar esse valor pelo desvio padrão (2,02 × 0,81), o tamanho de efeito detectável previsto (1,6 μM) foi de 20%, o que é aceitável. Isso significa que n = 5/grupo é suficiente para detectar uma mudança média de 20% entre os grupos. Os ratos foram divididos aleatoriamente em grupos controle e tratados com NaSH usando a função aleatória do software Excel³⁶ (Figura Suplementar 1). O mascaramento foi realizado no nível do desfecho, e os pesquisadores que realizaram as medições bioquímicas desconheciam a alocação dos grupos.
Os grupos NaHS de ambos os sexos foram tratados com uma solução de NaHS a 30 μM preparada na água potável durante 2 semanas; a solução foi renovada a cada 24 horas, período em que o peso corporal foi medido. Amostras de sangue foram coletadas da ponta da cauda de todos os ratos sob anestesia com isoflurano em dias alternados, ao final da primeira e da segunda semana. As amostras de sangue foram centrifugadas a 3000 g por 10 minutos, o soro foi separado e armazenado a –80 °C para posterior dosagem de ureia, creatinina (Cr) e sulfeto total séricos. A ureia sérica foi determinada pelo método enzimático da urease e a creatinina sérica pelo método fotométrico de Jaffé, utilizando kits comerciais (Man Company, Teerã, Irã) e um analisador automático (Selectra E, número de série 0-2124, Holanda). Os coeficientes de variação intra e interensaio para ureia e Cr foram inferiores a 2,5%.
O método do azul de metileno (AM) é utilizado para medir o sulfeto total em água potável e soro contendo NaHS; o AM é o método mais comumente usado para medir sulfeto em soluções e amostras biológicas^11,37. O método do AM pode ser usado para estimar o pool total de sulfeto³⁸ e medir sulfetos inorgânicos na forma de H₂S, HS^- e S₂ na fase aquosa³⁹. Neste método, o enxofre é precipitado como sulfeto de zinco (ZnS) na presença de acetato de zinco^11,38. A precipitação com acetato de zinco é o método mais amplamente utilizado para separar sulfetos de outros cromóforos¹¹. O ZnS foi redissolvido usando HCl¹¹ em condições fortemente ácidas. O sulfeto reage com DMPD em uma proporção estequiométrica de 1:2 em uma reação catalisada por cloreto férrico (Fe³⁺ atua como agente oxidante) para formar o corante AM, que é detectado espectrofotometricamente a 670 nm^40,41. O limite de detecção do método MB é de aproximadamente 1 μM11.
Neste estudo, 100 μL de cada amostra (solução ou soro) foram adicionados a um tubo; em seguida, foram adicionados 200 μL de acetato de zinco (1% p/v em água destilada), 100 μL de DMPD (20 mM em HCl 7,2 M) e 133 μL de FeCl₃ (30 mM em HCl 1,2 M). A mistura foi incubada a 37 °C no escuro por 30 min. A solução foi centrifugada a 10.000 g por 10 min e a absorbância do sobrenadante foi lida a 670 nm usando um leitor de microplacas (BioTek, MQX2000R2, Winooski, VT, EUA). As concentrações de sulfeto foram determinadas usando uma curva de calibração de NaHS (0–100 μM) em água destilada (Figura Suplementar 2). Todas as soluções utilizadas para as medições foram preparadas recentemente. Os coeficientes de variação intra e interensaio para as medições de sulfeto foram de 2,8% e 3,4%, respectivamente. Também determinamos o sulfeto total recuperado de amostras de água potável e soro contendo tiossulfato de sódio usando o método de amostra fortificada42. As recuperações para amostras de água potável e soro contendo tiossulfato de sódio foram de 91 ± 1,1% (n = 6) e 93 ± 2,4% (n = 6), respectivamente.
A análise estatística foi realizada utilizando o software GraphPad Prism versão 8.0.2 para Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, EUA, www.graphpad.com). O teste t pareado foi utilizado para comparar a temperatura e o pH da água potável antes e depois da adição de NaHS. A perda de H₂S na solução contendo NaHS foi calculada como uma diminuição percentual em relação à captação basal e, para avaliar se a perda foi estatisticamente significativa, realizamos uma ANOVA de medidas repetidas de uma via, seguida pelo teste de comparações múltiplas de Dunnett. O peso corporal, a ureia sérica, a creatinina sérica e o sulfeto sérico total ao longo do tempo foram comparados entre ratos do grupo controle e ratos tratados com NaHS de diferentes sexos, utilizando uma ANOVA mista de duas vias (entre e dentro) seguida pelo teste post hoc de Bonferroni. Valores de p bicaudais < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
O pH da água potável era de 7,60 ± 0,01 antes da adição de NaHS e de 7,71 ± 0,03 após a adição de NaHS (n = 13, p = 0,0029). A temperatura da água potável era de 26,5 ± 0,2 °C e diminuiu para 26,2 ± 0,2 °C após a adição de NaHS (n = 13, p = 0,0128). Prepare uma solução de NaHS a 30 μM em água potável e armazene-a em uma garrafa. A solução de NaHS é instável e sua concentração diminui com o tempo. Ao coletar amostras do gargalo da garrafa, observou-se uma diminuição significativa (68,0%) na primeira hora, e o teor de NaHS na solução diminuiu 72% e 75% após 12 e 24 horas, respectivamente. Nas amostras obtidas de garrafas de água, a redução de NaHS não foi significativa até 2 horas, mas após 12 e 24 horas diminuiu em 47% e 72%, respectivamente. Esses dados indicam que a porcentagem de NaHS em uma solução de 30 μM preparada em água potável diminuiu para aproximadamente um quarto do valor inicial após 24 horas, independentemente do local de amostragem (Figura 1).
Estabilidade da solução de NaHS (30 μM) na água potável em garrafas para ratos/camundongos. Após o preparo da solução, amostras foram coletadas da ponta e do interior da garrafa. Os dados são apresentados como média ± DP (n = 6/grupo). * e #, P < 0,05 em comparação com o tempo 0. A fotografia da garrafa mostra a ponta (com a abertura) e o corpo da garrafa. O volume da ponta é de aproximadamente 740 μL.
A concentração de NaHS na solução recém-preparada de 30 μM foi de 30,3 ± 0,4 μM (variação: 28,7–31,9 μM, n = 12). No entanto, após 24 h, a concentração de NaHS diminuiu para um valor mais baixo (média: 3,0 ± 0,6 μM). Como mostrado na Figura 2, as concentrações de NaHS às quais os ratos foram expostos não foram constantes durante o período do estudo.
O peso corporal das ratas aumentou significativamente ao longo do tempo (de 205,2 ± 5,2 g para 213,8 ​​± 7,0 g no grupo controle e de 204,0 ± 8,6 g para 211,8 ± 7,5 g no grupo tratado com NaHS); entretanto, o tratamento com NaHS não teve efeito sobre o peso corporal (Fig. 3). O peso corporal dos ratos machos aumentou significativamente ao longo do tempo (de 338,6 ± 8,3 g para 352,4 ± 6,0 g no grupo controle e de 352,4 ± 5,9 g para 363,2 ± 4,3 g no grupo tratado com NaHS); entretanto, o tratamento com NaHS não teve efeito sobre o peso corporal (Fig. 3).
Alterações no peso corporal de ratos machos e fêmeas após administração de NaHS (30 μM). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) e foram comparados utilizando análise de variância mista (dentro-entre) de dois fatores com teste post hoc de Bonferroni. n = 5 de cada sexo em cada grupo.
As concentrações séricas de ureia e creatina fosfato foram comparáveis ​​nos ratos do grupo controle e nos ratos tratados com NaSH ao longo do estudo. Além disso, o tratamento com NaSH não afetou as concentrações séricas de ureia e creatina fosfato (Tabela 1).
As concentrações basais de sulfeto total no soro foram comparáveis ​​entre os ratos machos (8,1 ± 0,5 μM vs. 9,3 ± 0,2 μM) e fêmeas (9,1 ± 1,0 μM vs. 6,1 ± 1,1 μM) do grupo controle e os tratados com NaHS. A administração de NaHS por 14 dias não teve efeito sobre os níveis de sulfeto total no soro de ratos machos ou fêmeas (Fig. 4).
Alterações nas concentrações séricas de sulfeto total em ratos machos e fêmeas após administração de NaHS (30 μM). Os dados são apresentados como média ± erro padrão da média (EPM) e foram comparados utilizando análise de variância mista (intra-intra) de dois fatores com teste post hoc de Bonferroni. Cada sexo, n = 5/grupo.
A principal conclusão deste estudo é que a água potável contendo NaHS é instável: apenas cerca de um quarto do teor total inicial de sulfeto pode ser detectado 24 horas após a coleta de amostras na ponta e no interior de garrafas de água para ratos/camundongos. Além disso, os ratos foram expostos a concentrações instáveis ​​de NaHS devido à perda de H₂S na solução de NaHS, e a adição de NaHS à água potável não afetou o peso corporal, a ureia e a creatina séricas, o cromo ou o sulfeto sérico total.
Neste estudo, a taxa de perda de H2S de soluções de NaHS 30 μM preparadas em água potável foi de aproximadamente 3% por hora. Em uma solução tamponada (sulfeto de sódio 100 μM em PBS 10 mM, pH 7,4), a concentração de sulfeto diminuiu 7% ao longo de 8 horas.11 Anteriormente, defendemos a administração intraperitoneal de NaHS, relatando que a taxa de perda de sulfeto de uma solução de NaHS 54 μM em água potável foi de aproximadamente 2,3% por hora (4%/hora nas primeiras 12 horas e 1,4%/hora nas últimas 12 horas após o preparo).8 Estudos anteriores43 encontraram uma perda constante de H2S de soluções de NaHS, principalmente devido à volatilização e oxidação. Mesmo sem a adição de bolhas, o sulfeto na solução estoque é rapidamente perdido devido à volatilização do H2S.11 Estudos demonstraram que, durante o processo de diluição, que leva cerca de 30 a 60 segundos, aproximadamente 5 a 10% do H2S se perde por evaporação6. Para evitar a evaporação do H2S da solução, pesquisadores adotaram diversas medidas, incluindo agitação suave da solução12, cobertura da solução estoque com filme plástico6 e minimização da exposição da solução ao ar, visto que a taxa de evaporação do H2S depende da interface ar-líquido.13 A oxidação espontânea do H2S ocorre principalmente devido a íons de metais de transição, especialmente o ferro férrico, que são impurezas na água.13 A oxidação do H2S resulta na formação de polissulfetos (átomos de enxofre ligados por ligações covalentes)11. Para evitar sua oxidação, soluções contendo H2S são preparadas em solventes desoxigenados44,45 e, em seguida, purgadas com argônio ou nitrogênio por 20–30 min para garantir a desoxigenação.11,12,37,44,45,46 O ácido dietilenotriaminopentaacético (DTPA) é um quelante de metais (10–4 M) que impede a auto-oxidação do HS- em soluções aeróbicas. Na ausência de DTPA, a taxa de auto-oxidação do HS- é de aproximadamente 50% em cerca de 3 h a 25 °C37,47. Além disso, como a oxidação do sulfeto de 1 elétron é catalisada pela luz ultravioleta, a solução deve ser armazenada em gelo e protegida da luz11.
Como mostrado na Figura 5, o NaHS dissocia-se em Na+ e HS-6 quando dissolvido em água; essa dissociação é determinada pelo pK1 da reação, que é dependente da temperatura: pK1 = 3,122 + 1132/T, onde T varia de 5 a 30 °C e é medida em graus Kelvin (K), K = °C + 273,1548. O HS- possui um pK2 elevado (pK2 = 19), portanto, em pH < 96,49, o HS- não é formado ou é formado em quantidades muito pequenas. Em contraste, o HS- atua como uma base e aceita H+ de uma molécula de H2O, e a H2O atua como um ácido e é convertida em H2S e OH-.
Formação de gás H2S dissolvido em solução de NaHS (30 µM). aq, solução aquosa; g, gás; l, líquido. Todos os cálculos assumem pH da água = 7,0 e temperatura da água = 20 °C. Criado com BioRender.com.
Apesar das evidências de que as soluções de NaHS são instáveis, diversos estudos em animais utilizaram soluções de NaHS na água potável como um composto doador de H2S15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26, com durações de intervenção variando de 1 a 21 semanas (Tabela 2). Durante esses estudos, a solução de NaHS foi renovada a cada 12 h, 15, 17, 18, 24, 25 h ou 24 h, 19, 20, 21, 22, 23 h. Nossos resultados mostraram que os ratos foram expostos a concentrações instáveis ​​do fármaco devido à perda de H2S da solução de NaHS, e o teor de NaHS na água potável dos ratos flutuou significativamente ao longo de 12 ou 24 h (ver Figura 2). Dois desses estudos relataram que os níveis de H2S na água permaneceram estáveis ​​por 24 h22 ou que apenas 2–3% de perdas de H2S foram observadas em 12 h15, mas não forneceram dados de suporte ou detalhes de medição. Dois estudos mostraram que o pequeno diâmetro das garrafas de água pode minimizar a evaporação de H2S15,19. No entanto, nossos resultados mostraram que isso pode apenas atrasar a perda de H2S de uma garrafa de água em 2 h, em vez de 12–24 h. Ambos os estudos observam que assumimos que o nível de NaHS na água potável não mudou porque não observamos uma mudança de cor na água; portanto, a oxidação do H2S pelo ar não foi significativa19,20. Surpreendentemente, esse método subjetivo avalia a estabilidade do NaHS na água em vez de medir a mudança em sua concentração ao longo do tempo.
A perda de H2S em solução de NaHS está relacionada ao pH e à temperatura. Como observado em nosso estudo, a dissolução de NaHS em água resulta na formação de uma solução alcalina50. Quando o NaHS é dissolvido em água, a formação de gás H2S dissolvido depende do valor do pH6. Quanto menor o pH da solução, maior a proporção de NaHS presente como moléculas de gás H2S e maior a perda de sulfeto da solução aquosa11. Nenhum desses estudos relatou o pH da água potável utilizada como solvente para o NaHS. De acordo com as recomendações da OMS, adotadas pela maioria dos países, o pH da água potável deve estar na faixa de 6,5 a 8,551. Nessa faixa de pH, a taxa de oxidação espontânea do H2S aumenta aproximadamente dez vezes13. A dissolução de NaHS em água nessa faixa de pH resultará em uma concentração de gás H2S dissolvido de 1 a 22,5 μM, o que enfatiza a importância de monitorar o pH da água antes de dissolver o NaHS. Além disso, a faixa de temperatura relatada no estudo acima (18–26 °C) resultaria em uma mudança na concentração de gás H2S dissolvido na solução de aproximadamente 10%, uma vez que as mudanças de temperatura alteram o pK1, e pequenas mudanças no pK1 podem ter um impacto significativo na concentração de gás H2S dissolvido48. Além disso, a longa duração de alguns estudos (5 meses)22, durante a qual se espera grande variabilidade de temperatura, também agrava esse problema.
Todos os estudos, exceto um²¹, utilizaram solução de NaHS a 30 μM em água potável. Para justificar a dose utilizada (30 μM), alguns autores apontaram que o NaHS na fase aquosa produz exatamente a mesma concentração de gás H₂S e que a faixa fisiológica de H₂S é de 10 a 100 μM, portanto, essa dose está dentro da faixa fisiológica¹⁵,¹⁶. Outros explicaram que 30 μM de NaHS podem manter o nível plasmático de H₂S dentro da faixa fisiológica, ou seja, de 5 a 300 μM¹⁹,²⁰. Consideramos a concentração de NaHS em água de 30 μM (pH = 7,0, T = 20 °C), que foi utilizada em alguns estudos para investigar os efeitos do H₂S. Podemos calcular que a concentração de gás H₂S dissolvido é de 14,7 μM, o que corresponde a cerca de 50% da concentração inicial de NaHS. Esse valor é semelhante ao calculado por outros autores nas mesmas condições¹³,⁴⁸.
Em nosso estudo, a administração de NaHS não alterou o peso corporal; esse resultado é consistente com os resultados de outros estudos em camundongos machos22,23 e ratos machos18; entretanto, dois estudos relataram que o NaSH restaurou o peso corporal reduzido em ratos nefrectomizados24,26, enquanto outros estudos não relataram o efeito da administração de NaSH sobre o peso corporal15,16,17,19,20,21,25. Além disso, em nosso estudo, a administração de NaSH não afetou os níveis séricos de ureia e creatina, o que é consistente com os resultados de outro estudo25.
O estudo constatou que a adição de NaHS à água potável durante 2 semanas não afetou as concentrações totais de sulfeto sérico em ratos machos e fêmeas. Essa descoberta é consistente com os resultados de Sen et al. (16): 8 semanas de tratamento com 30 μM de NaHS na água potável não afetaram os níveis de sulfeto plasmático em ratos controle; no entanto, eles relataram que essa intervenção restaurou os níveis reduzidos de H2S no plasma de camundongos nefrectomizados. Li et al. (22) também relataram que o tratamento com 30 μM de NaHS na água potável durante 5 meses aumentou os níveis de sulfeto livre no plasma de camundongos idosos em cerca de 26%. Outros estudos não relataram alterações no sulfeto circulante após a adição de NaHS à água potável.
Sete estudos relataram o uso de NaHS da Sigma15,16,19,20,21,22,23, mas não forneceram mais detalhes sobre a água de hidratação, e cinco estudos não mencionaram a fonte de NaHS utilizada em seus métodos de preparação17,18,24,25,26. O NaHS é uma molécula hidratada e seu teor de água de hidratação pode variar, o que afeta a quantidade de NaHS necessária para preparar uma solução de determinada molaridade. Por exemplo, o teor de NaHS em nosso estudo foi NaHS•1,3 H2O. Assim, as concentrações reais de NaHS nesses estudos podem ser menores do que as relatadas.
“Como um composto com uma vida tão curta pode ter um efeito tão duradouro?” Pozgay et al.21 fizeram essa pergunta ao avaliar os efeitos do NaHS na colite em camundongos. Eles esperam que estudos futuros possam responder a essa pergunta e especulam que as soluções de NaHS podem conter polissulfetos mais estáveis, além do H2S e dos dissulfetos que medeiam o efeito do NaHS21. Outra possibilidade é que concentrações muito baixas de NaHS remanescentes na solução também possam ter um efeito benéfico. De fato, Olson et al. forneceram evidências de que níveis micromolares de H2S no sangue não são fisiológicos e devem estar na faixa nanomolar ou totalmente ausentes13. O H2S pode agir por meio da sulfatação de proteínas, uma modificação pós-translacional reversível que afeta a função, a estabilidade e a localização de muitas proteínas52,53,54. De fato, em condições fisiológicas, aproximadamente 10% a 25% de muitas proteínas hepáticas são sulfiladas53. Ambos os estudos reconhecem a rápida destruição do NaHS19,23 mas, surpreendentemente, afirmam que “controlamos a concentração de NaHS na água potável, substituindo-a diariamente”.23 Um dos estudos afirmou, acidentalmente, que “o NaHS é um doador padrão de H2S e é comumente usado na prática clínica para substituir o próprio H2S”.18
A discussão acima mostra que o NaHS se perde da solução por volatilização, oxidação e fotólise e, portanto, algumas sugestões são feitas para reduzir a perda de H2S da solução. Primeiro, a evaporação do H2S depende da interface gás-líquido13 e do pH da solução11; portanto, para minimizar a perda por evaporação, o gargalo da garrafa de água pode ser feito o menor possível, como descrito anteriormente15,19, e o pH da água pode ser ajustado para um limite superior aceitável (ou seja, 6,5–8,551) para minimizar a perda por evaporação11. Segundo, a oxidação espontânea do H2S ocorre devido aos efeitos do oxigênio e à presença de íons de metais de transição na água potável13, portanto, a desoxigenação da água potável com argônio ou nitrogênio44,45 e o uso de quelantes de metais37,47 podem reduzir a oxidação dos sulfetos. Terceiro, para evitar a fotodecomposição do H2S, as garrafas de água podem ser envolvidas com papel alumínio; Essa prática também se aplica a materiais fotossensíveis, como a estreptozotocina55. Por fim, os sais de sulfeto inorgânico (NaHS, Na2S e CaS) podem ser administrados por gavagem em vez de dissolvidos na água potável, como relatado anteriormente56,57,58; estudos demonstraram que o sulfeto de sódio radioativo administrado por gavagem a ratos é bem absorvido e distribuído para praticamente todos os tecidos59. Até o momento, a maioria dos estudos administrou sais de sulfeto inorgânico por via intraperitoneal; no entanto, essa via raramente é utilizada em contextos clínicos60. Por outro lado, a via oral é a via de administração mais comum e preferida em humanos61. Portanto, recomendamos avaliar os efeitos dos doadores de H2S em roedores por gavagem oral.
Uma limitação é que medimos o sulfeto em solução aquosa e soro usando o método MB. Os métodos para medir sulfeto incluem titulação com iodo, espectrofotometria, métodos eletroquímicos (potenciometria, amperometria, método coulométrico e método amperométrico) e cromatografia (cromatografia gasosa e cromatografia líquida de alta eficiência), dentre os quais o método espectrofotométrico MB é o mais comumente usado⁶². Uma limitação do método MB para medir H₂S em amostras biológicas é que ele mede todos os compostos contendo enxofre e não o H₂S livre⁶³, pois é realizado em condições ácidas, o que resulta na extração do enxofre da fonte biológica⁶⁴. No entanto, de acordo com a Associação Americana de Saúde Pública, o MB é o método padrão para medir sulfeto em água⁶⁵. Portanto, essa limitação não afeta nossos principais resultados sobre a instabilidade de soluções contendo NaHS. Além disso, em nosso estudo, a recuperação das medições de sulfeto em amostras de água e soro contendo NaHS foi de 91% e 93%, respectivamente. Esses valores estão de acordo com as faixas relatadas anteriormente (77–92)66, indicando precisão analítica aceitável42. Vale ressaltar que utilizamos ratos machos e fêmeas, em conformidade com as diretrizes dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH), para evitar a dependência excessiva de estudos com animais exclusivamente machos em estudos pré-clínicos67 e para incluir ratos machos e fêmeas sempre que possível68. Esse ponto foi enfatizado por outros autores69,70,71.
Em conclusão, os resultados deste estudo indicam que soluções de NaHS preparadas a partir de água potável não podem ser utilizadas para gerar H2S devido à sua instabilidade. Essa via de administração exporia os animais a níveis instáveis ​​e inferiores aos esperados de NaHS; portanto, os resultados podem não ser aplicáveis ​​a humanos.
Os conjuntos de dados utilizados e/ou analisados ​​durante o presente estudo estão disponíveis mediante solicitação razoável ao autor correspondente.
Szabo, K. Cronologia da pesquisa sobre sulfeto de hidrogênio (H2S): de toxina ambiental a mediador biológico. Bioquímica e Farmacologia 149, 5–19. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2017.09.010 (2018).
Abe, K. e Kimura, H. Possível papel do sulfeto de hidrogênio como um neuromodulador endógeno. Journal of Neuroscience, 16, 1066–1071. https://doi.org/10.1523/JNEUROSCI.16-03-01066.1996 (1996).
Chirino, G., Szabo, C. e Papapetropoulos, A. Papel fisiológico do sulfeto de hidrogênio em células, tecidos e órgãos de mamíferos. Reviews in Physiology and Molecular Biology 103, 31–276. https://doi.org/10.1152/physrev.00028.2021 (2023).
Dillon, KM, Carrazzone, RJ, Matson, JB e Kashfi, K. Promessa crescente de sistemas de administração celular para óxido nítrico e sulfeto de hidrogênio: uma nova era da medicina personalizada. Bioquímica e Farmacologia 176, 113931. https://doi.org/10.1016/j.bcp.2020.113931 (2020).
Sun, X., et al. A administração a longo prazo de um doador de sulfeto de hidrogênio de liberação lenta pode prevenir a lesão de isquemia/reperfusão miocárdica. Scientific reports 7, 3541. https://doi.org/10.1038/s41598-017-03941-0 (2017).
Sitdikova, GF, Fuchs, R., Kainz, W., Weiger, TM e Hermann, A. A fosforilação do canal BK regula a sensibilidade ao sulfeto de hidrogênio (H2S). Frontiers in Physiology 5, 431. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00431 (2014).
Sitdikova, GF, Weiger, TM e Hermann, A. O sulfeto de hidrogênio aumenta a atividade do canal de potássio ativado por cálcio (BK) em células tumorais da hipófise de ratos. Archit. Pfluegers. 459, 389–397. https://doi.org/10.1007/s00424-009-0737-0 (2010).
Jeddy, S., et al. O sulfeto de hidrogênio aumenta o efeito protetor do nitrito contra a lesão de isquemia-reperfusão miocárdica em ratos diabéticos tipo 2. Nitric Oxide 124, 15–23. https://doi.org/10.1016/j.niox.2022.04.004 (2022).
Corvino, A., et al. Tendências na química do doador de H2S e seu impacto na doença cardiovascular. Antioxidants 10, 429. https://doi.org/10.3390/antiox10030429 (2021).
DeLeon, ER, Stoy, GF e Olson, KR (2012). Perdas passivas de sulfeto de hidrogênio em experimentos biológicos. Bioquímica Analítica 421, 203–207. https://doi.org/10.1016/j.ab.2011.10.016 (2012).
Nagy, P., et al. Aspectos químicos das medições de sulfeto de hidrogênio em amostras fisiológicas. Biochimica et Biophysical Acta 1840, 876–891. https://doi.org/10.1016/j.bbagen.2013.05.037 (2014).
Kline, LL.D. Determinação espectrofotométrica de sulfeto de hidrogênio em águas naturais. Limnol. Oceanogr. 14, 454–458. https://doi.org/10.4319/lo.1969.14.3.0454 (1969).
Olson, KR (2012). Treinamento prático na química e biologia do sulfeto de hidrogênio. “Antioxidantes”. Sinalização Redox. 17, 32–44. https://doi.org/10.1089/ars.2011.4401 (2012).