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A poluição por cádmio (Cd) representa uma ameaça ao cultivo da planta medicinal Panax notoginseng na província de Yunnan. Sob condições de estresse exógeno por Cd, um experimento de campo foi conduzido para compreender o efeito da aplicação de cal (0,750, 2250 e 3750 kg bm-2) e da pulverização com ácido oxálico (0, 0,1 e 0,2 mol l-1) sobre o acúmulo de Cd e a ação antioxidante dos componentes sistêmicos e medicinais que afetam o Panax notoginseng. Os resultados mostraram que a cal viva e a pulverização foliar com ácido oxálico podem aumentar os níveis de Ca2+ no Panax notoginseng sob estresse por Cd e reduzir a toxicidade do Cd2+. A adição de cal e ácido oxálico aumentou a atividade de enzimas antioxidantes e alterou o metabolismo de osmorreguladores. A atividade da catalase (CAT) aumentou significativamente, 2,77 vezes. A atividade da superóxido dismutase (SOD) aumentou 1,78 vezes quando tratada com ácido oxálico. O teor de malondialdeído (MDA) diminuiu 58,38%. Existe uma correlação muito significativa com açúcar solúvel, aminoácidos livres, prolina e proteína solúvel. O calcário e o ácido oxálico podem aumentar os íons de cálcio (Ca2+), diminuir o cádmio (Cd), melhorar a tolerância ao estresse em Panax notoginseng e aumentar a produção total de saponinas e flavonoides. O teor de Cd foi o mais baixo, 68,57% menor que no controle, o que corresponde ao valor padrão (Cd ≤ 0,5 mg/kg, GB/T 19086-2008). A proporção de saponinas solúveis (SPN) foi de 7,73%, atingindo o nível mais alto entre os tratamentos, e o teor de flavonoides aumentou significativamente em 21,74%, atingindo o valor padrão para o medicamento e o melhor rendimento.
O cádmio (Cd), um contaminante comum em solos cultivados, migra facilmente e apresenta toxicidade biológica significativa¹. El Shafei et al.² relataram que a toxicidade do Cd afeta a qualidade e a produtividade das plantas utilizadas. Nos últimos anos, o fenômeno do excesso de cádmio no solo de terras cultivadas no sudoeste da China tornou-se muito grave. A província de Yunnan é considerada o Reino da Biodiversidade da China, com espécies de plantas medicinais em primeiro lugar no país. No entanto, os ricos recursos minerais da província de Yunnan inevitavelmente levam à contaminação do solo por metais pesados ​​durante o processo de mineração, o que afeta a produção de plantas medicinais locais.
Panax notoginseng (Burkill) Chen3 é uma planta medicinal perene muito valiosa, pertencente ao gênero Panax ginseng, da família Araliaceae. A raiz de Panax notoginseng promove a circulação sanguínea, elimina a estase sanguínea e alivia a dor. O principal local de produção é a Prefeitura de Wenshan, Província de Yunnan. A contaminação por cádmio (Cd) estava presente em mais de 75% da área do solo na região de plantio de Panax notoginseng e ultrapassou 81-100% em vários locais. O efeito tóxico do Cd também reduz significativamente a produção de componentes medicinais do Panax notoginseng, especialmente saponinas e flavonoides. As saponinas são uma classe de agliconas, entre as quais se incluem os triterpenoides ou espirosteranos, que são os principais ingredientes ativos de muitas ervas medicinais chinesas e contêm saponinas. Algumas saponinas também possuem valiosas atividades biológicas, como atividade antibacteriana, antipirética, sedativa e anticancerígena. Os flavonoides referem-se, de forma geral, a uma série de compostos em que dois anéis benzênicos com grupos hidroxila fenólicos estão ligados por três átomos de carbono centrais, sendo o principal deles a 2-fenilcromanona-8. Trata-se de um potente antioxidante, capaz de eliminar eficazmente os radicais livres de oxigênio em plantas, inibir a secreção de enzimas biológicas inflamatórias, promover a cicatrização de feridas e o alívio da dor, além de reduzir os níveis de colesterol. É um dos principais ingredientes ativos do Panax ginseng. Resolver o problema da contaminação do solo por cádmio nas áreas de produção do Panax notoginseng é uma condição necessária para garantir a produção de seus principais componentes medicinais.
A cal é um dos passivadores comuns para fixar a contaminação do solo por cádmio in situ. Ela afeta a adsorção e a deposição de Cd no solo e reduz a atividade biológica do Cd no solo, aumentando o pH e alterando a capacidade de troca catiônica (CTC), a saturação de sais (SS) e o potencial redox (Eh) do solo. Além disso, a cal fornece uma grande quantidade de Ca2+, que forma antagonismo iônico com o Cd2+, compete pelos sítios de adsorção nas raízes, impede o transporte de Cd para a parte aérea e apresenta baixa toxicidade biológica. Com a adição de 50 mmol l-1 de Ca sob estresse de Cd, o transporte de Cd nas folhas de gergelim foi inibido e o acúmulo de Cd foi reduzido em 80%. Numerosos estudos relacionados foram relatados em arroz (Oryza sativa L.) e outras culturas.
A pulverização foliar de culturas para controlar o acúmulo de metais pesados ​​é um método recente de lidar com esses metais. O princípio está relacionado principalmente à reação de quelação nas células vegetais, que causa a deposição de metais pesados ​​na parede celular e inibe a absorção desses metais pelas plantas^14,15. Como um agente quelante estável de ácido dicarboxílico, o ácido oxálico pode quelar diretamente íons de metais pesados ​​nas plantas, reduzindo assim a toxicidade. Estudos demonstraram que o ácido oxálico na soja pode quelar Cd²⁺ e liberar cristais contendo cádmio através das células apicais dos tricomas, reduzindo os níveis de Cd²⁺ no organismo¹⁶. O ácido oxálico pode regular o pH do solo, aumentar as atividades da superóxido dismutase (SOD), peroxidase (POD) e catalase (CAT) e regular a infiltração de açúcares solúveis, proteínas solúveis, aminoácidos livres e prolina. Ele atua como modulador metabólico^17,18. Substâncias ácidas e excesso de Ca2+ em plantas oxalato formam precipitados de oxalato de cálcio sob a ação de proteínas germinativas. A regulação da concentração de Ca2+ nas plantas pode regular eficazmente o ácido oxálico dissolvido e o Ca2+ nas plantas e evitar o acúmulo excessivo de ácido oxálico e Ca2+19,20.
A quantidade de calcário aplicada é um dos principais fatores que afetam o efeito da restauração. Foi estabelecido que o consumo de calcário varia de 750 a 6000 kg·h·m−2. Para solos ácidos com pH 5,0-5,5, o efeito da aplicação de calcário em uma dose de 3000-6000 kg·h·m-2 foi significativamente maior do que em uma dosagem de 750 kg·h·m-221. No entanto, a aplicação excessiva de calcário pode causar alguns efeitos negativos no solo, como grandes alterações no pH e compactação do solo22. Portanto, definimos os níveis de tratamento com CaO como 0, 750, 2250 e 3750 kg·h·m−2. Quando o ácido oxálico foi aplicado em Arabidopsis, observou-se uma redução significativa de Ca2+ a 10 mM L-1, e a família de genes CRT, que influencia a sinalização de Ca2+, apresentou forte resposta20. A acumulação de alguns estudos anteriores permitiu-nos determinar a concentração deste experimento e continuar a estudar a interação de aditivos exógenos no Ca2+ e Cd2+23,24,25. Assim, este estudo visa investigar o mecanismo regulatório dos efeitos da aplicação tópica de cal e da pulverização foliar de ácido oxálico no teor de Cd e na tolerância ao estresse do Panax notoginseng em solos contaminados com Cd, e explorar ainda mais as melhores formas de garantir a qualidade medicinal do Panax notoginseng. Isso fornece informações valiosas para orientar a expansão do cultivo de plantas herbáceas em solos contaminados com cádmio e o fornecimento de produção sustentável e de alta qualidade para atender à demanda do mercado por medicamentos.
Utilizando a variedade local de notoginseng Wenshan como material, um experimento de campo foi conduzido em Lannizhai (24°11′N, 104°3′E, altitude 1446m), Condado de Qiubei, Prefeitura de Wenshan, Província de Yunnan. A temperatura média anual é de 17°C e a precipitação média anual é de 1250 mm. Valores de referência do solo estudado: NT 0,57 g kg-1, PT 1,64 g kg-1, CT 16,31 g kg-1, UR 31,86 g kg-1, N hidrolisado alcalino 88,82 mg kg-1, P efetivo 18,55 mg kg-1, K disponível 100,37 mg kg-1, Cd total 0,3 mg kg-1 e pH 5,4.
Em 10 de dezembro de 2017, foram aplicados 6 mg/kg de Cd2+ (CdCl2 2,5H2O) e calcário (0,750, 2250 e 3750 kg h m-2), incorporados à camada superficial do solo (0–10 cm) em cada parcela. Cada tratamento foi repetido 3 vezes. As parcelas experimentais foram distribuídas aleatoriamente, com área de 3 m2 cada. Mudas de Panax notoginseng com um ano de idade foram transplantadas após 15 dias de cultivo no solo. Com o uso de telas de sombreamento, a intensidade luminosa para o Panax notoginseng sob a cobertura foi de aproximadamente 18% da intensidade luminosa natural. O cultivo seguiu os métodos tradicionais locais. Em 2019, quando o Panax notoginseng atingiu a maturidade, foi realizada a pulverização com ácido oxálico na forma de oxalato de sódio. A concentração de ácido oxálico foi de 0, 0,1 e 0,2 mol l-1, respectivamente, e o pH foi ajustado para 5,16 com NaOH para simular o pH médio do filtrado dos detritos. As superfícies superior e inferior das folhas foram pulverizadas uma vez por semana, às 8h. Após 4 pulverizações, plantas de Panax notoginseng com 3 anos de idade foram colhidas na 5ª semana.
Em novembro de 2019, plantas de Panax notoginseng de três anos de idade, tratadas com ácido oxálico, foram coletadas no campo. Algumas amostras dessas plantas, destinadas à análise do metabolismo fisiológico e da atividade enzimática, foram colocadas em tubos de congelamento, congeladas rapidamente em nitrogênio líquido e, em seguida, transferidas para um refrigerador a -80 °C. A determinação do teor de cádmio (Cd) e do princípio ativo nas amostras de raízes, na fase de maturação, foi realizada. Após lavagem com água corrente, as amostras foram secas a 105 °C por 30 minutos, mantidas a 75 °C e trituradas em um almofariz.
Pese 0,2 g de amostras de plantas secas em um frasco Erlenmeyer, adicione 8 ml de HNO₃ e 2 ml de HClO₄ e tampe durante a noite. No dia seguinte, coloque o funil com gargalo curvo em um frasco triangular para decomposição eletrotérmica até que uma fumaça branca apareça e a solução de decomposição fique límpida. Após o resfriamento à temperatura ambiente, a mistura foi transferida para um balão volumétrico de 10 ml. O teor de Cd foi determinado em um espectrômetro de absorção atômica (Thermo ICE™ 3300 AAS, EUA). (GB/T 23739-2009).
Pese 0,2 g de amostras de plantas secas em um frasco de plástico de 50 ml, adicione 10 ml de HCl 1 mol l⁻¹, feche e agite por 15 horas e filtre. Usando uma pipeta, aspire a quantidade necessária de filtrado para a diluição apropriada e adicione a solução de SrCl₂ para atingir a concentração de Sr²⁺ de 1 g L⁻¹. O teor de Ca foi determinado usando um espectrômetro de absorção atômica (Thermo ICE™ 3300 AAS, EUA).
Para o método do kit de referência para malondialdeído (MDA), superóxido dismutase (SOD), peroxidase (POD) e catalase (CAT) (DNM-9602, Beijing Pulang New Technology Co., Ltd., número de registro do produto), utilize o kit de medição correspondente nº: Jingyaodianji (quasi) word 2013 No. 2400147).
Pese 0,05 g da amostra de Panax notoginseng e adicione o reagente de antrona-ácido sulfúrico pela parede do tubo. Agite o tubo por 2 a 3 segundos para misturar bem o líquido. Coloque o tubo na estante de tubos de ensaio por 15 minutos. O teor de açúcares solúveis foi determinado por espectrofotometria UV-Visível (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China) em um comprimento de onda de 620 nm.
Pese 0,5 g de uma amostra fresca de Panax notoginseng, triture-a até obter um homogeneizado com 5 ml de água destilada e centrifugue a 10.000 g por 10 minutos. Dilua o sobrenadante até um volume fixo. O método do Azul Brilhante de Coomassie foi utilizado. O teor de proteína solúvel foi determinado por espectrofotometria nas regiões ultravioleta e visível do espectro (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China) em um comprimento de onda de 595 nm e calculado a partir da curva padrão de albumina sérica bovina.
Pesar 0,5 g de amostra fresca, adicionar 5 ml de ácido acético a 10% para triturar e homogeneizar, filtrar e diluir até volume constante. Método cromogênico utilizando solução de ninhidrina. O teor de aminoácidos livres foi determinado por espectrofotometria ultravioleta-visível (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China) em um comprimento de onda de 570 nm e calculado a partir da curva padrão de leucina.
Pesar 0,5 g de uma amostra fresca, adicionar 5 ml de uma solução de ácido sulfossalicílico a 3%, aquecer em banho-maria e agitar por 10 minutos. Após o resfriamento, a solução foi filtrada e diluída até um volume constante. O método cromogênico com ninhidrina ácida foi utilizado. O teor de prolina foi determinado por espectrofotometria UV-Visível (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China) em um comprimento de onda de 520 nm e calculado a partir da curva padrão de prolina.
O teor de saponinas foi determinado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), de acordo com a Farmacopeia da República Popular da China (edição de 2015). O princípio básico da CLAE consiste em utilizar um líquido sob alta pressão como fase móvel e aplicar uma tecnologia de separação altamente eficiente em uma coluna de fase estacionária para partículas ultrafinas. Os procedimentos operacionais são os seguintes:
Condições de HPLC e teste de adequação do sistema (Tabela 1): A eluição em gradiente foi realizada de acordo com a tabela a seguir, utilizando sílica gel ligada com octadecilsilano como fluido de enchimento, acetonitrila como fase móvel A, água como fase móvel B e comprimento de onda de detecção de 203 nm. O número de copos teóricos calculado a partir do pico R1 das saponinas de Panax notoginseng deve ser de pelo menos 4000.
Preparação da solução de referência: Pese com precisão os ginsenosídeos Rg1, Rb1 e notoginsenosídeos R1, adicione metanol até obter uma solução mista com 0,4 mg de ginsenosídeo Rg1, 0,4 mg de ginsenosídeo Rb1 e 0,1 mg de notoginsenosídeo R1 por ml.
Preparação da solução de teste: Pese 0,6 g de pó de Sanxin e adicione 50 ml de metanol. A mistura foi pesada (W1) e deixada em repouso durante a noite. Em seguida, a solução foi levemente fervida em banho-maria a 80 °C por 2 horas. Após o resfriamento, pese a solução novamente e adicione o metanol adicionado à massa inicial de W1. Agite bem e filtre. O filtrado foi reservado para a determinação.
O conteúdo de saponina foi absorvido com precisão por 10 µl da solução padrão e 10 µl do filtrado e injetado em HPLC (Thermo HPLC-ultimate 3000, Seymour Fisher Technology Co., Ltd.)24.
Curva padrão: determinação da solução padrão mista de Rg1, Rb1 e R1, com as mesmas condições cromatográficas descritas anteriormente. Calcule a curva padrão utilizando a área do pico medida no eixo y e a concentração de saponina na solução padrão no eixo das abscissas. Insira a área do pico medida da amostra na curva padrão para calcular a concentração de saponina.
Pese uma amostra de 0,1 g de P. notogensings e adicione 50 ml de solução de CH3OH a 70%. Sonique por 2 horas e, em seguida, centrifugue a 4000 rpm por 10 minutos. Retire 1 ml do sobrenadante e dilua-o 12 vezes. O teor de flavonoides foi determinado por espectrofotometria ultravioleta-visível (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China) em um comprimento de onda de 249 nm. A quercetina é uma substância abundante padrão8.
Os dados foram organizados utilizando o software Excel 2010. A análise de variância dos dados foi avaliada utilizando o software SPSS Statistics 20. A figura foi elaborada com o Origin Pro 9.1. As estatísticas calculadas incluem a média ± desvio padrão. Os níveis de significância estatística foram definidos com base em p < 0,05.
No caso da pulverização foliar com a mesma concentração de ácido oxálico, o teor de cálcio nas raízes de Panax notoginseng aumentou significativamente com o aumento da aplicação de calcário (Tabela 2). Comparado à ausência de aplicação de calcário, o teor de cálcio aumentou 212% com 3750 kg ppm de calcário sem pulverização de ácido oxálico. Com a mesma taxa de aplicação de calcário, o teor de cálcio aumentou ligeiramente com o aumento da concentração de ácido oxálico pulverizado.
O teor de Cd nas raízes variou de 0,22 a 0,70 mg/kg. Com a mesma concentração de ácido oxálico aplicada por pulverização, o teor de Cd (2250 kg/g) diminuiu significativamente com o aumento da taxa de aplicação de calcário. Comparado ao controle, a pulverização das raízes com 2250 kg/g de calcário e 0,1 mol/L de ácido oxálico reduziu o teor de Cd em 68,57%. Na ausência de aplicação de calcário e na aplicação de 750 kg/g de calcário, o teor de Cd nas raízes de Panax notoginseng diminuiu significativamente com o aumento da concentração de ácido oxálico aplicada por pulverização. Com a aplicação de 2250 kg/g de calcário e 3750 kg/g de calcário, o teor de Cd nas raízes inicialmente diminuiu e, posteriormente, aumentou com o aumento da concentração de ácido oxálico. Além disso, a análise 2D mostrou que o teor de Ca na raiz de Panax notoginseng foi significativamente afetado pelo calcário (F = 82,84**), o teor de Cd na raiz de Panax notoginseng foi significativamente afetado pelo calcário (F = 74,99**) e pelo ácido oxálico (F = 74,99**). F = 7,72*).
Com o aumento da taxa de aplicação de cal e da concentração de ácido oxálico pulverizado, o teor de MDA diminuiu significativamente. Não houve diferença significativa no teor de MDA entre as raízes de Panax notoginseng tratadas com cal e com 3750 kg g/m² de cal. Nas taxas de aplicação de 750 kg hm⁻² e 2250 kg hm⁻² de cal, o teor de MDA em ácido oxálico 0,2 mol l⁻¹ pulverizado foi 58,38% e 40,21% menor, respectivamente, do que em ácido oxálico não pulverizado. O teor de MDA (7,57 nmol g⁻¹) foi o menor quando foram adicionados 750 kg hm⁻² de cal e 0,2 mol l⁻¹ de ácido oxálico (Figura 1).
Efeito da pulverização foliar com ácido oxálico no teor de malondialdeído em raízes de Panax notoginseng sob estresse de cádmio [J]. P<0,05). Idem abaixo.
Com exceção da aplicação de 3750 kg h m-2 de cal, não foi observada diferença significativa na atividade da SOD no sistema radicular de Panax notoginseng. Ao utilizar cal nas doses de 0, 750 e 2250 kg h m-2, a atividade da SOD após a pulverização com ácido oxálico 0,2 mol l-1 foi significativamente maior do que na ausência de tratamento com ácido oxálico, com aumentos de 177,89%, 61,62% e 45,08%, respectivamente. A atividade da SOD (598,18 unidades g-1) nas raízes foi maior quando tratadas sem cal e pulverizadas com ácido oxálico 0,2 mol l-1. Na mesma concentração, tanto na ausência quanto na pulverização com ácido oxálico 0,1 mol l-1, a atividade da SOD aumentou com o aumento da quantidade de cal aplicada. A atividade da SOD diminuiu significativamente após a pulverização com ácido oxálico 0,2 mol L-1 (Fig. 2).
Efeito da pulverização foliar com ácido oxálico na atividade da superóxido dismutase, peroxidase e catalase em raízes de Panax notoginseng sob estresse de cádmio [J].
Semelhante à atividade da SOD nas raízes, a atividade da POD nas raízes (63,33 µmol g-1) foi maior quando pulverizada sem cal e com ácido oxálico 0,2 mol L-1, sendo 148,35% maior que o controle (25,50 µmol g-1). A atividade da POD primeiro aumentou e depois diminuiu com o aumento da concentração de ácido oxálico pulverizado e com o tratamento com cal a 3750 kg hm−2. Comparada ao tratamento com ácido oxálico 0,1 mol l-1, a atividade da POD diminuiu 36,31% quando tratada com ácido oxálico 0,2 mol l-1 (Fig. 2).
Com exceção da pulverização com ácido oxálico 0,2 mol l-1 e da aplicação de 2250 kg hm-2 ou 3750 kg hm-2 de cal, a atividade da CAT foi significativamente maior do que no controle. A atividade da CAT no tratamento com ácido oxálico 0,1 mol l-1 e no tratamento com cal 0,2250 kg hm-2 ou 3750 kg hm-2 aumentou em 276,08%, 276,69% ​​e 33,05%, respectivamente, em comparação com o tratamento sem ácido oxálico. A atividade da CAT nas raízes (803,52 µmol g-1) tratadas com ácido oxálico 0,2 mol l-1 foi a mais alta. A atividade da CAT (172,88 µmol g-1) foi a mais baixa no tratamento com 3750 kg hm-2 de cal e ácido oxálico 0,2 mol l-1 (Fig. 2).
A análise bivariada mostrou que a atividade da catalase (CAT) e o nível de malondialdeído (MDA) em Panax notoginseng correlacionaram-se significativamente com a quantidade de ácido oxálico ou cal aplicada por pulverização, bem como com a combinação de ambos os tratamentos (Tabela 3). A atividade da superóxido dismutase (SOD) nas raízes apresentou alta correlação com o tratamento com cal e ácido oxálico, ou com a concentração de ácido oxálico aplicado por pulverização. A atividade da peroxidase (POD) nas raízes correlacionou-se significativamente com a quantidade de cal aplicada ou com a aplicação simultânea de cal e ácido oxálico.
O teor de açúcares solúveis em raízes diminuiu com o aumento da taxa de aplicação de calcário e da concentração de ácido oxálico na pulverização. Não houve diferença significativa no teor de açúcares solúveis nas raízes de Panax notoginseng sem a aplicação de calcário e com a aplicação de 750 kg·h·m−2 de calcário. Ao aplicar 2250 kg·h·m−2 de calcário, o teor de açúcares solúveis no tratamento com ácido oxálico 0,2 mol l−1 foi significativamente maior do que no tratamento sem ácido oxálico, com um aumento de 22,81%. Ao aplicar calcário na quantidade de 3750 kg·h·m−2, o teor de açúcares solúveis diminuiu significativamente com o aumento da concentração de ácido oxálico na pulverização. O teor de açúcares solúveis no tratamento com ácido oxálico 0,2 mol l−1 foi 38,77% menor do que no tratamento sem ácido oxálico. Além disso, o tratamento por pulverização com ácido oxálico 0,2 mol l-1 apresentou o menor teor de açúcar solúvel, de 205,80 mg g-1 (Fig. 3).
Efeito da pulverização foliar com ácido oxálico no conteúdo de açúcar solúvel total e proteína solúvel nas raízes de Panax notoginseng sob estresse de cádmio [J].
O teor de proteína solúvel nas raízes diminuiu com o aumento da taxa de aplicação de calcário e ácido oxálico. Na ausência de calcário, o teor de proteína solúvel no tratamento com pulverização de ácido oxálico a 0,2 mol l⁻¹ foi significativamente menor do que no controle, em 16,20%. Ao aplicar calcário a 750 kg h m⁻², não foi observada diferença significativa no teor de proteína solúvel nas raízes de Panax notoginseng. Com uma taxa de aplicação de calcário de 2250 kg h m⁻², o teor de proteína solúvel no tratamento com pulverização de ácido oxálico a 0,2 mol l⁻¹ foi significativamente maior do que no tratamento sem pulverização de ácido oxálico (35,11%). Quando o calcário foi aplicado a 3750 kg h m⁻², o teor de proteína solúvel diminuiu significativamente com o aumento da concentração de ácido oxálico na pulverização, sendo o menor teor de proteína solúvel (269,84 µg g⁻¹) observado no tratamento com 0,2 mol l⁻¹. 1. Pulverização com ácido oxálico (Fig. 3).
Não foi encontrada diferença significativa no teor de aminoácidos livres nas raízes de Panax notoginseng na ausência de cal. Com o aumento da concentração de ácido oxálico na pulverização e uma taxa de aplicação de cal de 750 kg hm⁻², o teor de aminoácidos livres primeiro diminuiu e depois aumentou. A aplicação de 2250 kg hm⁻² de cal e 0,2 mol l⁻¹ de ácido oxálico aumentou significativamente o teor de aminoácidos livres em 33,58% em comparação com a ausência de tratamento com ácido oxálico. Com o aumento da concentração de ácido oxálico na pulverização e a introdução de 3750 kg hm⁻² de cal, o teor de aminoácidos livres diminuiu significativamente. O teor de aminoácidos livres no tratamento com ácido oxálico a 0,2 mol l⁻¹ foi 49,76% menor do que no tratamento sem ácido oxálico. O teor de aminoácidos livres foi máximo quando não houve tratamento com ácido oxálico, atingindo 2,09 mg/g. O teor de aminoácidos livres (1,05 mg g-1) foi mais baixo quando pulverizado com ácido oxálico 0,2 mol l-1 (Fig. 4).
Efeito da pulverização foliar com ácido oxálico no conteúdo de aminoácidos livres e prolina nas raízes de Panax notoginseng sob condições de estresse de cádmio [J].
O teor de prolina nas raízes diminuiu com o aumento da taxa de aplicação de cal e ácido oxálico. Não houve diferença significativa no teor de prolina em Panax notoginseng na ausência de cal. Com o aumento da concentração de ácido oxálico e das taxas de aplicação de cal de 750 e 2250 kg hm⁻², o teor de prolina primeiro diminuiu e depois aumentou. O teor de prolina no tratamento com ácido oxálico a 0,2 mol l⁻¹ foi significativamente maior do que o teor de prolina no tratamento com ácido oxálico a 0,1 mol l⁻¹, com aumentos de 19,52% e 44,33%, respectivamente. Ao aplicar 3750 kg·hm⁻² de cal, o teor de prolina diminuiu significativamente com o aumento da concentração de ácido oxálico. O teor de prolina após a pulverização com ácido oxálico a 0,2 mol l⁻¹ foi 54,68% menor do que na ausência de ácido oxálico. O teor de prolina foi o mais baixo, atingindo 11,37 μg/g após o tratamento com ácido oxálico 0,2 mol/l (Fig. 4).
O teor total de saponinas em Panax notoginseng foi Rg1>Rb1>R1. Não houve diferença significativa no teor das três saponinas com o aumento da concentração de ácido oxálico pulverizado e sem cal (Tabela 4).
O teor de R1 na aplicação de ácido oxálico a 0,2 mol l-1 foi significativamente menor do que na ausência de aplicação de ácido oxálico e com a utilização de cal a 750 ou 3750 kg·h·m-2. Com concentrações de ácido oxálico de 0 ou 0,1 mol l-1, não houve diferença significativa no teor de R1 com o aumento da taxa de aplicação de cal. Na concentração de ácido oxálico de 0,2 mol l-1, o teor de R1 com 3750 kg·h·m-2 de cal foi significativamente menor do que o de 43,84% na ausência de cal (Tabela 4).
O teor de Rg1 aumentou inicialmente e depois diminuiu com o aumento da concentração de ácido oxálico pulverizado e da taxa de aplicação de calcário de 750 kg·h·m−2. Com taxas de aplicação de calcário de 2250 ou 3750 kg h m-2, o teor de Rg1 diminuiu com o aumento da concentração de ácido oxálico pulverizado. Na mesma concentração de ácido oxálico pulverizado, o teor de Rg1 aumentou inicialmente e depois diminuiu com o aumento da taxa de aplicação de calcário. Comparado ao controle, exceto para três concentrações de ácido oxálico pulverizado e 750 kg h m-2, o teor de Rg1 foi maior que o do controle; o teor de Rg1 nas raízes dos demais tratamentos foi menor que o do controle. O teor de Rg1 foi maior quando pulverizado com 750 kg g m-2 de calcário e 0,1 mol l-1 de ácido oxálico, sendo 11,54% maior que o do controle (Tabela 4).
O teor de Rb1 aumentou inicialmente e depois diminuiu com o aumento da concentração de ácido oxálico pulverizado e da taxa de aplicação de cal de 2250 kg hm⁻². Após a pulverização com ácido oxálico a 0,1 mol l⁻¹, o teor de Rb1 atingiu um máximo de 3,46%, o que representa um aumento de 74,75% em relação à ausência de pulverização com ácido oxálico. Com os demais tratamentos com cal, não houve diferença significativa entre as diferentes concentrações de ácido oxálico pulverizado. Quando pulverizado com ácido oxálico a 0,1 e 0,2 mol l⁻¹, o teor de Rb1 diminuiu inicialmente e, em seguida, continuou a diminuir com o aumento da quantidade de cal adicionada (Tabela 4).
Na mesma concentração de ácido oxálico pulverizado, o teor de flavonoides primeiro aumentou e depois diminuiu com o aumento da taxa de aplicação de calcário. A ausência de calcário ou a pulverização com 3750 kg h m⁻² de calcário, combinada com diferentes concentrações de ácido oxálico, não apresentaram diferença significativa no teor de flavonoides. Quando o calcário foi aplicado nas taxas de 750 e 2250 kg h m⁻², o teor de flavonoides primeiro aumentou e depois diminuiu com o aumento da concentração de ácido oxálico pulverizado. No tratamento com taxa de aplicação de 750 kg h m⁻² e pulverização com ácido oxálico a 0,1 mol l⁻¹, o teor de flavonoides foi o mais alto, atingindo 4,38 mg g⁻¹, o que representa um aumento de 18,38% em relação à aplicação de calcário na mesma taxa, sem pulverização com ácido oxálico. O teor de flavonóides durante a pulverização com ácido oxálico 0,1 mol l-1 aumentou 21,74% em comparação com o tratamento sem pulverização com ácido oxálico e o tratamento com cal a 2250 kg hm-2 (Fig. 5).
Efeito da pulverização foliar de oxalato no conteúdo de flavonóides em raízes de Panax notoginseng sob estresse de cádmio [J].
A análise bivariada mostrou que o teor de açúcar solúvel do Panax notoginseng apresentou correlação significativa com a quantidade de calcário aplicada e com a concentração de ácido oxálico pulverizado. O teor de proteína solúvel nas raízes apresentou correlação significativa com a taxa de aplicação de calcário, tanto de calcário quanto de ácido oxálico. O teor de aminoácidos livres e prolina nas raízes apresentou correlação significativa com a taxa de aplicação de calcário, com a concentração de ácido oxálico pulverizado e com a combinação de calcário e ácido oxálico (Tabela 5).
O teor de R1 nas raízes de Panax notoginseng apresentou correlação significativa com a concentração de ácido oxálico pulverizado, a quantidade de cal aplicada e a combinação de cal e ácido oxálico. O teor de flavonoides apresentou correlação significativa com a concentração de ácido oxálico pulverizado e com a quantidade de cal aplicada.
Diversos métodos têm sido utilizados para reduzir o cádmio (Cd) nas plantas, imobilizando-o no solo, como o calcário e o ácido oxálico30. O calcário é amplamente utilizado como aditivo para reduzir o teor de cádmio nas culturas31. Liang et al.32 relataram que o ácido oxálico também pode ser utilizado para recuperar solos contaminados com metais pesados. Após a aplicação de diferentes concentrações de ácido oxálico em solos contaminados, observou-se um aumento na matéria orgânica, uma diminuição na capacidade de troca catiônica e um aumento no pH33. O ácido oxálico também pode reagir com íons metálicos no solo. Sob estresse por Cd, o teor de Cd em Panax notoginseng aumentou significativamente em comparação com o controle. No entanto, com a aplicação de calcário, houve uma redução significativa. Neste estudo, a aplicação de 750 kg hm⁻² de calcário resultou em um teor de Cd nas raízes dentro do padrão nacional (limite de Cd: ≤ 0,5 mg/kg, AQSIQ, GB/T 19086-200834), sendo que a aplicação de 2250 kg hm⁻² de calcário apresentou o melhor efeito. A aplicação de calcário criou um grande número de sítios de competição entre Ca²⁺ e Cd²⁺ no solo, e a adição de ácido oxálico reduziu o teor de Cd nas raízes de Panax notoginseng. No entanto, a combinação de calcário e ácido oxálico reduziu significativamente o teor de Cd nas raízes de Panax notoginseng, atingindo o padrão nacional. O Ca2+ presente no solo é adsorvido na superfície da raiz durante o fluxo de massa e pode ser absorvido pelas células radiculares através de canais de cálcio (canais Ca2+), bombas de cálcio (Ca2+-ATPase) e antiportadores Ca2+/H+, sendo então transportado horizontalmente para o xilema da raiz. O teor de Ca nas raízes apresentou correlação negativa significativa com o teor de Cd (P<0,05). O teor de Cd diminuiu com o aumento do teor de Ca, o que está de acordo com a hipótese de antagonismo entre Ca e Cd. A análise de variância demonstrou que a quantidade de calcário influenciou significativamente o teor de Ca nas raízes de Panax notoginseng. Pongrac et al. relataram que o Cd se liga ao oxalato nos cristais de oxalato de cálcio e compete com o Ca. No entanto, a regulação do Ca pelo oxalato não foi significativa. Isso demonstra que a precipitação do oxalato de cálcio formado pelo ácido oxálico e Ca2+ não é uma precipitação simples, e o processo de coprecipitação pode ser controlado por diversas vias metabólicas.