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A contaminação por cádmio (Cd) representa uma ameaça potencial à segurança do cultivo da planta medicinal Panax notoginseng em Yunnan. Sob estresse exógeno de Cd, experimentos de campo foram conduzidos para compreender os efeitos da aplicação de calcário (0, 750, 2250 e 3750 kg/h/m²) e da pulverização foliar com ácido oxálico (0, 0,1 e 0,2 mol/L) sobre o acúmulo de Cd e os componentes antioxidantes, sistêmicos e medicinais do Panax notoginseng. Os resultados mostraram que, sob estresse de Cd, o calcário e a pulverização foliar com ácido oxálico aumentaram o teor de Ca²⁺ no Panax notoginseng e reduziram a toxicidade do Cd²⁺. A adição de calcário e ácido oxálico aumentou a atividade de enzimas antioxidantes e alterou o metabolismo de reguladores osmóticos. O efeito mais significativo foi o aumento de 2,77 vezes na atividade da catalase (CAT). Sob a influência do ácido oxálico, a atividade da superóxido dismutase (SOD) aumentou 1,78 vezes. O teor de MDA diminuiu 58,38%. Observou-se uma correlação muito significativa com açúcares solúveis, aminoácidos livres, prolina e proteínas solúveis. O cal e o ácido oxálico podem aumentar o teor de íons de cálcio (Ca2+) em Panax notoginseng, reduzir o teor de cádmio (Cd), melhorar a resistência ao estresse e aumentar a produção total de saponinas e flavonoides. O teor de Cd foi o mais baixo, 68,57% menor que o do controle, e está dentro do valor padrão (Cd ≤ 0,5 mg kg-1, GB/T 19086-2008). A proporção de saponinas solúveis (SPN) foi de 7,73%, atingindo o nível mais alto entre todos os tratamentos, e o teor de flavonoides aumentou significativamente em 21,74%, atingindo os valores padrão para uso medicinal e rendimento ótimo.
O cádmio (Cd) é um contaminante comum em solos cultivados, migra facilmente e apresenta toxicidade biológica significativa. El-Shafei et al.² relataram que a toxicidade do cádmio afeta a qualidade e a produtividade das plantas utilizadas. Níveis excessivos de cádmio em solos cultivados no sudoeste da China têm se tornado um problema grave nos últimos anos. A província de Yunnan é um importante polo de biodiversidade na China, com espécies de plantas medicinais ocupando o primeiro lugar no país. No entanto, Yunnan é rica em recursos minerais, e o processo de mineração inevitavelmente leva à contaminação do solo por metais pesados, o que afeta a produção de plantas medicinais locais.
O Panax notoginseng (Burkill) Chen3) é uma planta medicinal herbácea perene muito valiosa, pertencente ao gênero Panax da família Araliaceae. O Panax notoginseng melhora a circulação sanguínea, elimina a estagnação do sangue e alivia a dor. A principal área de produção é a Prefeitura de Wenshan, Província de Yunnan5. Mais de 75% do solo nas áreas de cultivo do Panax notoginseng está contaminado com cádmio, com níveis variando de 81% a mais de 100% em diferentes áreas6. O efeito tóxico do cádmio também reduz significativamente a produção de componentes medicinais do Panax notoginseng, especialmente saponinas e flavonoides. As saponinas são um tipo de composto glicosídico cujos agliconas são triterpenoides ou espirostanos. Elas são os principais ingredientes ativos de muitos medicamentos tradicionais chineses e contêm saponinas. Algumas saponinas também possuem atividade antibacteriana ou atividades biológicas valiosas, como efeitos antipiréticos, sedativos e anticancerígenos7. Os flavonoides geralmente se referem a uma série de compostos nos quais dois anéis benzênicos com grupos hidroxila fenólicos são conectados por três átomos de carbono centrais. O principal componente é a 2-fenilcromanona 8. Trata-se de um potente antioxidante que pode neutralizar eficazmente os radicais livres de oxigênio em plantas. Também pode inibir a penetração de enzimas biológicas inflamatórias, promover a cicatrização de feridas e o alívio da dor, além de reduzir os níveis de colesterol. É um dos principais ingredientes ativos do Panax notoginseng. Há uma necessidade urgente de abordar o problema da contaminação por cádmio nos solos das áreas de produção de Panax ginseng e garantir a produção de seus ingredientes medicinais essenciais.
O calcário é um dos passivadores mais utilizados para a purificação estacionária do solo da contaminação por cádmio¹⁰. Ele afeta a adsorção e a deposição de Cd no solo, reduzindo a biodisponibilidade do Cd por meio do aumento do pH e da alteração da capacidade de troca catiônica (CTC), da saturação de sais (SS) e do potencial redox (Eh) do solo^3,11. Além disso, o calcário fornece uma grande quantidade de Ca²⁺, forma antagonismo iônico com o Cd²⁺, compete por sítios de adsorção nas raízes, impede o transporte de Cd para o solo e apresenta baixa toxicidade biológica. Quando 50 mmol L^-1 de Ca foram adicionados sob estresse de Cd, o transporte de Cd nas folhas de gergelim foi inibido e o acúmulo de Cd foi reduzido em 80%. Diversos estudos semelhantes foram relatados em arroz (Oryza sativa L.) e outras culturas^12,13.
A pulverização foliar de culturas para controlar o acúmulo de metais pesados ​​é um método recente para o controle desses metais. Seu princípio está relacionado principalmente à reação de quelação nas células vegetais, que resulta na deposição de metais pesados ​​na parede celular e inibe a absorção desses metais pelas plantas^14,15. Como um agente quelante diácido estável, o ácido oxálico pode quelar diretamente íons de metais pesados ​​nas plantas, reduzindo assim a toxicidade. Pesquisas demonstraram que o ácido oxálico na soja pode quelar Cd²⁺ e liberar cristais contendo cádmio através das células dos tricomas superiores, reduzindo os níveis de Cd²⁺ no organismo¹⁶. O ácido oxálico pode regular o pH do solo, aumentar a atividade da superóxido dismutase (SOD), peroxidase (POD) e catalase (CAT) e regular a penetração de açúcares solúveis, proteínas solúveis, aminoácidos livres e prolina, além de atuar como regulador metabólico^17,18. O ácido e o excesso de Ca2+ na planta formam um precipitado de oxalato de cálcio sob a ação de proteínas nucleadoras. A regulação da concentração de Ca2+ nas plantas pode efetivamente controlar o ácido oxálico dissolvido e o Ca2+ nas plantas e evitar o acúmulo excessivo de ácido oxálico e Ca2+19,20.
A quantidade de calcário aplicada é um dos principais fatores que influenciam o efeito de recuperação. Constatou-se que a dosagem de calcário variava de 750 a 6000 kg/m². Para solos ácidos com pH entre 5,0 e 5,5, o efeito da aplicação de calcário na dose de 3000 a 6000 kg/h/m² é significativamente maior do que na dose de 750 kg/h/m²²¹. No entanto, a aplicação excessiva de calcário pode resultar em alguns efeitos negativos no solo, como alterações significativas no pH e compactação²². Portanto, definimos os níveis de tratamento com CaO como 0, 750, 2250 e 3750 kg hm⁻². Quando o ácido oxálico foi aplicado em Arabidopsis thaliana, observou-se que o Ca²⁺ foi significativamente reduzido na concentração de 10 mmol L⁻¹, e a família de genes CRT, que afeta a sinalização de Ca²⁺, apresentou forte resposta²⁰. A acumulação de alguns estudos anteriores permitiu-nos determinar a concentração deste teste e estudar mais a fundo o efeito da interação de suplementos exógenos sobre o Ca2+ e o Cd2+23,24,25. Portanto, este estudo visa explorar o mecanismo regulatório da pulverização foliar exógena de cal e ácido oxálico sobre o teor de Cd e a tolerância ao estresse do Panax notoginseng em solo contaminado com Cd, bem como explorar formas de melhor garantir a qualidade e a eficácia medicinal da produção de Panax notoginseng. Ele fornece orientações valiosas para aumentar a escala de cultivo de plantas herbáceas em solos contaminados com cádmio e alcançar a produção sustentável e de alta qualidade exigida pelo mercado farmacêutico.
Utilizando a variedade local de ginseng Wenshan Panax notoginseng como material de estudo, um experimento de campo foi conduzido em Lannizhai, Condado de Qiubei, Prefeitura de Wenshan, Província de Yunnan (24°11′N, 104°3′E, altitude 1446 m). A temperatura média anual é de 17°C e a precipitação média anual é de 1250 mm. Os valores de referência do solo estudado foram: nitrogênio total (NT) 0,57 g kg⁻¹, fósforo total (PT) 1,64 g kg⁻¹, carbono total (CT) 16,31 g kg⁻¹, matéria orgânica (MO) 31,86 g kg⁻¹, nitrogênio hidrolisado alcalino 88,82 mg kg⁻¹, fósforo livre 18,55 mg kg⁻¹, potássio livre 100,37 mg kg⁻¹, cádmio total 0,3 mg kg⁻¹ e pH 5,4.
Em 10 de dezembro de 2017, uma mistura de 6 mg/kg de Cd2+ (CdCl2·2,5H2O) e calagem (0, 750, 2250 e 3750 kg/h/m2) foi aplicada na superfície do solo em uma camada de 0 a 10 cm em cada parcela. Cada tratamento foi repetido 3 vezes. As parcelas experimentais foram distribuídas aleatoriamente, cada uma com uma área de 3 m2. Mudas de Panax notoginseng com um ano de idade foram transplantadas após 15 dias do preparo do solo. Com o uso de tela de sombreamento, a intensidade luminosa para o Panax notoginseng dentro da tela foi de aproximadamente 18% da intensidade luminosa natural. O cultivo foi realizado de acordo com os métodos tradicionais locais. Antes da fase de maturação do Panax notoginseng, em 2019, foi aplicado ácido oxálico na forma de oxalato de sódio. As concentrações de ácido oxálico foram de 0, 0,1 e 0,2 mol L-1, respectivamente, e NaOH foi usado para ajustar o pH para 5,16, simulando o pH médio da solução de lixiviação da serapilheira. As superfícies superior e inferior das folhas foram pulverizadas uma vez por semana, às 8h. Após 4 pulverizações na 5ª semana, plantas de Panax notoginseng de 3 anos foram colhidas.
Em novembro de 2019, plantas de Panax notoginseng com três anos de idade foram coletadas no campo e pulverizadas com ácido oxálico. Algumas amostras dessas plantas, destinadas à análise do metabolismo fisiológico e da atividade enzimática, foram colocadas em tubos para congelamento, congeladas rapidamente com nitrogênio líquido e, em seguida, transferidas para um refrigerador a -80 °C. Amostras de raízes, destinadas à análise do teor de cádmio (Cd) e do princípio ativo na fase de maturação, foram lavadas com água corrente, secas a 105 °C por 30 minutos, a 75 °C até atingirem peso constante e trituradas em um almofariz para armazenamento.
Pese 0,2 g da amostra seca da planta, coloque-a em um frasco Erlenmeyer, adicione 8 ml de HNO₃ e 2 ml de HClO₄ e cubra durante a noite. No dia seguinte, utilize um funil curvo colocado em um frasco Erlenmeyer para digestão eletrotérmica até que fumaça branca apareça e o suco digestivo fique límpido. Após o resfriamento à temperatura ambiente, a mistura foi transferida para um balão volumétrico de 10 ml. O teor de Cd foi determinado utilizando um espectrômetro de absorção atômica (Thermo ICE™ 3300 AAS, EUA). (GB/T 23739-2009).
Pese 0,2 g da amostra seca da planta, coloque-a em um frasco de plástico de 50 ml, adicione 10 ml de HCl 1 mol L⁻¹, tampe e agite bem por 15 horas e filtre. Usando uma pipeta, pipete a quantidade necessária do filtrado, dilua-o conforme necessário e adicione solução de SrCl₂ para atingir a concentração de Sr²⁺ de 1 g L⁻¹. O teor de Ca foi medido usando um espectrômetro de absorção atômica (Thermo ICE™ 3300 AAS, EUA).
Para determinar os níveis de malondialdeído (MDA), superóxido dismutase (SOD), peroxidase (POD) e catalase (CAT), utilize o kit de referência DNM-9602 (Pequim Prong New Technology Co., Ltd., registro do produto) e o kit de medição correspondente (Nº: Farmacopeia de Pequim (precisa) 2013 nº 2400147).
Pese cerca de 0,05 g da amostra de Panax notoginseng e adicione o reagente de antrona-ácido sulfúrico pelas paredes do tubo. Agite o tubo por 2 a 3 segundos para misturar bem o líquido. Coloque o tubo em uma estante para tubos e deixe a cor se desenvolver por 15 minutos. O teor de açúcar solúvel foi determinado por espectrofotometria ultravioleta-visível (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China) em um comprimento de onda de 620 nm.
Pesar 0,5 g de uma amostra fresca de Panax notoginseng, triturá-la até obter um homogeneizado com 5 ml de água destilada e, em seguida, centrifugar a 10.000 g por 10 minutos. O sobrenadante foi diluído até um volume fixo. O método do Azul Brilhante de Coomassie foi utilizado. O teor de proteína solúvel foi medido por espectrofotometria ultravioleta-visível (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China) em um comprimento de onda de 595 nm e calculado com base na curva padrão de albumina sérica bovina.
Pesar 0,5 g de amostra fresca, adicionar 5 ml de ácido acético a 10%, triturar até homogeneizar, filtrar e diluir até volume constante. O método de desenvolvimento de cor foi utilizado com uma solução de ninhidrina. O teor de aminoácidos livres foi determinado por espectrofotometria UV-Visível (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China) a 570 nm e calculado com base na curva padrão de leucina28.
Pesar 0,5 g de uma amostra fresca, adicionar 5 ml de uma solução de ácido sulfossalicílico a 3%, aquecer em banho-maria e agitar por 10 minutos. Após o resfriamento, a solução foi filtrada e o volume ajustado a constante. O método colorimétrico com ninhidrina ácida foi utilizado. O teor de prolina foi determinado por espectrofotometria ultravioleta-visível (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China) em um comprimento de onda de 520 nm e calculado com base na curva padrão de prolina29.
O teor de saponinas foi determinado por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), com base na Farmacopeia da República Popular da China (edição de 2015). O princípio básico da CLAE consiste em utilizar um líquido sob alta pressão como fase móvel e aplicar a tecnologia de separação de partículas ultrafinas da cromatografia em coluna de alta eficiência à fase estacionária. A técnica operacional é a seguinte:
Condições de HPLC e Teste de Adequação do Sistema (Tabela 1): Utilize sílica gel ligada a octadecilsilano como fase móvel, acetonitrila como fase móvel A e água como fase móvel B. Realize a eluição em gradiente conforme mostrado na tabela abaixo. O comprimento de onda de detecção é 203 nm. De acordo com o pico R1 das saponinas totais de Panax notoginseng, o número de pratos teóricos deve ser de pelo menos 4000.
Preparação da solução padrão: Pese com precisão o ginsenosídeo Rg1, o ginsenosídeo Rb1 e o notoginsenosídeo R1 e adicione metanol para preparar uma mistura contendo 0,4 mg de ginsenosídeo Rg1, 0,4 mg de ginsenosídeo Rb1 e 0,1 mg de notoginsenosídeo R1 por 1 ml de solução.
Preparação da solução de teste: Pese 0,6 g de pó de Panax ginseng e adicione 50 ml de metanol. A solução resultante (W1) foi pesada e deixada em repouso durante a noite. Em seguida, a solução foi fervida suavemente em banho-maria a 80 °C por 2 horas. Após o resfriamento, pese a solução novamente e adicione o metanol preparado à primeira massa (W1). Agite bem e filtre. O filtrado será utilizado para análise.
Coletar com precisão 10 μL da solução padrão e 10 μL do filtrado e injetá-los em um cromatógrafo líquido de alta eficiência (Thermo HPLC-ultimate 3000, Seymour Fisher Technology Co., Ltd.) para determinar o teor de saponina 24.
Curva padrão: medição de uma solução padrão mista de Rg1, Rb1 e R1. As condições cromatográficas são as mesmas descritas anteriormente. Calcule a curva padrão plotando a área do pico medida no eixo y e a concentração de saponina na solução padrão no eixo x. A concentração de saponina pode ser calculada substituindo-se a área do pico medida da amostra na curva padrão.
Pese 0,1 g da amostra de P. notogensings e adicione 50 ml de solução de CH3OH a 70%. A extração ultrassônica foi realizada por 2 horas, seguida de centrifugação a 4000 rpm por 10 minutos. Retire 1 ml do sobrenadante e dilua-o 12 vezes. O teor de flavonoides foi determinado por espectrofotometria ultravioleta-visível (UV-5800, Shanghai Yuanxi Instrument Co., Ltd., China) em um comprimento de onda de 249 nm. A quercetina é uma das substâncias comuns padrão8.
Os dados foram organizados utilizando o software Excel 2010. O software estatístico SPSS 20 foi utilizado para realizar a análise de variância dos dados. As imagens foram elaboradas utilizando o Origin Pro 9.1. Os valores estatísticos calculados incluem média ± desvio padrão. As declarações de significância estatística baseiam-se em p < 0,05.
Na mesma concentração de ácido oxálico pulverizado nas folhas, o teor de Ca nas raízes de Panax notoginseng aumentou significativamente com o aumento da quantidade de calcário aplicada (Tabela 2). Comparado à ausência de calcário, o teor de Ca aumentou 212% com a adição de 3750 kg/h/m² de calcário sem a pulverização de ácido oxálico. Para a mesma quantidade de calcário aplicada, o teor de Ca aumentou ligeiramente com o aumento da concentração de ácido oxálico pulverizado.
O teor de Cd nas raízes varia de 0,22 a 0,70 mg kg⁻¹. Com a mesma concentração de ácido oxálico aplicado por pulverização, à medida que a quantidade de cal adicionada aumenta, o teor de Cd diminui significativamente com a aplicação de 2250 kg/m² de cal. Comparado ao controle, o teor de Cd nas raízes diminuiu 68,57% após a pulverização com 2250 kg/m² de cal e 0,1 mol L⁻¹ de ácido oxálico. Quando não se aplicou cal e quando se aplicou 750 kg/m² de cal, o teor de Cd nas raízes de Panax notoginseng diminuiu significativamente com o aumento da concentração de ácido oxálico aplicado por pulverização. Quando se aplicaram 2250 kg/m² e 3750 kg/m² de cal, o teor de Cd nas raízes primeiro diminuiu e depois aumentou com o aumento da concentração de ácido oxálico. Além disso, a análise bivariada mostrou que o calcário teve um efeito significativo no teor de Ca nas raízes de Panax notoginseng (F = 82,84**), o calcário teve um efeito significativo no teor de Cd nas raízes de Panax notoginseng (F = 74,99**) e o ácido oxálico (F = 7,72*).
À medida que a quantidade de cal adicionada e a concentração de ácido oxálico pulverizado aumentavam, o teor de MDA diminuía significativamente. Não houve diferença significativa no teor de MDA nas raízes de Panax notoginseng sem a adição de cal e com a adição de 3750 kg/m² de cal. Nas taxas de aplicação de 750 kg/h/m² e 2250 kg/h/m², o teor de cal no tratamento com ácido oxálico 0,2 mol/L diminuiu 58,38% e 40,21%, respectivamente, em comparação com o tratamento sem ácido oxálico. O menor teor de MDA (7,57 nmol g⁻¹) foi observado com a pulverização de 750 kg/h/m² de cal e 0,2 mol/L de ácido oxálico (Figura 1).
Efeito da pulverização foliar com ácido oxálico no teor de malondialdeído em raízes de Panax notoginseng sob estresse de cádmio. Nota: A legenda na figura indica a concentração de ácido oxálico na pulverização (mol L-1), letras minúsculas diferentes indicam diferenças significativas entre os tratamentos com a mesma aplicação de cal. (P < 0,05). Idem abaixo.
Com exceção da aplicação de 3750 kg/h de cal, não houve diferença significativa na atividade da SOD nas raízes de Panax notoginseng. Ao adicionar 0, 750 e 2250 kg/h/m² de cal, a atividade da SOD, quando tratada com ácido oxálico a uma concentração de 0,2 mol/L, foi significativamente maior do que sem o uso de ácido oxálico, aumentando em 177,89%, 61,62% e 45,08%, respectivamente. A atividade da SOD nas raízes (598,18 U g⁻¹) foi a mais alta na ausência de aplicação de cal e quando tratada com ácido oxálico a uma concentração de 0,2 mol/L. Quando o ácido oxálico foi pulverizado na mesma concentração ou a 0,1 mol L⁻¹, a atividade da SOD aumentou com o aumento da quantidade de cal adicionada. Após a pulverização com ácido oxálico a 0,2 mol/L, a atividade da SOD diminuiu significativamente (Fig. 2).
Efeito da pulverização foliar com ácido oxálico na atividade da superóxido dismutase, peroxidase e catalase nas raízes de Panax notoginseng sob estresse de cádmio.
Assim como a atividade da SOD nas raízes, a atividade da POD nas raízes tratadas sem cal e pulverizadas com ácido oxálico 0,2 mol L-1 foi a mais alta (63,33 µmol g-1), o que representa um aumento de 148,35% em relação ao controle (25,50 µmol g-1). Com o aumento da concentração de ácido oxálico pulverizado e o tratamento com cal a 3750 kg/m2, a atividade da POD primeiro aumentou e depois diminuiu. Comparada ao tratamento com ácido oxálico 0,1 mol L-1, a atividade da POD no tratamento com ácido oxálico 0,2 mol L-1 diminuiu 36,31% (Fig. 2).
Com exceção da pulverização com ácido oxálico 0,2 mol/L e da adição de 2250 kg/h/m² ou 3750 kg/h/m² de cal, a atividade da CAT foi significativamente maior do que no controle. Ao pulverizar com ácido oxálico 0,1 mol/L e adicionar 0,2250 kg/m² ou 3750 kg/h/m² de cal, a atividade da CAT aumentou em 276,08%, 276,69% ​​e 33,05%, respectivamente, em comparação com o tratamento sem pulverização de ácido oxálico. A atividade da CAT nas raízes foi maior (803,52 μmol/g) no tratamento sem cal e no tratamento com ácido oxálico 0,2 mol/L. A atividade da CAT foi menor (172,88 μmol/g) quando tratada com 3750 kg/h/m² de cal e ácido oxálico 0,2 mol/L (Fig. 2).
A análise bivariada mostrou que a atividade da CAT e a atividade da MDA nas raízes de Panax notoginseng estavam significativamente associadas à quantidade de ácido oxálico ou cal pulverizada e aos dois tratamentos (Tabela 3). A atividade da SOD nas raízes estava significativamente relacionada ao tratamento com cal e ácido oxálico ou à concentração de ácido oxálico pulverizado. A atividade da POD nas raízes dependia significativamente da quantidade de cal aplicada ou do tratamento com cal e ácido oxálico.
O teor de açúcares solúveis nas raízes diminuiu com o aumento da quantidade de cal aplicada e da concentração de ácido oxálico pulverizado. Não houve diferença significativa no teor de açúcares solúveis nas raízes de Panax notoginseng sem aplicação de cal e quando 750 kg/h/m² de cal foram aplicados. Quando 2250 kg/m² de cal foram aplicados, o teor de açúcares solúveis quando tratadas com ácido oxálico 0,2 mol/L foi significativamente maior do que quando tratadas sem pulverização de ácido oxálico, com um aumento de 22,81%. Quando 3750 kg/h/m² de cal foram aplicados, o teor de açúcares solúveis diminuiu significativamente com o aumento da concentração de ácido oxálico pulverizado. O teor de açúcares solúveis quando tratadas com ácido oxálico 0,2 mol/L diminuiu 38,77% em comparação com o teor sem pulverização de ácido oxálico. Além disso, o tratamento com spray de ácido oxálico 0,2 mol·L-1 apresentou o menor teor de açúcar solúvel, que foi de 205,80 mg·g-1 (Fig. 3).
Efeito da pulverização foliar com ácido oxálico no teor de açúcar total solúvel e proteína solúvel em raízes de Panax notoginseng sob estresse de cádmio.
O teor de proteína solúvel nas raízes diminuiu com o aumento da aplicação de calcário e do tratamento com ácido oxálico. Sem a adição de calcário, o teor de proteína solúvel, quando tratado com ácido oxálico a uma concentração de 0,2 mol L⁻¹, foi significativamente reduzido em 16,20% em comparação com o controle. Não houve diferenças significativas no teor de proteína solúvel das raízes de Panax notoginseng quando 750 kg/h de calcário foram aplicados. Sob as condições de aplicação de 2250 kg/h/m² de calcário, o teor de proteína solúvel no tratamento com ácido oxálico a 0,2 mol/L foi significativamente maior do que no tratamento sem ácido oxálico (35,11%). Quando 3750 kg·h/m² de calcário foram aplicados, o teor de proteína solúvel diminuiu significativamente com o aumento da concentração de ácido oxálico, com o menor teor de proteína solúvel (269,84 μg·g⁻¹) quando a concentração de ácido oxálico foi de 0,2 mol·L⁻¹. tratamento (Fig. 3).
Não houve diferenças significativas no teor de aminoácidos livres na raiz de Panax notoginseng na ausência de aplicação de cal. Com o aumento da concentração de ácido oxálico pulverizado e a adição de 750 kg/h/m² de cal, o teor de aminoácidos livres primeiro diminuiu e depois aumentou. Comparado ao tratamento sem pulverização de ácido oxálico, o teor de aminoácidos livres aumentou significativamente em 33,58% com a pulverização de 2250 kg/h/m² de cal e 0,2 mol/L de ácido oxálico. O teor de aminoácidos livres diminuiu significativamente com o aumento da concentração de ácido oxálico pulverizado e a adição de 3750 kg/m² de cal. O teor de aminoácidos livres no tratamento com pulverização de ácido oxálico a 0,2 mol/L foi reduzido em 49,76% em comparação ao tratamento sem pulverização de ácido oxálico. O teor de aminoácidos livres foi mais elevado na ausência de pulverização de ácido oxálico, atingindo 2,09 mg/g. O tratamento com spray de ácido oxálico 0,2 mol/L apresentou o menor teor de aminoácidos livres (1,05 mg/g) (Fig. 4).
Efeito da pulverização foliar com ácido oxálico no teor de aminoácidos livres e prolina nas raízes de Panax notoginseng sob condições de estresse por cádmio.
O teor de prolina nas raízes diminuiu com o aumento da quantidade de calcário aplicada e da quantidade de ácido oxálico pulverizado. Não houve diferenças significativas no teor de prolina da raiz de Panax ginseng quando não houve aplicação de calcário. À medida que a concentração de ácido oxálico pulverizado aumentou e a aplicação de 750 ou 2250 kg/m² de calcário aumentou, o teor de prolina primeiro diminuiu e depois aumentou. O teor de prolina no tratamento com ácido oxálico pulverizado a 0,2 mol L⁻¹ foi significativamente maior do que no tratamento com ácido oxálico pulverizado a 0,1 mol L⁻¹, aumentando em 19,52% e 44,33%, respectivamente. Quando 3750 kg/m² de calcário foram adicionados, o teor de prolina diminuiu significativamente com o aumento da concentração de ácido oxálico pulverizado. Após a pulverização com ácido oxálico a 0,2 mol L⁻¹, o teor de prolina diminuiu 54,68% em comparação com o teor sem pulverização de ácido oxálico. O menor teor de prolina foi observado quando tratado com ácido oxálico 0,2 mol/l, atingindo 11,37 μg/g (Fig. 4).
O teor total de saponinas em Panax notoginseng segue a ordem Rg1 > Rb1 > R1. Não houve diferença significativa no teor das três saponinas com o aumento da concentração de ácido oxálico aplicado e com a concentração sem aplicação de cal (Tabela 4).
O teor de R1 após a pulverização com ácido oxálico a 0,2 mol L-1 foi significativamente menor do que sem a pulverização de ácido oxálico e com a aplicação de cal a 750 ou 3750 kg/m2. Com uma concentração de ácido oxálico pulverizado de 0 ou 0,1 mol/L, não houve diferença significativa no teor de R1 com o aumento da quantidade de cal adicionada. Com uma concentração de pulverização de ácido oxálico de 0,2 mol/L, o teor de R1 com 3750 kg/h/m2 de cal foi significativamente menor do que os 43,84% obtidos sem a adição de cal (Tabela 4).
À medida que a concentração de ácido oxálico pulverizado aumentava e 750 kg/m² de cal eram adicionados, o teor de Rg1 primeiro aumentava e depois diminuía. Nas taxas de aplicação de cal de 2250 e 3750 kg/h, o teor de Rg1 diminuiu com o aumento da concentração de ácido oxálico pulverizado. Na mesma concentração de ácido oxálico pulverizado, à medida que a quantidade de cal aumentava, o teor de Rg1 primeiro aumentava e depois diminuía. Comparado ao controle, exceto pelo teor de Rg1 nos tratamentos com três concentrações de ácido oxálico e 750 kg/m² de cal, que foi maior que o do controle, o teor de Rg1 nas raízes de Panax notoginseng nos demais tratamentos foi menor que o do controle. O teor máximo de Rg1 foi obtido com a pulverização de 750 kg/h/m² de cal e 0,1 mol/L de ácido oxálico, sendo 11,54% maior que o do controle (Tabela 4).
À medida que a concentração de ácido oxálico pulverizado e a quantidade de cal aplicada aumentavam a uma vazão de 2250 kg/h, o teor de Rb1 primeiro aumentava e depois diminuía. Após a pulverização com ácido oxálico a 0,1 mol L⁻¹, o teor de Rb1 atingiu um valor máximo de 3,46%, o que representou um aumento de 74,75% em relação à ausência de pulverização com ácido oxálico. Para os demais tratamentos com cal, não houve diferenças significativas entre as diferentes concentrações de ácido oxálico pulverizado. Após a pulverização com ácido oxálico a 0,1 e 0,2 mol L⁻¹, com o aumento da quantidade de cal, o teor de Rb1 primeiro diminuía e depois se estabilizava (Tabela 4).
Na mesma concentração de ácido oxálico pulverizado, à medida que a quantidade de cal adicionada aumentava, o teor de flavonoides primeiro aumentava e depois diminuía. Não foi detectada diferença significativa no teor de flavonoides ao pulverizar diferentes concentrações de ácido oxálico sem cal e com 3750 kg/m² de cal. Ao adicionar 750 e 2250 kg/m² de cal, à medida que a concentração de ácido oxálico pulverizado aumentava, o teor de flavonoides primeiro aumentava e depois diminuía. Ao aplicar 750 kg/m² de cal e pulverizar ácido oxálico a uma concentração de 0,1 mol/l, o teor de flavonoides atingiu o máximo – 4,38 mg/g, o que representa um aumento de 18,38% em relação à adição da mesma quantidade de cal, não havendo necessidade de pulverizar ácido oxálico. O teor de flavonóides quando tratado com spray de ácido oxálico 0,1 mol L-1 aumentou 21,74% em comparação com o tratamento sem ácido oxálico e o tratamento com cal na dose de 2250 kg/m2 (Fig. 5).
Efeito da pulverização foliar com oxalato no teor de flavonoides na raiz de Panax notoginseng sob estresse de cádmio.
A análise bivariada mostrou que o teor de açúcar solúvel nas raízes de Panax notoginseng dependia significativamente da quantidade de calcário aplicada e da concentração de ácido oxálico pulverizado. O teor de proteína solúvel nas raízes apresentou correlação significativa com a dosagem de calcário e ácido oxálico. O teor de aminoácidos livres e prolina nas raízes apresentou correlação significativa com a quantidade de calcário aplicada, a concentração de ácido oxálico pulverizado e a combinação de calcário e ácido oxálico (Tabela 5).
O teor de R1 nas raízes de Panax notoginseng dependeu significativamente da concentração de ácido oxálico pulverizado, da quantidade de cal e da combinação de cal e ácido oxálico aplicada. O teor de flavonoides dependeu significativamente da concentração de ácido oxálico pulverizado e da quantidade de cal adicionada.
Diversos métodos têm sido utilizados para reduzir os níveis de cádmio em plantas, fixando-o no solo, como o calcário e o ácido oxálico30. O calcário é amplamente utilizado como corretivo de solo para reduzir os níveis de cádmio em culturas31. Liang et al.32 relataram que o ácido oxálico também pode ser utilizado para remediar solos contaminados com metais pesados. Após a adição de diferentes concentrações de ácido oxálico ao solo contaminado, houve aumento no teor de matéria orgânica, diminuição na capacidade de troca catiônica e aumento no pH33. O ácido oxálico também pode reagir com íons metálicos no solo. Sob condições de estresse por cádmio, o teor de cádmio em Panax notoginseng aumentou significativamente em comparação com o controle. No entanto, com a aplicação de calcário, houve uma redução significativa. Neste estudo, quando 750 kg/h/m² de calcário foram aplicados, o teor de cádmio nas raízes atingiu o padrão nacional (limite de cádmio ≤ 0,5 mg/kg, AQSIQ, GB/T 19086-200834), demonstrando um bom resultado. O melhor efeito é obtido com a adição de 2250 kg/m² de calcário. A adição de calcário cria um grande número de sítios de competição para Ca²⁺ e Cd²⁺ no solo, e a adição de ácido oxálico reduz o teor de Cd nas raízes de Panax notoginseng. Após a mistura de calcário e ácido oxálico, o teor de Cd nas raízes de Panax ginseng diminuiu significativamente e atingiu o padrão nacional. O Ca²⁺ no solo é adsorvido à superfície da raiz por meio de um processo de fluxo de massa e pode ser absorvido pelas células da raiz através de canais de cálcio (canais de Ca²⁺), bombas de cálcio (Ca²⁺-ATPase) e antiportadores Ca²⁺/H⁺, sendo então transportado horizontalmente para o xilema das raízes. Houve uma correlação negativa significativa entre os teores de Ca e Cd nas raízes (P < 0,05). O teor de Cd diminuiu com o aumento do teor de Ca, o que está de acordo com a ideia de antagonismo entre Ca e Cd. A análise de variância (ANOVA) mostrou que a quantidade de cal teve um efeito significativo no teor de cálcio (Ca) na raiz de Panax notoginseng. Pongrack et al.³⁵ relataram que o cádmio (Cd) se liga ao oxalato nos cristais de oxalato de cálcio e compete com o Ca. No entanto, o efeito regulador do ácido oxálico sobre o Ca foi insignificante. Isso demonstra que a precipitação de oxalato de cálcio a partir do ácido oxálico e do Ca²⁺ não é uma simples precipitação, e o processo de coprecipitação pode ser controlado por diversas vias metabólicas.
Sob estresse por cádmio, uma grande quantidade de espécies reativas de oxigênio (ROS) é formada nas plantas, danificando a estrutura das membranas celulares36. O teor de malondialdeído (MDA) pode ser usado como um indicador para avaliar o nível de ROS e o grau de dano à membrana plasmática das plantas37. O sistema antioxidante é um importante mecanismo de proteção para neutralizar as espécies reativas de oxigênio38. As atividades das enzimas antioxidantes (incluindo POD, SOD e CAT) são tipicamente alteradas pelo estresse por cádmio. Os resultados mostraram que o teor de MDA apresentou correlação positiva com a concentração de Cd, indicando que a extensão da peroxidação lipídica da membrana vegetal aumentou com o aumento da concentração de Cd37. Isso está de acordo com os resultados do estudo de Ouyang et al.39. Este estudo demonstra que o teor de MDA é significativamente influenciado por cal, ácido oxálico e pela combinação de cal e ácido oxálico. Após a nebulização com ácido oxálico 0,1 mol L-1, o teor de MDA em Panax notoginseng diminuiu, indicando que o ácido oxálico pode reduzir a biodisponibilidade de Cd e os níveis de ROS em Panax notoginseng. O sistema enzimático antioxidante é onde ocorre a função de desintoxicação da planta. A SOD remove o O2- contido nas células vegetais e produz O2 não tóxico e H2O2 pouco tóxico. A POD e a CAT removem o H2O2 dos tecidos vegetais e catalisam a decomposição do H2O2 em H2O. Com base na análise do proteoma iTRAQ, verificou-se que os níveis de expressão proteica de SOD e PAL diminuíram e o nível de expressão de POD aumentou após a aplicação de cal sob estresse de Cd40. As atividades de CAT, SOD e POD na raiz de Panax notoginseng foram significativamente afetadas pela dosagem de ácido oxálico e cal. O tratamento por pulverização com ácido oxálico 0,1 mol L-1 aumentou significativamente a atividade da SOD e da CAT, mas o efeito regulador sobre a atividade da POD não foi evidente. Isso demonstra que o ácido oxálico acelera a decomposição de ROS sob estresse de Cd e completa principalmente a remoção de H2O2 pela regulação da atividade da CAT, o que é semelhante aos resultados da pesquisa de Guo et al.41 sobre as enzimas antioxidantes de Pseudospermum sibiricum Kos. O efeito da adição de 750 kg/h/m2 de cal sobre a atividade das enzimas do sistema antioxidante e o teor de malondialdeído é semelhante ao efeito da pulverização com ácido oxálico. Os resultados mostraram que o tratamento por pulverização com ácido oxálico pode aumentar de forma mais eficaz as atividades da SOD e da CAT em Panax notoginseng e aumentar a resistência ao estresse de Panax notoginseng. As atividades de SOD e POD foram reduzidas pelo tratamento com ácido oxálico 0,2 mol L-1 e 3750 kg hm-2 de cal, indicando que a pulverização excessiva de altas concentrações de ácido oxálico e Ca2+ pode causar estresse nas plantas, o que é consistente com o estudo de Luo et al. Wait 42.