Relatamos anteriormente que os níveis séricos do ácido indol-3-propiônico (IPA), um metabólito do triptofano derivado do intestino, são menores em pacientes com fibrose hepática. Neste estudo, investigamos o transcriptoma e o metiloma do DNA em fígados obesos em relação aos níveis séricos de IPA, bem como o papel do IPA na indução da inativação fenotípica de células estreladas hepáticas (HSCs) in vitro.
O estudo incluiu 116 pacientes obesos sem diabetes mellitus tipo 2 (DM2) (idade 46,8 ± 9,3 anos; IMC: 42,7 ± 5,0 kg/m²) submetidos à cirurgia bariátrica no Centro de Cirurgia Bariátrica de Kuopio (KOBS). Os níveis circulantes de IPA foram medidos por cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS), a análise do transcriptoma hepático foi realizada por sequenciamento de RNA total e a análise de metilação do DNA foi realizada utilizando o Infinium HumanMethylation450 BeadChip. Células estreladas hepáticas humanas (LX-2) foram utilizadas para os experimentos in vitro.
Os níveis séricos de IPA correlacionaram-se com a expressão de genes envolvidos nas vias apoptóticas, mitofágicas e de longevidade no fígado. O gene da serina/treonina quinase 1 (AKT1) foi o gene de interação mais abundante e dominante nos perfis de transcrição e metilação do DNA hepático. O tratamento com IPA induziu apoptose, diminuiu a respiração mitocondrial e alterou a morfologia celular e a dinâmica mitocondrial, modulando a expressão de genes conhecidos por regular a fibrose, a apoptose e a sobrevivência das células LX-2.
Em conjunto, esses dados corroboram a hipótese de que o IPA possui potenciais efeitos terapêuticos e pode induzir apoptose e alterar o fenótipo das células estreladas hepáticas (HSC) para um estado inativo, ampliando assim a possibilidade de inibir a fibrose hepática por meio da interferência na ativação das HSC e no metabolismo mitocondrial.
A prevalência de obesidade e síndrome metabólica tem sido associada a uma incidência crescente de doença hepática gordurosa associada ao metabolismo (DHGMA); a doença afeta de 25% a 30% da população geral [1]. A principal consequência da etiologia da DHGMA é a fibrose hepática, um processo dinâmico caracterizado pelo acúmulo contínuo de matriz extracelular (MEC) fibrosa [2]. As principais células envolvidas na fibrose hepática são as células estreladas hepáticas (CEHs), que exibem quatro fenótipos conhecidos: quiescente, ativada, inativada e senescente [3, 4]. As CEHs podem ser ativadas e transdiferenciar-se de uma forma quiescente para células proliferativas semelhantes a fibroblastos com alta demanda energética, com aumento da expressão de α-actina de músculo liso (α-SMA) e colágeno tipo I (Col-I) [5, 6]. Durante a reversão da fibrose hepática, as CEHs ativadas são eliminadas por apoptose ou inativação. Esses processos incluem a regulação negativa de genes fibrogênicos e a modulação de genes pró-sobrevivência (como as vias de sinalização NF-κB e PI3K/Akt) [7, 8], bem como alterações na dinâmica e função mitocondrial [9].
Os níveis séricos do ácido indol-3-propiônico (IPA), um metabólito do triptofano produzido no intestino, estão diminuídos em doenças metabólicas humanas, incluindo a MASLD [10–13]. O IPA está associado à ingestão de fibras alimentares, é conhecido por seus efeitos antioxidantes e anti-inflamatórios e atenua o fenótipo da esteato-hepatite não alcoólica (EHNA) induzida pela dieta in vivo e in vitro [11–14]. Algumas evidências provêm de nosso estudo anterior, que demonstrou que os níveis séricos de IPA eram menores em pacientes com fibrose hepática do que em pacientes obesos sem fibrose hepática no Estudo de Cirurgia Bariátrica de Kuopio (KOBS). Além disso, mostramos que o tratamento com IPA pode reduzir a expressão de genes que são marcadores clássicos de adesão celular, migração celular e ativação de células-tronco hematopoiéticas em um modelo de células estreladas hepáticas humanas (LX-2) e é um potencial metabólito hepatoprotetor [15]. No entanto, ainda não está claro como o IPA induz a regressão da fibrose hepática através da ativação da apoptose das células estreladas hepáticas e da bioenergética mitocondrial.
Neste estudo, demonstramos que o IPA sérico está associado à expressão de genes enriquecidos em vias de apoptose, mitofagia e longevidade no fígado de indivíduos obesos, porém sem diabetes tipo 2 (KOBS). Além disso, descobrimos que o IPA pode induzir a eliminação e a degradação de células-tronco hematopoiéticas (CTHs) ativadas por meio da via de inativação. Esses resultados revelam um novo papel para o IPA, tornando-o um alvo terapêutico potencial para promover a regressão da fibrose hepática.
Um estudo anterior na coorte KOBS mostrou que pacientes com fibrose hepática apresentavam níveis circulantes de IPA mais baixos em comparação com pacientes sem fibrose hepática [15]. Para excluir o potencial efeito de confusão do diabetes tipo 2, recrutamos 116 pacientes obesos sem diabetes tipo 2 (idade média ± DP: 46,8 ± 9,3 anos; IMC: 42,7 ± 5,0 kg/m²) (Tabela 1) do estudo KOBS em andamento como população do estudo [16]. Todos os participantes deram consentimento livre e esclarecido por escrito e o protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital do Condado de Savo do Norte, em conformidade com a Declaração de Helsinque (54/2005, 104/2008 e 27/2010).
Amostras de biópsia hepática foram obtidas durante a cirurgia bariátrica e avaliadas histologicamente por patologistas experientes de acordo com critérios previamente descritos [17, 18]. Os critérios de avaliação estão resumidos na Tabela Suplementar S1 e foram descritos anteriormente [19].
Amostras de soro em jejum foram analisadas por cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS) não direcionada para análise metabolômica (n = 116). As amostras foram analisadas usando um sistema UHPLC-qTOF-MS (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Alemanha), conforme descrito anteriormente [19]. A identificação do álcool isopropílico (IPA) foi baseada no tempo de retenção e na comparação do espectro MS/MS com padrões puros. A intensidade do sinal de IPA (área do pico) foi considerada em todas as análises subsequentes [20].
O sequenciamento de RNA do fígado inteiro foi realizado usando o Illumina HiSeq 2500 e os dados foram pré-processados ​​conforme descrito anteriormente [19, 21, 22]. Realizamos uma análise de expressão diferencial direcionada de transcritos que afetam a função/biogênese mitocondrial usando 1957 genes selecionados do banco de dados MitoMiner 4.0 [23]. A análise de metilação do DNA hepático foi realizada usando o Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, EUA) com a mesma metodologia descrita anteriormente [24, 25].
As células estreladas hepáticas humanas (LX-2) foram gentilmente cedidas pelo Prof. Stefano Romeo e cultivadas e mantidas em meio DMEM/F12 (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Para selecionar a dose de trabalho do IPA, as células LX-2 foram tratadas com diferentes concentrações de IPA (10 μM, 100 μM e 1 mM; Sigma, 220027) em meio DMEM/F12 por 24 h. Além disso, para investigar a capacidade do IPA de inativar as células estreladas hepáticas, as células LX-2 foram co-tratadas com 5 ng/ml de TGF-β1 (R&D Systems, 240-B-002/CF) e 1 mM de IPA em meio sem soro por 24 h. Para os respectivos controles do veículo, utilizou-se HCl 4 nM contendo 0,1% de BSA para o tratamento com TGF-β1 e DMSO 0,05% para o tratamento com IPA, sendo ambos utilizados em conjunto para o tratamento combinado.
A apoptose foi avaliada utilizando o kit de detecção de apoptose FITC Annexin V com 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, EUA, Cat# 640922) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, células LX-2 (1 × 10⁵ células/poço) foram cultivadas durante a noite em placas de 12 poços e, em seguida, tratadas com múltiplas doses de IPA ou IPA e TGF-β1. No dia seguinte, as células em suspensão e aderentes foram coletadas, tripsinizadas, lavadas com PBS, ressuspensas em tampão de ligação de Annexin V e incubadas com FITC-Annexin V e 7-AAD por 15 minutos.
As mitocôndrias em células vivas foram coradas para atividade oxidativa usando Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Para os ensaios de MTR, as células LX-2 foram incubadas em densidades iguais com IPA e TGF-β1. Após 24 h, as células vivas foram tripsinizadas, lavadas com PBS e incubadas com 100 μM de MTR em meio sem soro a 37 °C por 20 min, conforme descrito anteriormente [ 26 ]. Para a análise da morfologia celular em células vivas, o tamanho celular e a complexidade citoplasmática foram analisados ​​usando os parâmetros de dispersão frontal (FSC) e dispersão lateral (SSC), respectivamente.
Todos os dados (30.000 eventos) foram adquiridos usando o NovoCyte Quanteon (Agilent) e analisados ​​usando o software NovoExpress® 1.4.1 ou FlowJo V.10.
A taxa de consumo de oxigênio (OCR) e a taxa de acidificação extracelular (ECAR) foram medidas em tempo real usando um analisador de fluxo extracelular Seahorse (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) equipado com um Seahorse XF Cell Mito Stress, de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 2 × 10⁴ células LX-2/poço foram semeadas em placas de cultura celular XF96. Após incubação durante a noite, as células foram tratadas com isopropanol (IPA) e TGF-β1 (Métodos Suplementares 1). A análise dos dados foi realizada usando o software Seahorse XF Wave, que inclui o gerador de relatórios do teste de fenótipo energético celular Seahorse XF. A partir disso, foi calculado um Índice de Saúde Bioenergética (BHI) [27].
O RNA total foi transcrito em cDNA. Para métodos específicos, consulte a referência [15]. Os níveis de mRNA da proteína ribossômica ácida 60S humana P0 (RPLP0) e da ciclofilina A1 (PPIA) foram usados ​​como controles constitutivos de genes. O sistema de PCR em tempo real QuantStudio 6 pro (Thermo Fisher, Landsmeer, Holanda) foi usado com o kit TaqMan™ Fast Advanced Master Mix (Applied Biosystems) ou o kit Sensifast SYBR Lo-ROX (Bioline, BIO 94050), e a expressão gênica relativa foi calculada usando os parâmetros de ciclagem do valor Ct comparativo (ΔΔCt) e o método ∆∆Ct. Detalhes dos primers são fornecidos nas Tabelas Suplementares S2 e S3.
O DNA nuclear (ncDNA) e o DNA mitocondrial (mtDNA) foram extraídos utilizando o kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen), conforme descrito anteriormente [28]. A quantidade relativa de mtDNA foi calculada pela razão entre cada região alvo de mtDNA e a média geométrica das três regiões de DNA nuclear (mtDNA/ncDNA), conforme detalhado nos Métodos Suplementares 2. Os detalhes dos primers para mtDNA e ncDNA são fornecidos na Tabela Suplementar S4.
Células vivas foram coradas com Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA) para visualizar as redes mitocondriais intercelulares e intracelulares. Células LX-2 (1 × 104 células/poço) foram cultivadas em lâminas de vidro em placas de cultura com fundo de vidro correspondentes (Ibidi GmbH, Martinsried, Alemanha). Após 24 h, as células LX-2 vivas foram incubadas com 100 μM de MTR por 20 min a 37 °C e os núcleos celulares foram corados com DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich) conforme descrito anteriormente [29]. As redes mitocondriais foram visualizadas usando um microscópio invertido Zeiss Axio Observer (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Alemanha) equipado com um módulo confocal Zeiss LSM 800 a 37 °C em atmosfera umidificada com 5% de CO2, utilizando uma objetiva de 63×NA 1,3. Adquirimos dez imagens da série Z para cada tipo de amostra. Cada série Z contém 30 seções, cada uma com uma espessura de 9,86 μm. Para cada amostra, imagens de dez campos de visão diferentes foram adquiridas usando o software ZEN 2009 (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Alemanha), e a análise da morfologia mitocondrial foi realizada usando o software ImageJ (v1.54d) [30, 31] de acordo com os parâmetros detalhados nos Métodos Suplementares 3.
As células foram fixadas com glutaraldeído a 2% em tampão fosfato 0,1 M, seguido de fixação com solução de tetróxido de ósmio a 1% (Sigma Aldrich, MO, EUA), desidratadas gradualmente com acetona (Merck, Darmstadt, Alemanha) e, finalmente, incluídas em resina epóxi. Cortes ultrafinos foram preparados e corados com acetato de uranila a 1% (Merck, Darmstadt, Alemanha) e citrato de chumbo a 1% (Merck, Darmstadt, Alemanha). Imagens ultraestruturais foram obtidas utilizando um microscópio eletrônico de transmissão JEM 2100F EXII (JEOL Ltd, Tóquio, Japão) com tensão de aceleração de 80 kV.
A morfologia das células LX-2 tratadas com IPA durante 24 horas foi analisada por microscopia de contraste de fase com ampliação de 50x, utilizando um microscópio de luz invertido Zeiss (Zeiss Axio Vert.A1 e AxioCam MRm, Jena, Alemanha).
Os dados clínicos foram expressos como média ± desvio padrão ou mediana (intervalo interquartil: IQR). A análise de variância de uma via (variáveis ​​contínuas) ou o teste χ² (variáveis ​​categóricas) foram utilizados para comparar as diferenças entre os três grupos de estudo. A taxa de falsos positivos (FDR) foi utilizada para corrigir o teste múltiplo, e os genes com FDR < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. A análise de correlação de Spearman foi utilizada para correlacionar a metilação do DNA CpG com a intensidade do sinal IPA, com valores de p nominais (p < 0,05) relatados.
A análise de vias metabólicas foi realizada utilizando uma ferramenta online de análise de conjuntos de genes (WebGestalt) para 268 transcritos (p nominal < 0,01), 119 transcritos associados à mitocôndria (p nominal < 0,05) e 4350 CpGs, dentre 3093 transcritos hepáticos associados aos níveis séricos circulantes de IPA. A ferramenta gratuita VennyDB (versão 2.1.0) foi utilizada para encontrar genes sobrepostos, e o StringDB (versão 11.5) foi utilizado para visualizar as interações proteína-proteína.
Para o experimento LX-2, as amostras foram testadas quanto à normalidade utilizando o teste de D'Agostino-Pearson. Os dados foram obtidos de pelo menos três réplicas biológicas e submetidos à ANOVA de uma via com teste post hoc de Bonferroni. Um valor de p inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão, e o número de experimentos é indicado em cada figura. Todas as análises e gráficos foram realizados utilizando o software estatístico GraphPad Prism 8 para Windows (GraphPad Software Inc., versão 8.4.3, San Diego, EUA).
Primeiramente, investigamos a associação dos níveis séricos de IPA com transcritos hepáticos, sistêmicos e mitocondriais. No perfil de transcritos totais, o gene mais fortemente associado aos níveis séricos de IPA foi MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; proteína quinase 3 ativada por proteína quinase ativada por mitogênio); no perfil de transcritos relacionados à mitocôndria, o gene mais fortemente associado foi AKT1 (FDR = 0,7621; quinase serina/treonina AKT 1) (Arquivo adicional 1 e Arquivo adicional 2).
Em seguida, analisamos transcrições globais (n = 268; p < 0,01) e transcrições associadas à mitocôndria (n = 119; p < 0,05), identificando, por fim, a apoptose como a via canônica mais significativa (p = 0,0089). Para as transcrições mitocondriais associadas aos níveis séricos de IPA, concentramo-nos na apoptose (FDR = 0,00001), na mitofagia (FDR = 0,00029) e nas vias de sinalização do TNF (FDR = 0,000006) (Figura 1A, Tabela 2 e Figuras Suplementares 1A-B).
Análise de sobreposição de transcritos globais, associados à mitocôndria e metilação do DNA no fígado humano em associação com os níveis séricos de IPA. A representa 268 transcritos globais, 119 transcritos associados à mitocôndria e transcritos com DNA metilado mapeados em 3092 sítios CpG associados aos níveis séricos de IPA (valores de p < 0,01 para transcritos globais e DNA metilado, e valores de p < 0,05 para transcritos mitocondriais). Os principais transcritos sobrepostos são mostrados no meio (AKT1 e YKT6). B O mapa de interação dos 13 genes com a maior pontuação de interação (0,900) com outros genes foi construído a partir dos 56 genes sobrepostos (região da linha preta) que foram significativamente associados aos níveis séricos de IPA usando a ferramenta online StringDB. Verde: Genes mapeados para o componente celular da Gene Ontology (GO): mitocôndria (GO:0005739). A proteína AKT1 apresenta a maior pontuação (0,900) em interações com outras proteínas, com base nos dados obtidos por meio de mineração de texto, experimentos, bancos de dados e coexpressão. Os nós da rede representam proteínas e as arestas representam conexões entre elas.
Como os metabólitos da microbiota intestinal podem regular a composição epigenética por meio da metilação do DNA [32], investigamos se os níveis séricos de IPA estavam associados à metilação do DNA hepático. Descobrimos que os dois principais sítios de metilação associados aos níveis séricos de IPA estavam próximos à região rica em prolina-serina 3 (C19orf55) e ao membro 6 da família B (pequeno) da proteína de choque térmico (HSPB6) (Arquivo adicional 3). A metilação do DNA de 4350 CpG (p < 0,01) correlacionou-se com os níveis séricos de IPA e apresentou enriquecimento em vias regulatórias da longevidade (p = 0,006) (Figura 1A, Tabela 2 e Figura Suplementar 1C).
Para compreender os mecanismos biológicos subjacentes às associações entre os níveis séricos de IPA, transcritos globais, transcritos associados à mitocôndria e metilação do DNA no fígado humano, realizamos uma análise de sobreposição dos genes identificados na análise de vias metabólicas anterior (Figura 1A). Os resultados da análise de enriquecimento de vias dos 56 genes sobrepostos (dentro da linha preta na Figura 1A) mostraram que a via da apoptose (p = 0,00029) destacou dois genes comuns às três análises: AKT1 e YKT6 (homólogo de v-SNARE YKT6), conforme mostrado no diagrama de Venn (Figura Suplementar 2 e Figura 1A). Curiosamente, descobrimos que AKT1 (cg19831386) e YKT6 (cg24161647) estavam positivamente correlacionados com os níveis séricos de IPA (Arquivo adicional 3). Para identificar potenciais interações proteicas entre produtos gênicos, selecionamos 13 genes com a maior pontuação de região comum (0,900) entre 56 genes sobrepostos como entrada e construímos um mapa de interação. De acordo com o nível de confiança (confiança marginal), o gene AKT1 com a maior pontuação (0,900) estava no topo (Figura 1B).
Com base na análise de vias metabólicas, descobrimos que a apoptose era a principal via envolvida. Assim, investigamos se o tratamento com IPA afetaria a apoptose de células-tronco hematopoiéticas (HSCs) in vitro. Anteriormente, demonstramos que diferentes doses de IPA (10 μM, 100 μM e 1 mM) não eram tóxicas para as células LX-2 [15]. Este estudo mostrou que o tratamento com IPA nas concentrações de 10 μM e 100 μM aumentou o número de células viáveis ​​e necróticas. No entanto, em comparação com o grupo controle, a viabilidade celular diminuiu na concentração de 1 mM de IPA, enquanto a taxa de necrose celular permaneceu inalterada (Figura 2A, B). Em seguida, para determinar a concentração ideal para induzir apoptose em células LX-2, testamos concentrações de 10 μM, 100 μM e 1 mM de IPA por 24 horas (Figura 2A-E e Figura Suplementar 3A-B). Curiosamente, IPA 10 μM e 100 μM diminuíram a taxa de apoptose (%), enquanto IPA 1 mM aumentou a apoptose tardia e a taxa de apoptose (%) em comparação com o controle e, portanto, foi escolhido para experimentos adicionais (Figuras 2A–D).
O IPA induz apoptose em células LX-2. O método de dupla coloração com Anexina V e 7-AAD foi utilizado para quantificar a taxa de apoptose e a morfologia celular por citometria de fluxo. Células BA foram incubadas com 10 μM, 100 μM e 1 mM de IPA por 24 h ou com F-H TGF-β1 (5 ng/ml) e 1 mM de IPA em meio sem soro por 24 h. A: células vivas (Anexina V -/ 7AAD-); B: células necróticas (Anexina V -/ 7AAD+); C, F: apoptose inicial (Anexina V +/ 7AAD-); D, G: apoptose tardia (Anexina V+/7AAD+); E, H: porcentagem do total de células em apoptose inicial e tardia na taxa de apoptose (%). Os dados são expressos como média ± DP, n = 3 experimentos independentes. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando ANOVA de uma via com teste post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Como demonstrado anteriormente, 5 ng/ml de TGF-β1 podem induzir a ativação de HSCs aumentando a expressão de genes marcadores clássicos [15]. Células LX-2 foram tratadas com 5 ng/ml de TGF-β1 e 1 mM de IPA em combinação (Fig. 2E–H). O tratamento com TGF-β1 não alterou a taxa de apoptose; no entanto, o tratamento concomitante com IPA aumentou a apoptose tardia e a taxa de apoptose (%) em comparação com o tratamento com TGF-β1 (Fig. 2E–H). Esses resultados indicam que 1 mM de IPA pode promover apoptose em células LX-2 independentemente da indução por TGF-β1.
Investigamos ainda o efeito do IPA na respiração mitocondrial em células LX-2. Os resultados mostraram que 1 mM de IPA diminuiu os parâmetros da taxa de consumo de oxigênio (OCR): respiração não mitocondrial, respiração basal e máxima, vazamento de prótons e produção de ATP em comparação com o grupo controle (Figura 3A, B), enquanto o índice de saúde bioenergética (BHI) não se alterou.
O IPA reduz a respiração mitocondrial em células LX-2. A curva de respiração mitocondrial (CRM) é apresentada como parâmetros de respiração mitocondrial (respiração não mitocondrial, respiração basal, respiração máxima, vazamento de prótons, geração de ATP, SRC e BHI). As células A e B foram incubadas com 10 μM, 100 μM e 1 mM de IPA por 24 h, respectivamente. As células C e D foram incubadas com TGF-β1 (5 ng/ml) e 1 mM de IPA em meio sem soro por 24 h, respectivamente. Todas as medidas foram normalizadas para o conteúdo de DNA usando o kit CyQuant. BHI: índice de saúde bioenergética; SRC: capacidade de reserva respiratória; CRM: taxa de consumo de oxigênio. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP), n = 5 experimentos independentes. As comparações estatísticas foram realizadas usando ANOVA de uma via e teste post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; e ***p < 0,001
Para obter uma compreensão mais abrangente do efeito do IPA no perfil bioenergético das células LX-2 ativadas por TGF-β1, analisamos a fosforilação oxidativa mitocondrial por OCR (Fig. 3C,D). Os resultados mostraram que o tratamento com TGF-β1 reduziu a respiração máxima, a capacidade de reserva respiratória (CRR) e o índice de hiperemia reativa (IHR) em comparação com o grupo controle (Fig. 3C,D). Além disso, o tratamento combinado diminuiu a respiração basal, o vazamento de prótons e a produção de ATP, mas a CRR e o IHR foram significativamente maiores do que os observados no grupo tratado apenas com TGF-β1 (Fig. 3C,D).
Realizamos também o “Teste de Fenótipo de Energia Celular” fornecido pelo software Seahorse (Figura Suplementar 4A–D). Como mostrado na Figura Suplementar 3B, os potenciais metabólicos de OCR e ECAR diminuíram após o tratamento com TGF-β1; no entanto, nenhuma diferença foi observada nos grupos tratados com a combinação de terapias e com IPA em comparação ao grupo controle. Além disso, os níveis basais e de estresse de OCR diminuíram após o tratamento com a combinação de terapias e com IPA em comparação ao grupo controle (Figura Suplementar 4C). Curiosamente, um padrão semelhante foi observado com a terapia combinada, onde nenhuma alteração nos níveis basais e de estresse de ECAR foi observada em comparação ao tratamento com TGF-β1 (Figura Suplementar 4C). Nas HSCs, a redução na fosforilação oxidativa mitocondrial e a capacidade do tratamento combinado de restaurar a SCR e a BHI após a exposição ao tratamento com TGF-β1 não alteraram o potencial metabólico (OCR e ECAR). Em conjunto, esses resultados indicam que o IPA pode reduzir a bioenergética nas HSCs, sugerindo que o IPA pode induzir um perfil energético mais baixo que desloca o fenótipo das HSCs em direção à inativação (Figura Suplementar 4D).
O efeito do IPA na dinâmica mitocondrial foi investigado utilizando quantificação tridimensional da morfologia mitocondrial e conexões da rede, bem como coloração MTR (Figura 4 e Figura Suplementar 5). A Figura 4 mostra que, em comparação com o grupo controle, o tratamento com TGF-β1 diminuiu a área superficial média, o número de ramificações, o comprimento total das ramificações e o número de junções entre ramificações (Figura 4A e B) e alterou a proporção de mitocôndrias de morfologia esférica para intermediária (Figura 4C). Somente o tratamento com IPA diminuiu o volume mitocondrial médio e alterou a proporção de mitocôndrias de morfologia esférica para intermediária em comparação com o grupo controle (Figura 4A). Em contraste, a esfericidade, o comprimento médio das ramificações e a atividade mitocondrial avaliada por MTR dependente do potencial de membrana mitocondrial (Figura 4A e E) permaneceram inalterados e esses parâmetros não diferiram entre os grupos. Em conjunto, esses resultados sugerem que o tratamento com TGF-β1 e IPA parece modular a forma e o tamanho das mitocôndrias, bem como a complexidade da rede em células LX-2 vivas.
O IPA altera a dinâmica mitocondrial e a abundância de DNA mitocondrial em células LX-2. A. Imagens representativas de microscopia confocal de células LX-2 vivas incubadas com TGF-β1 (5 ng/ml) e 1 mM de IPA por 24 h em meio sem soro, mostrando redes mitocondriais coradas com Mitotracker™ Red CMXRos e núcleos corados em azul com DAPI. Todos os dados continham pelo menos 15 imagens por grupo. Adquirimos 10 imagens de pilha Z para cada tipo de amostra. Cada sequência do eixo Z continha 30 fatias, cada uma com uma espessura de 9,86 μm. Barra de escala: 10 μm. B. Objetos representativos (apenas mitocôndrias) identificados pela aplicação de limiar adaptativo à imagem. A análise quantitativa e a comparação das conexões da rede morfológica mitocondrial foram realizadas para todas as células em cada grupo. C. Frequência das proporções de forma mitocondrial. Valores próximos de 0 indicam formas esféricas e valores próximos de 1 indicam formas filamentosas. D O conteúdo de DNA mitocondrial (mtDNA) foi determinado conforme descrito em Materiais e Métodos. E A análise de Mitotracker™ Red CMXRos foi realizada por citometria de fluxo (30.000 eventos) conforme descrito em Materiais e Métodos. Os dados são apresentados como média ± DP, n = 3 experimentos independentes. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando ANOVA de uma via e teste post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Em seguida, analisamos o conteúdo de mtDNA em células LX-2 como um indicador do número de mitocôndrias. Comparado ao grupo controle, o conteúdo de mtDNA aumentou no grupo tratado com TGF-β1 (Figura 4D). Comparado ao grupo tratado com TGF-β1, o conteúdo de mtDNA diminuiu no grupo de tratamento combinado (Figura 4D), sugerindo que o IPA pode reduzir o conteúdo de mtDNA e possivelmente o número de mitocôndrias, bem como a respiração mitocondrial (Figura 3C). Além disso, o IPA pareceu reduzir o conteúdo de mtDNA no tratamento combinado, mas não afetou a atividade mitocondrial mediada por MTR (Figuras 4A–C).
Investigamos a associação do IPA com os níveis de mRNA de genes relacionados à fibrose, apoptose, sobrevivência e dinâmica mitocondrial em células LX-2 (Figura 5A–D). Comparado ao grupo controle, o grupo tratado com TGF-β1 apresentou aumento na expressão de genes como a cadeia α2 do colágeno tipo I (COL1A2), α-actina do músculo liso (αSMA), metaloproteinase de matriz 2 (MMP2), inibidor tecidual de metaloproteinase 1 (TIMP1) e gene semelhante à dinamina 1 (DRP1), indicando aumento da fibrose e ativação. Além disso, em comparação com o grupo controle, o tratamento com TGF-β1 reduziu os níveis de mRNA do receptor nuclear de pregnano X (PXR), caspase 8 (CASP8), MAPKAPK3, inibidor de células B α, peptídeo leve do fator nuclear κB1A (NFκB1A) e inibidor da subunidade β da quinase do fator nuclear κB (IKBKB) (Figura 5A–D). Em comparação com o tratamento com TGF-β1, o tratamento combinado com TGF-β1 e IPA reduziu a expressão de COL1A2 e MMP2, mas aumentou os níveis de mRNA de PXR, TIMP1, linfoma de células B-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β e IKBKB. O tratamento com IPA diminuiu significativamente a expressão de MMP2, proteína X associada a Bcl-2 (BAX), AKT1, proteína 1 de atrofia óptica (OPA1) e proteína 2 de fusão mitocondrial (MFN2), enquanto a expressão de CASP8, NFκB1A, NFκB1B e IKBKB aumentou em comparação com o grupo controle. No entanto, não houve diferença na expressão de caspase-3 (CASP3), fator 1 de ativação da peptidase apoptótica (APAF1), proteína 1 de fusão mitocondrial (MFN1) e proteína 1 de fissão (FIS1). Em conjunto, esses resultados sugerem que o tratamento com IPA modula a expressão de genes associados à fibrose, apoptose, sobrevivência e dinâmica mitocondrial. Nossos dados sugerem que o tratamento com IPA reduz a fibrose em células LX-2; ao mesmo tempo, estimula a sobrevivência, alterando o fenótipo para inativação.
O IPA modula a expressão de genes relacionados a fibroblastos, apoptose, viabilidade e dinâmica mitocondrial em células LX-2. Os histogramas mostram a expressão de mRNA relativa ao controle endógeno (RPLP0 ou PPIA) após a indução de células LX-2 com TGF-β1 e IPA em meio livre de soro por 24 horas. A indica fibroblastos, B indica células apoptóticas, C indica células sobreviventes e D indica a expressão de genes relacionados à dinâmica mitocondrial. Os dados são apresentados como média ± desvio padrão (DP), n = 3 experimentos independentes. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando ANOVA de uma via e teste post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Em seguida, as alterações no tamanho celular (FSC-H) e na complexidade citoplasmática (SSC-H) foram avaliadas por citometria de fluxo (Figura 6A,B), e as alterações na morfologia celular após o tratamento com IPA foram avaliadas por microscopia eletrônica de transmissão (MET) e microscopia de contraste de fase (Figura Suplementar 6A-B). Como esperado, as células no grupo tratado com TGF-β1 aumentaram de tamanho em comparação com o grupo controle (Figura 6A,B), mostrando a expansão clássica do retículo endoplasmático rugoso (RER*) e dos fagolisossomos (P), indicando a ativação de células-tronco hematopoiéticas (CTH) (Figura Suplementar 6A). No entanto, em comparação com o grupo tratado com TGF-β1, o tamanho celular, a complexidade citoplasmática (Figura 6A,B) e o conteúdo de RER* diminuíram no grupo tratado com a combinação de TGF-β1 e IPA (Figura Suplementar 6A). Além disso, o tratamento com IPA diminuiu o tamanho celular, a complexidade citoplasmática (Figs. 6A,B), o conteúdo de P e ER* (Fig. suplementar 6A) em comparação com o grupo controle. Adicionalmente, o conteúdo de células apoptóticas aumentou após 24 h de tratamento com IPA em comparação com o grupo controle (setas brancas, Fig. suplementar 6B). Em conjunto, esses resultados sugerem que 1 mM de IPA pode estimular a apoptose de HSCs e reverter as alterações nos parâmetros morfológicos celulares induzidas por TGF-β1, regulando assim o tamanho e a complexidade celular, o que pode estar associado à inativação de HSCs.
O IPA altera o tamanho celular e a complexidade citoplasmática em células LX-2. Imagens representativas da análise por citometria de fluxo. A análise utilizou uma estratégia de gating específica para células LX-2: SSC-A/FSC-A para definir a população celular, FSC-H/FSC-A para identificar dupletos e SSC-H/FSC-H para análise do tamanho e da complexidade celular. As células foram incubadas com TGF-β1 (5 ng/ml) e 1 mM de IPA em meio sem soro por 24 h. As células LX-2 foram distribuídas no quadrante inferior esquerdo (SSC-H-/FSC-H-), quadrante superior esquerdo (SSC-H+/FSC-H-), quadrante inferior direito (SSC-H-/FSC-H+) e quadrante superior direito (SSC-H+/FSC-H+) para análise do tamanho e da complexidade citoplasmática. B. A morfologia celular foi analisada por citometria de fluxo utilizando FSC-H (dispersão frontal, tamanho celular) e SSC-H (dispersão lateral, complexidade citoplasmática) (30.000 eventos). Os dados são apresentados como média ± DP, n = 3 experimentos independentes. As comparações estatísticas foram realizadas utilizando ANOVA de uma via e teste post hoc de Bonferroni. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 e ****p < 0,0001
Metabólitos intestinais como o IPA tornaram-se um tema de pesquisa relevante, sugerindo que novos alvos podem ser descobertos na microbiota intestinal. É interessante, portanto, que o IPA, um metabólito que associamos à fibrose hepática em humanos [15], tenha se mostrado um potencial composto antifibrótico em modelos animais [13, 14]. Aqui, demonstramos pela primeira vez uma associação entre o IPA sérico e a transcriptômica hepática global e a metilação do DNA em indivíduos obesos sem diabetes tipo 2 (DM2), destacando apoptose, mitofagia e longevidade, bem como um possível gene candidato, o AKT1, que regula a homeostase hepática. Outra novidade do nosso estudo é que demonstramos a interação do tratamento com IPA com apoptose, morfologia celular, bioenergética e dinâmica mitocondrial em células LX-2, indicando um espectro de energia mais baixo que desloca o fenótipo das células estreladas hepáticas (HSC) para a inativação, tornando o IPA um potencial candidato para melhorar a fibrose hepática.
Descobrimos que apoptose, mitofagia e longevidade foram as vias canônicas mais importantes enriquecidas em genes hepáticos associados ao IPA sérico circulante. A disrupção do sistema de controle de qualidade mitocondrial (MQC) pode levar à disfunção mitocondrial, mitofagia e apoptose, promovendo assim a ocorrência de MASLD [33, 34]. Portanto, podemos especular que o IPA pode estar envolvido na manutenção da dinâmica celular e da integridade mitocondrial por meio de apoptose, mitofagia e longevidade no fígado. Nossos dados mostraram que dois genes foram comuns nos três ensaios: YKT6 e AKT1. Vale ressaltar que YKT6 é uma proteína SNARE envolvida no processo de fusão da membrana celular. Ela desempenha um papel na autofagia e mitofagia, formando um complexo de iniciação com STX17 e SNAP29 no autofagossomo, promovendo assim a fusão de autofagossomos e lisossomos [35]. Além disso, a perda da função de YKT6 resulta em comprometimento da mitofagia[36], enquanto a superexpressão de YKT6 está associada à progressão do carcinoma hepatocelular (CHC), demonstrando aumento da sobrevida celular[37]. Por outro lado, AKT1 é o gene de interação mais importante e desempenha um papel crucial em doenças hepáticas, incluindo a via de sinalização PI3K/AKT, o ciclo celular, a migração celular, a proliferação, a adesão focal, a função mitocondrial e a secreção de colágeno[38–40]. A ativação da via de sinalização PI3K/AKT pode ativar células-tronco hematopoiéticas (CTHs), responsáveis ​​pela produção da matriz extracelular (MEC), e sua desregulação pode contribuir para a ocorrência e progressão da fibrose hepática[40]. Ademais, AKT é um dos principais fatores de sobrevivência celular que inibe a apoptose celular dependente de p53, e a ativação de AKT pode estar associada à inibição da apoptose de células hepáticas[41, 42]. Os resultados obtidos sugerem que o IPA pode estar envolvido na apoptose associada às mitocôndrias hepáticas, influenciando a decisão dos hepatócitos entre entrar em apoptose ou sobreviver. Esses efeitos podem ser regulados pelos genes candidatos AKT e/ou YKT6, que são cruciais para a homeostase hepática.
Nossos resultados mostraram que 1 mM de IPA induziu apoptose e diminuiu a respiração mitocondrial em células LX-2, independentemente do tratamento com TGF-β1. É importante ressaltar que a apoptose é uma via importante para a resolução da fibrose e ativação de células-tronco hematopoiéticas (CTH), sendo também um evento chave na resposta fisiológica reversível da fibrose hepática [4, 43]. Além disso, a restauração do BHI em células LX-2 após o tratamento combinado forneceu novas informações sobre o papel potencial do IPA na regulação da bioenergética mitocondrial. Em condições de repouso e inatividade, as células hematopoiéticas normalmente utilizam a fosforilação oxidativa mitocondrial para produzir ATP e apresentam baixa atividade metabólica. Por outro lado, a ativação de CTH aumenta a respiração e a biossíntese mitocondrial para compensar as demandas energéticas da entrada no estado glicolítico [44]. O fato de o IPA não ter afetado o potencial metabólico e o ECAR sugere que a via glicolítica é menos priorizada. De forma semelhante, outro estudo mostrou que 1 mM de IPA foi capaz de modular a atividade da cadeia respiratória mitocondrial em cardiomiócitos, na linhagem celular de hepatócitos humanos (Huh7) e em células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC); no entanto, nenhum efeito do IPA foi encontrado na glicólise em cardiomiócitos, sugerindo que o IPA pode afetar a bioenergética de outros tipos celulares [45]. Portanto, especulamos que 1 mM de IPA pode atuar como um desacoplador químico suave, uma vez que pode reduzir significativamente a expressão de genes fibrogênicos, a morfologia celular e a bioenergética mitocondrial sem alterar a quantidade de mtDNA [46]. Desacopladores mitocondriais podem inibir a fibrose induzida por cultura e a ativação de HSC [47] e reduzir a produção de ATP mitocondrial regulada ou induzida por certas proteínas, como proteínas desacopladoras (UCP) ou translocase de nucleotídeos de adenina (ANT). Dependendo do tipo celular, esse fenômeno pode proteger as células da apoptose e/ou promovê-la [46]. No entanto, são necessários mais estudos para elucidar o papel do IPA como um desacoplador mitocondrial na inativação de células-tronco hematopoiéticas.
Em seguida, investigamos se as alterações na respiração mitocondrial se refletem na morfologia mitocondrial em células LX-2 vivas. Curiosamente, o tratamento com TGF-β1 altera a proporção de mitocôndrias de esféricas para intermediárias, com diminuição da ramificação mitocondrial e aumento da expressão de DRP1, um fator chave na fissão mitocondrial [48]. Além disso, a fragmentação mitocondrial está associada à complexidade geral da rede, e a transição da fusão para a fissão é crucial para a ativação de células-tronco hematopoiéticas (CTHs), enquanto a inibição da fissão mitocondrial leva à apoptose de CTHs [49]. Assim, nossos resultados indicam que o tratamento com TGF-β1 pode induzir uma diminuição na complexidade da rede mitocondrial com redução da ramificação, o que é mais comum na fissão mitocondrial associada à ativação de células-tronco hematopoiéticas (CTHs). Além disso, nossos dados mostraram que o IPA pode alterar a proporção de mitocôndrias de esféricas para intermediárias, reduzindo, assim, a expressão de OPA1 e MFN2. Estudos demonstraram que a regulação negativa de OPA1 pode causar uma diminuição no potencial da membrana mitocondrial e desencadear a apoptose celular [50]. Sabe-se que MFN2 medeia a fusão mitocondrial e a apoptose [51]. Os resultados obtidos sugerem que a indução de células LX-2 por TGF-β1 e/ou IPA parece modular a forma e o tamanho das mitocôndrias, bem como o estado de ativação e a complexidade da rede.
Nossos resultados indicam que o tratamento combinado de TGFβ-1 e IPA pode reduzir o mtDNA e os parâmetros morfológicos celulares, regulando a expressão de mRNA de genes relacionados à fibrose, apoptose e sobrevivência em células que escapam da apoptose. De fato, o IPA diminuiu o nível de expressão de mRNA de AKT1 e de importantes genes de fibrose, como COL1A2 e MMP2, mas aumentou o nível de expressão de CASP8, que está associado à apoptose. Nossos resultados mostraram que, após o tratamento com IPA, a expressão de BAX diminuiu e a expressão de mRNA das subunidades da família TIMP1, BCL-2 e NF-κB aumentou, sugerindo que o IPA pode estimular sinais de sobrevivência em células-tronco hematopoiéticas (CTHs) que escapam da apoptose. Essas moléculas podem atuar como sinais pró-sobrevivência em células-tronco hematopoiéticas ativadas, o que pode estar associado ao aumento da expressão de proteínas antiapoptóticas (como Bcl-2), à diminuição da expressão da proteína pró-apoptótica BAX e a uma interação complexa entre TIMP e NF-κB [5, 7]. O IPA exerce seus efeitos através do PXR, e observamos que o tratamento combinado com TGF-β1 e IPA aumentou os níveis de expressão do mRNA do PXR, indicando a supressão da ativação de células-tronco hematopoiéticas (CTHs). Sabe-se que a sinalização do PXR ativado inibe a ativação de CTHs tanto in vivo quanto in vitro [52, 53]. Nossos resultados indicam que o IPA pode participar da eliminação de CTHs ativadas, promovendo apoptose, reduzindo a fibrose e o metabolismo mitocondrial e aumentando os sinais de sobrevivência, processos típicos que convertem o fenótipo de CTH ativada em um fenótipo inativado. Outra possível explicação para o potencial mecanismo e papel do IPA na apoptose é que ele remove mitocôndrias disfuncionais principalmente por meio da mitofagia (via intrínseca) e da via de sinalização extrínseca do TNF (Tabela 1), que está diretamente ligada à via de sinalização de sobrevivência NF-κB (Figura Suplementar 7). Curiosamente, genes enriquecidos relacionados ao IPA são capazes de induzir sinais pró-apoptóticos e pró-sobrevivência na via apoptótica [54], sugerindo que o IPA pode induzir a via apoptótica ou a sobrevivência interagindo com esses genes. No entanto, como o IPA induz apoptose ou sobrevivência durante a ativação de HSCs e seus mecanismos ainda não estão claros.
O IPA é um metabólito microbiano formado a partir do triptofano dietético pela microbiota intestinal. Estudos demonstraram que ele possui propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e reguladoras epigenéticas no ambiente intestinal.[55] Estudos mostraram que o IPA pode modular a função da barreira intestinal e reduzir o estresse oxidativo, o que pode contribuir para seus efeitos fisiológicos locais.[56] De fato, o IPA é transportado para os órgãos-alvo pela circulação sanguínea e, como compartilha uma estrutura de metabólito principal semelhante à do triptofano, serotonina e derivados de indol, exerce ações metabólicas que resultam em destinos metabólicos competitivos.[52] O IPA pode competir com metabólitos derivados do triptofano por sítios de ligação em enzimas ou receptores, potencialmente interrompendo vias metabólicas normais. Isso destaca a necessidade de mais estudos sobre sua farmacocinética e farmacodinâmica para melhor compreender sua janela terapêutica.[57] Resta saber se isso também pode ocorrer em células-tronco hematopoiéticas (CTHs).
Reconhecemos que nosso estudo apresenta algumas limitações. Para examinar especificamente as associações relacionadas ao IPA, excluímos pacientes com diabetes mellitus tipo 2 (DM2). Reconhecemos que isso limita a ampla aplicabilidade de nossos achados a pacientes com diabetes mellitus tipo 2 e doença hepática avançada. Embora a concentração fisiológica de IPA no soro humano seja de 1–10 μM [11, 20], uma concentração de 1 mM de IPA foi escolhida com base na maior concentração não tóxica [15] e na maior taxa de apoptose, sem diferença na porcentagem da população de células necróticas. Embora níveis suprafisiológicos de IPA tenham sido utilizados neste estudo, atualmente não há consenso sobre a dose efetiva de IPA [52]. Embora nossos resultados sejam significativos, o destino metabólico mais amplo do IPA permanece uma área ativa de pesquisa. Além disso, nossos achados sobre a associação entre os níveis séricos de IPA e a metilação do DNA de transcritos hepáticos foram obtidos não apenas de células-tronco hematopoiéticas (CTHs), mas também de tecidos hepáticos. Optamos por utilizar células humanas LX-2 com base em nossas descobertas anteriores de análise do transcriptoma, que demonstraram que o IPA está associado à ativação de células-tronco hematopoiéticas (CTH) [15], e que as CTH são as principais células envolvidas na progressão da fibrose hepática. O fígado é composto por múltiplos tipos celulares, portanto, outros modelos celulares, como o sistema de cocultura de hepatócitos, CTH e células imunes, combinado com a ativação de caspase e fragmentação de DNA, bem como o mecanismo de ação, incluindo o nível proteico, devem ser considerados para estudar o papel do IPA e sua interação com outros tipos celulares hepáticos.