Diferentes teorias de defesa vegetal fornecem importantes orientações teóricas para explicar os padrões do metabolismo especializado das plantas, mas suas principais previsões ainda precisam ser testadas. Aqui, utilizamos a análise imparcial por espectrometria de massas em tandem (MS/MS) para explorar sistematicamente o metaboloma de linhagens atenuadas de tabaco, desde plantas individuais até populações e espécies intimamente relacionadas, e processamos um grande número de teorias de características espectrométricas de massas baseadas em espectros de compostos na estrutura informacional para testar as principais previsões das teorias de defesa ótima (DO) e alvo móvel (AM). O componente informacional da metabolômica vegetal é consistente com a teoria da DO, mas contradiz a principal previsão da teoria do AM sobre a dinâmica metabolômica causada por herbívoros. Da escala micro à macro evolutiva, o sinal do jasmonato foi identificado como o principal determinante da DO, enquanto o sinal do etileno proporcionou o ajuste fino da resposta específica ao herbívoro, anotada pela rede molecular MS/MS.
Metabólitos especiais com estruturas diversas são os principais participantes na adaptação das plantas ao ambiente, especialmente na defesa contra inimigos (1). A surpreendente diversificação do metabolismo especializado encontrado nas plantas estimulou décadas de pesquisa aprofundada sobre seus múltiplos aspectos de funções ecológicas e formou uma longa lista de teorias de defesa vegetal, que representam o desenvolvimento evolutivo e ecológico das interações planta-inseto. A pesquisa empírica fornece orientações importantes (2). No entanto, essas teorias de defesa vegetal não seguiram o caminho normativo do raciocínio dedutivo hipotético, no qual as principais previsões estavam no mesmo nível de análise (3) e eram testadas experimentalmente para avançar o próximo ciclo de desenvolvimento teórico (4). Limitações técnicas restringem a coleta de dados a categorias metabólicas específicas e excluem a análise abrangente de metabólitos especializados, impedindo, assim, comparações intercategorias essenciais para o desenvolvimento teórico (5). A falta de dados metabolômicos abrangentes e de uma moeda comum para comparar o fluxo de trabalho de processamento do espaço metabólico entre diferentes grupos de plantas dificulta a maturidade científica da área.
Os desenvolvimentos mais recentes no campo da metabolômica por espectrometria de massa em tandem (MS/MS) podem caracterizar de forma abrangente as alterações metabólicas dentro e entre espécies de um determinado clado do sistema, e podem ser combinados com métodos computacionais para calcular a similaridade estrutural entre essas misturas complexas. Conhecimento prévio de química (5). A combinação de tecnologias avançadas em análise e computação fornece uma estrutura necessária para o teste a longo prazo de muitas previsões feitas pelas teorias ecológicas e evolutivas da diversidade metabólica. Shannon (6) introduziu a teoria da informação pela primeira vez em seu artigo seminal de 1948, lançando as bases para a análise matemática da informação, que tem sido usada em muitos campos além de sua aplicação original. Em genômica, a teoria da informação tem sido aplicada com sucesso para quantificar informações conservadas de sequências (7). Em pesquisas de transcriptômica, a teoria da informação analisa as mudanças gerais no transcriptoma (8). Em pesquisas anteriores, aplicamos a estrutura estatística da teoria da informação à metabolômica para descrever a expertise metabólica em nível tecidual em plantas (9). Neste trabalho, combinamos o fluxo de trabalho baseado em MS/MS com a estrutura estatística da teoria da informação, caracterizada pela diversidade metabólica na moeda comum, para comparar as principais previsões da teoria de defesa vegetal do metaboloma induzido por herbívoros.
Os arcabouços teóricos da defesa vegetal são geralmente inclusivos entre si e podem ser divididos em duas categorias: aqueles que tentam explicar a distribuição de metabólitos específicos de plantas com base em funções de defesa, como a teoria da defesa ótima (DO) (10), a teoria do alvo móvel (TM) (11) e a teoria da aparência (12), enquanto outros buscam explicações mecânicas de como as mudanças na disponibilidade de recursos afetam o crescimento da planta e o acúmulo de metabólitos especializados, como a hipótese do balanço de carbono e nutrientes (13), a hipótese da taxa de crescimento (14) e a hipótese do equilíbrio de crescimento e diferenciação (15). Os dois conjuntos de teorias estão em diferentes níveis de análise (4). No entanto, duas teorias envolvendo funções defensivas no nível funcional dominam a discussão sobre as defesas constitutivas e induzíveis das plantas: a teoria da DO, que assume que as plantas investem em suas dispendiosas defesas químicas apenas quando necessário, por exemplo, quando são ingeridas. Quando um animal herbívoro ataca, portanto, de acordo com a possibilidade de ataque futuro, o composto com função defensiva é atribuído (10); A hipótese MT propõe que não existe um eixo de mudança metabólica direcional, mas que as mudanças metabólicas ocorrem aleatoriamente, criando assim a possibilidade de obstruir o “alvo de movimento” metabólico dos herbívoros atacantes. Em outras palavras, essas duas teorias fazem previsões opostas sobre a remodelação metabólica que ocorre após o ataque de herbívoros: a relação entre o acúmulo unidirecional de metabólitos com função defensiva (OD) e mudanças metabólicas não direcionadas (MT) (11).
As hipóteses OD e MT envolvem não apenas as alterações induzidas no metaboloma, mas também as consequências ecológicas e evolutivas do acúmulo desses metabólitos, como os custos e benefícios adaptativos dessas alterações metabólicas em um ambiente ecológico específico (16). Embora ambas as hipóteses reconheçam a função defensiva de metabólitos especializados, que podem ou não ser dispendiosos, a principal previsão que distingue as hipóteses OD e MT reside na direcionalidade das alterações metabólicas induzidas. A previsão da teoria OD tem recebido maior atenção experimental até o momento. Esses testes incluem o estudo das funções de defesa direta ou indireta de diferentes tecidos de compostos específicos em estufas e em condições naturais, bem como mudanças no estágio de desenvolvimento da planta (17-19). No entanto, até o momento, devido à falta de um fluxo de trabalho e de uma estrutura estatística para a análise global e abrangente da diversidade metabólica de qualquer organismo, a principal diferença prevista entre as duas teorias (ou seja, a direção das alterações metabólicas) ainda precisa ser testada. Aqui, fornecemos tal análise.
Uma das características mais significativas dos metabólitos específicos de plantas é a sua extrema diversidade estrutural em todos os níveis, desde plantas individuais e populações até espécies semelhantes (20). Muitas mudanças quantitativas em metabólitos especializados podem ser observadas na escala populacional, enquanto fortes diferenças qualitativas são geralmente mantidas no nível de espécie (20). Portanto, a diversidade metabólica das plantas é o principal aspecto da diversidade funcional, refletindo a adaptabilidade a diferentes nichos, especialmente aqueles com diferentes possibilidades de invasão por insetos específicos e herbívoros comuns (21). Desde o artigo pioneiro de Fraenkel (22) sobre as razões para a existência de metabólitos específicos de plantas, as interações com vários insetos têm sido consideradas importantes pressões seletivas, e acredita-se que essas interações tenham moldado as plantas durante a evolução. Diferenças interespecíficas na diversidade de metabólitos especializados também podem refletir o equilíbrio fisiológico associado à defesa constitutiva e induzível das plantas contra estratégias herbívoras, visto que as duas espécies são frequentemente correlacionadas negativamente (24). Embora possa ser benéfico manter uma boa defesa em todos os momentos, as mudanças metabólicas oportunas associadas à defesa proporcionam benefícios claros, permitindo que as plantas aloquem recursos valiosos para outros investimentos fisiológicos (19, 24) e evitem a necessidade de simbiose. Danos colaterais (25). Além disso, essas reorganizações de metabólitos especializados causadas por insetos herbívoros podem levar a uma distribuição destrutiva na população (26) e podem refletir leituras diretas de mudanças naturais substanciais no sinal do ácido jasmônico (AJ), que podem ser mantidas na população. Sinais altos e baixos de AJ representam compensações entre a defesa contra herbívoros e a competição com espécies específicas (27). Ademais, as vias biossintéticas de metabólitos especializados sofrem perda e transformação rápidas durante a evolução, resultando em distribuição metabólica irregular entre espécies intimamente relacionadas (28). Esses polimorfismos podem ser estabelecidos rapidamente em resposta a mudanças nos padrões de herbivoria (29), o que significa que a flutuação das comunidades de herbívoros é um fator chave que impulsiona a heterogeneidade metabólica.
Aqui, resolvemos especificamente os seguintes problemas: (I) Como o inseto herbívoro reconfigura o metaboloma da planta? (II) Quais são os principais componentes de informação da plasticidade metabólica que podem ser quantificados para testar as previsões da teoria da defesa a longo prazo? (III) Se o metaboloma da planta é reprogramado de uma forma específica para o atacante, e, em caso afirmativo, qual o papel do hormônio vegetal na modulação de uma resposta metabólica específica, e quais metabólitos contribuem para a especificidade da defesa em relação à espécie? (IV) Uma vez que as previsões feitas por muitas teorias de defesa podem ser estendidas a todos os níveis de tecidos biológicos, questionamos qual a consistência da resposta metabólica resultante, comparando-a internamente com a comparação entre espécies. Para tanto, estudamos sistematicamente o metaboloma foliar do tabaco *N. nasi*, uma planta modelo ecológica com metabolismo especializado e eficaz contra as larvas de dois herbívoros nativos: *Lepidoptera datura* (Ms) (muito agressiva, principalmente consumida) da família Solanaceae e *Spodoptera littoralis* (Sl), lagartas-do-algodoeiro, que constituem um tipo de "gênero", com plantas hospedeiras da família Solanaceae e outras hospedeiras de outros gêneros e famílias. Analisamos o espectro metabolômico MS/MS e extraímos descritores estatísticos da teoria da informação para comparar as teorias de OD (doença de odor) e MT (metabolismo metabólico). Criamos mapas de especificidade para revelar a identidade dos principais metabólitos. A análise foi estendida à população nativa de *N. nasi* e a espécies de tabaco intimamente relacionadas para analisar mais detalhadamente a covariância entre a sinalização hormonal vegetal e a indução de OD.
Para obter um panorama geral da plasticidade e estrutura do metaboloma foliar do tabaco herbívoro, utilizamos um fluxo de trabalho de análise e cálculo previamente desenvolvido para coletar e deconvoluir de forma abrangente espectros MS/MS independentes de alta resolução de extratos vegetais (9). Esse método não diferenciado (denominado MS/MS) permite a construção de espectros de compostos não redundantes, que podem então ser utilizados em todas as análises em nível de composto descritas aqui. Esses metabólitos vegetais deconvoluídos são de diversos tipos, consistindo em centenas a milhares de metabólitos (cerca de 500-1000 s/MS/MS neste caso). Aqui, consideramos a plasticidade metabólica no âmbito da teoria da informação e quantificamos a diversidade e a especificidade do metaboloma com base na entropia de Shannon da distribuição de frequência metabólica. Utilizando a fórmula previamente implementada (8), calculamos um conjunto de indicadores que podem ser usados ​​para quantificar a diversidade do metaboloma (indicador Hj), a especialização do perfil metabólico (indicador δj) e a especificidade metabólica de um único metabólito (indicador Si). Além disso, aplicamos o Índice de Plasticidade da Distância Relativa (RDPI) para quantificar a indutibilidade do metaboloma por herbívoros (Figura 1A) (30). Dentro dessa estrutura estatística, tratamos o espectro MS/MS como a unidade básica de informação e processamos a abundância relativa de MS/MS em um mapa de distribuição de frequência, utilizando então a entropia de Shannon para estimar a diversidade do metaboloma a partir dele. A especialização do metaboloma é medida pela especificidade média de um único espectro MS/MS. Portanto, o aumento na abundância de algumas classes de MS/MS após a indução por herbívoros se transforma em indutibilidade espectral, RDPI e especialização, ou seja, no aumento do índice δj, devido à produção de metabólitos mais especializados e, consequentemente, a um alto índice Si. A redução do índice de diversidade Hj reflete a diminuição do número de MS/MS gerados ou uma mudança na distribuição de frequência dos perfis em uma direção menos uniforme, reduzindo, assim, sua incerteza geral. Através do cálculo do índice Si, é possível destacar quais MS/MS são induzidos por determinados herbívoros e, inversamente, quais MS/MS não respondem à indução, o que é um indicador fundamental para distinguir a predição de MT e OD.
(A) Descritores estatísticos usados ​​para dados de MS/MS de herbívoros (H1 a Hx): indutibilidade de metabólitos (RDPI), diversidade (índice Hj), especialização (índice δj) e especificidade de metabólitos (índice Si). Um aumento no grau de especialização (δj) indica que, em média, mais metabólitos específicos de herbívoros serão produzidos, enquanto uma diminuição na diversidade (Hj) indica uma diminuição na produção de metabólitos ou uma distribuição desigual de metabólitos no mapa de distribuição. O valor de Si avalia se o metabólito é específico para uma determinada condição (aqui, herbívora) ou, inversamente, se mantém no mesmo nível. (B) Diagrama conceitual da previsão da teoria de defesa usando o eixo da teoria da informação. A teoria OD prevê que o ataque de herbívoros aumentará os metabólitos de defesa, aumentando assim o δj. Ao mesmo tempo, o Hj diminui porque o perfil é reorganizado em direção à redução da incerteza da informação metabólica. A teoria MT prevê que o ataque de herbívoros causará alterações não direcionais no metaboloma, aumentando assim Hj como um indicador de maior incerteza na informação metabólica e causando uma distribuição aleatória de Si. Também propusemos um modelo misto, o melhor MT, no qual alguns metabólitos com valores defensivos mais altos terão seus níveis particularmente aumentados (valor de Si alto), enquanto outros exibirão respostas aleatórias (valor de Si baixo).
Utilizando descritores da teoria da informação, interpretamos a teoria OD para prever que alterações metabólicas específicas induzidas por herbívoros em um estado constitutivo não induzido levarão a (i) um aumento na especificidade metabólica (índice Si), impulsionando a especificidade metabonômica (índice δj) – o aumento de certos grupos de metabólitos específicos com maior valor de defesa – e (ii) a diminuição da diversidade do metaboloma (índice Hj) devido à mudança na distribuição da frequência metabólica para uma distribuição mais próxima dos corpos de leptina. No nível de um único metabólito, espera-se uma distribuição ordenada de Si, onde o metabólito aumentará o valor de Si de acordo com seu valor de defesa (Figura 1B). Nessa mesma linha, explicamos a teoria MT para prever que a excitação levará a (i) alterações não direcionais nos metabólitos, resultando em uma diminuição no índice δj, e (ii) um aumento no índice Hj devido a um aumento na incerteza metabólica, ou aleatoriedade, que pode ser quantificada pela entropia de Shannon na forma de diversidade generalizada. Quanto à composição metabólica, a teoria MT prevê a distribuição aleatória de Si. Levando em consideração que certos metabólitos estão sujeitos a condições específicas, enquanto outros não, e que seu valor de defesa depende do ambiente, propusemos também um modelo de defesa mista, no qual δj e Hj são distribuídos em duas direções ao longo do aumento de Si. Somente certos grupos de metabólitos, que possuem valores de defesa mais elevados, apresentarão um aumento significativo de Si, enquanto outros terão uma distribuição aleatória (Figura 1B).
Para testar a previsão da teoria de defesa redefinida no eixo do descritor da teoria da informação, criamos larvas de herbívoros especialistas (Ms) ou generalistas (Sl) nas folhas de Nepenthes pallens (Figura 2A). Usando análise MS/MS, recuperamos 599 espectros MS/MS não redundantes (arquivo de dados S1) de extratos metanólicos de tecido foliar coletados após a alimentação das lagartas. O uso dos índices RDPI, Hj e δj para visualizar a reconfiguração do conteúdo de informação nos arquivos de configuração MS/MS revela padrões interessantes (Figura 2B). A tendência geral é que, conforme descrito pelo descritor de informação, à medida que as lagartas continuam a se alimentar das folhas, o grau de reorganização metabólica aumenta ao longo do tempo: 72 horas após a alimentação do herbívoro, o RDPI aumenta significativamente. Comparado ao controle não danificado, o Hj foi significativamente reduzido, o que se deve ao aumento do grau de especialização do perfil metabólico, quantificado pelo índice δj. Essa tendência aparente é consistente com as previsões da teoria OD, mas é inconsistente com as principais previsões da teoria MT, que considera que mudanças aleatórias (não direcionais) nos níveis de metabólitos são usadas como camuflagem defensiva (Figura 1B). Embora o conteúdo do elicitor da secreção oral (SO) e o comportamento alimentar desses dois herbívoros sejam diferentes, a alimentação direta resultou em mudanças semelhantes nas direções de Hj e δj durante os períodos de colheita de 24 e 72 horas. A única diferença ocorreu às 72 horas do RDPI. Comparado ao causado pela alimentação Ms, o metabolismo geral induzido pela alimentação Sl foi maior.
(A) Desenho experimental: porcos comuns (S1) ou herbívoros experientes (Ms) são alimentados com folhas dessalinizadas de plantas carnívoras do gênero Carnívora, enquanto para a herbivoria simulada, o sistema de suporte (OS) de Ms (W + OSMs) é usado para simular a perfuração de feridas em posições padronizadas das folhas. Larvas de S1 (W + OSSl) ou água (W + W). O controle (C) é uma folha intacta. (B) Índices de indutibilidade (RDPI comparado com o gráfico de controle), diversidade (índice Hj) e especialização (índice δj) calculados para o mapa de metabólitos específicos (599 MS/MS; arquivo de dados S1). Os asteriscos indicam diferenças significativas entre a alimentação direta do herbívoro e o grupo controle (teste t de Student com teste t pareado, *P<0,05 e ***P<0,001). ns, não significativo. (C) Índice de resolução temporal do espectro de metabólitos principais (caixa azul: aminoácidos, ácidos orgânicos e açúcares; arquivo de dados S2) e de metabólitos especiais (caixa vermelha: MS/MS 443; arquivo de dados S1) após tratamento de herbivoria simulada. A faixa colorida refere-se ao intervalo de confiança de 95%. O asterisco indica a diferença significativa entre o tratamento e o controle [análise de variância quadrática (ANOVA), seguida pelo teste de Tukey para comparações múltiplas post hoc, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001]. (D) Especialização dos diagramas de dispersão e perfis de metabólitos especiais (amostras repetidas com diferentes tratamentos).
Para investigar se a remodelação induzida por herbívoros no nível do metaboloma se reflete nas alterações nos níveis de metabólitos individuais, concentramo-nos inicialmente nos metabólitos previamente estudados nas folhas de Nepenthes pallens, espécie com comprovada resistência a herbívoros. As amidas fenólicas são conjugados de hidroxicinamida-poliamina que se acumulam durante o processo de herbivoria por insetos e são conhecidas por reduzir o desempenho dos insetos (32). Investigamos os precursores correspondentes por MS/MS e plotamos suas curvas cinéticas cumulativas (Figura S1). Como esperado, derivados fenólicos que não estão diretamente envolvidos na defesa contra herbívoros, como o ácido clorogênico (CGA) e a rutina, apresentam níveis reduzidos após a herbivoria. Em contrapartida, os herbívoros podem tornar as amidas fenólicas altamente potentes. A alimentação contínua dos dois herbívoros resultou em espectros de excitação de fenolamidas quase idênticos, e esse padrão foi especialmente evidente para a síntese de novo de fenolamidas. O mesmo fenômeno será observado ao explorar a via dos glicosídeos diterpênicos 17-hidroxigeranil nonanediol (17-HGL-DTGs), que produz um grande número de diterpenos acíclicos com funções anti-herbivoria eficazes (33), dos quais a alimentação de Ms com Sl desencadeou um perfil de expressão semelhante (Figura S1)).
A possível desvantagem dos experimentos de alimentação direta de herbívoros é a diferença na taxa de consumo de folhas e no tempo de alimentação dos herbívoros, o que dificulta a eliminação dos efeitos específicos de cada herbívoro causados ​​por ferimentos e pelos próprios herbívoros. Para melhor solucionar a especificidade da resposta metabólica induzida nas folhas em relação à espécie de herbívoro, simulamos a alimentação de larvas de Ms e Sl aplicando imediatamente o OS recém-coletado (OSM e OSS1) à perfuração padrão W em posições foliares consistentes. Esse procedimento é chamado de tratamento W + OS e padroniza a indução, controlando precisamente o início da resposta desencadeada pelo herbívoro, sem causar efeitos de confusão decorrentes de diferenças na taxa ou quantidade de perda de tecido (Figura 2A) (34). Utilizando o pipeline de análise e cálculo MS/MS, recuperamos 443 espectros MS/MS (arquivo de dados S1), que se sobrepuseram aos espectros previamente reunidos a partir de experimentos de alimentação direta. A análise da teoria da informação deste conjunto de dados MS/MS mostrou que a reprogramação de metabolomas especializados em folhas, por meio da simulação de herbívoros, apresentou induções específicas para OS (Figura 2C). Em particular, em comparação com o tratamento OSS1, o OSM causou um aumento na especialização do metaboloma em 4 horas. Vale ressaltar que, em comparação com o conjunto de dados experimentais de alimentação direta por herbívoros, a cinética metabólica visualizada em um espaço bidimensional, utilizando Hj e δj como coordenadas, e a direcionalidade da especialização do metaboloma em resposta ao tratamento com herbívoros simulados ao longo do tempo aumentaram de forma consistente (Figura 2D). Simultaneamente, quantificamos o conteúdo de aminoácidos, ácidos orgânicos e açúcares (arquivo de dados S2) para investigar se esse aumento direcionado na especialização do metaboloma se deve à reconfiguração do metabolismo central do carbono em resposta aos herbívoros simulados (Figura S2). Para melhor explicar esse padrão, monitoramos ainda a cinética de acúmulo metabólico das vias de fenolamida e 17-HGL-DTG discutidas anteriormente. A indução específica de herbívoros mediada por OS se transforma em um padrão de rearranjo diferencial no metabolismo da fenolamida (Figura S3). Amidas fenólicas contendo grupos cumarina e cafeoíla são induzidas preferencialmente por OSS1, enquanto OSMs desencadeiam uma indução específica de conjugados de ferulila. Para a via 17-HGL-DTG, foi detectada indução diferencial de OS por produtos de malonilação e dimalonilação subsequentes (Figura S3).
Em seguida, estudamos a plasticidade do transcriptoma induzida por OS usando o conjunto de dados de microarrays de séries temporais, que simula o uso de OSMs para tratar as folhas da planta em roseta em herbívoros. A cinética de amostragem basicamente se sobrepõe à cinética usada neste estudo metabolômico (35). Comparado com a reconfiguração do metaboloma, na qual a plasticidade metabólica aumenta particularmente ao longo do tempo, observamos rajadas transitórias de transcrição em folhas induzidas por Ms, onde a indutibilidade do transcriptoma (RDPI) e a especialização (δj) estão em 1 hora, e a diversidade (Hj) nesse ponto temporal, a expressão de BMP1 foi significativamente reduzida, seguida pelo relaxamento da especialização do transcriptoma (Figura S4). Famílias de genes metabólicos (como P450, glicosiltransferase e aciltransferase BAHD) participam do processo de montagem de metabólitos especiais a partir de unidades estruturais derivadas do metabolismo primário, seguindo o modelo de alta especialização inicial mencionado anteriormente. Como estudo de caso, analisou-se a via da fenilalanina. A análise confirmou que os genes centrais do metabolismo da fenolamida são altamente induzidos por estresse oxidativo em herbívoros, em comparação com plantas não atraídas, e apresentam padrões de expressão bastante semelhantes. O fator de transcrição MYB8 e os genes estruturais PAL1, PAL2, C4H e 4CL, localizados a montante dessa via, demonstraram início precoce da transcrição. Aciltransferases que desempenham um papel na montagem final da fenolamida, como AT1, DH29 e CV86, exibem um padrão de regulação positiva prolongado (Figura S4). As observações acima indicam que o início precoce da especialização do transcriptoma e o posterior aprimoramento da especialização da metabolômica são um processo acoplado, possivelmente devido a um sistema regulatório síncrono que inicia uma resposta de defesa robusta.
A reconfiguração na sinalização dos hormônios vegetais atua como uma camada regulatória que integra informações sobre herbívoros para reprogramar a fisiologia das plantas. Após a simulação de herbivoria, medimos a dinâmica cumulativa de categorias-chave de hormônios vegetais e visualizamos a coexpressão temporal entre eles [coeficiente de correlação de Pearson (PCC) > 0,4] (Figura 3A). Como esperado, os hormônios vegetais relacionados à biossíntese estão interligados na rede de coexpressão hormonal. Além disso, a especificidade metabólica (índice Si) foi mapeada nessa rede para destacar os hormônios vegetais induzidos por diferentes tratamentos. Duas áreas principais de resposta específica a herbívoros foram identificadas: uma no cluster do ácido jasmônico (JA), onde o JA (sua forma biologicamente ativa, JA-Ile) e outros derivados do JA apresentam o maior índice Si; a outra é o etileno (ET). A giberelina apresentou apenas um aumento moderado na especificidade para herbívoros, enquanto outros hormônios vegetais, como citocinina, auxina e ácido abscísico, apresentaram baixa especificidade de indução para herbívoros. Em comparação com o uso isolado de W + W, a amplificação do valor de pico dos derivados de JA por meio da aplicação de OS (W + OS) pode ser transformada em um forte indicador específico de JAs. Inesperadamente, OSM e OSS1, com diferentes conteúdos de elicitores, demonstraram causar acúmulo semelhante de JA e JA-Ile. Ao contrário de OSS1, OSM é induzido de forma específica e intensa por OSMs, enquanto OSS1 não amplifica a resposta de feridas basais (Figura 3B).
(A) Análise de rede de coexpressão baseada no cálculo de PCC da simulação da cinética de acúmulo de hormônios vegetais induzido por herbívoros. O nó representa um único hormônio vegetal e o tamanho do nó representa o índice Si específico para o hormônio vegetal entre os tratamentos. (B) Acúmulo de JA, JA-Ile e ET em folhas causado por diferentes tratamentos, indicado por cores diferentes: damasco, W + OSM; azul, W + OSSl; preto, W + W; cinza, C (controle). Os asteriscos indicam diferenças significativas entre o tratamento e o controle (ANOVA de duas vias seguida pelo teste post hoc de comparação múltipla de Tukey HSD, *** P < 0,001). Análise da teoria da informação de (C)697 MS/MS (arquivo de dados S1) na biossíntese de JA e espectro de percepção prejudicado (irAOC e irCOI1) e (D)585 MS/MS (arquivo de dados S1) em ETR1 com sinal de ET prejudicado. Dois tratamentos simulados de herbívoros desencadearam linhagens de plantas e plantas controle com veículo vazio (EV). Os asteriscos indicam diferenças significativas entre o tratamento W+OS e o controle não danificado (ANOVA de duas vias seguida pelo teste post hoc de comparações múltiplas de Tukey HSD, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). (E) Gráficos de dispersão da oposição à especialização. As cores representam diferentes linhagens geneticamente modificadas; os símbolos representam diferentes métodos de tratamento: triângulo, W + OSS1; retângulo, W + OSM; círculo C
Em seguida, utilizamos uma linhagem geneticamente modificada de Nepenthes atenuada (irCOI1 e sETR1) nas etapas-chave da biossíntese (irAOC e irACO) e percepção (irCOI1 e sETR1) de JA e ET para analisar o metabolismo desses dois hormônios vegetais em herbívoros. A contribuição relativa da reprogramação. De acordo com experimentos anteriores, confirmamos a indução de OSS em herbívoros em plantas com enxerto vazio (EV) (Figura 3, C a D) e a diminuição geral do índice Hj causada por OSS, enquanto o índice δj aumentou. A resposta é mais pronunciada do que a resposta desencadeada por OSS1. Um gráfico de duas linhas usando Hj e δj como coordenadas mostra a desregulação específica (Figura 3E). A tendência mais evidente é que, em linhagens sem sinal de JA, as alterações na diversidade e especialização do metaboloma causadas por herbívoros são quase completamente eliminadas (Figura 3C). Em contraste, a percepção silenciosa de ET em plantas sETR1, embora o efeito geral nas alterações do metabolismo de herbívoros seja muito menor do que o da sinalização de JA, atenua a diferença nos índices Hj e δj entre as excitações de OSM e OSS1 (Figura 3D e Figura S5). Isso indica que, além da função principal da transdução de sinal de JA, a transdução de sinal de ET também serve como um ajuste fino da resposta metabólica específica da espécie dos herbívoros. Consistente com essa função de ajuste fino, não houve alteração na indutibilidade geral do metaboloma em plantas sETR1. Por outro lado, em comparação com plantas sETR1, plantas irACO induziram amplitudes gerais semelhantes de alterações metabólicas causadas por herbívoros, mas apresentaram pontuações Hj e δj significativamente diferentes entre os desafios de OSM e OSS1 (Figura S5).
Para identificar metabólitos especializados que contribuem significativamente para a resposta específica de cada espécie de herbívoro e ajustar sua produção por meio de sinais de ET, utilizamos o método de MS/MS estrutural previamente desenvolvido. Este método se baseia na técnica de bi-clustering para reinferir a família metabólica a partir de fragmentos de MS/MS [produto escalar normalizado (NDP)] e na pontuação de similaridade baseada na perda neutra (NL). O conjunto de dados de MS/MS construído por meio da análise de linhagens transgênicas de ET gerou 585 espectros de MS/MS (arquivo de dados S1), que foram agrupados em sete módulos principais de MS/MS (M) (Figura 4A). Alguns desses módulos são densamente agrupados com metabólitos especiais previamente caracterizados: por exemplo, M1, M2, M3, M4 e M7 são ricos em diversos derivados fenólicos (M1), glicosídeos flavonoides (M2), acil-açúcares (M3 e M4) e 17-HGL-DTG (M7). Além disso, a informação metabólica específica (índice Si) de um único metabólito em cada módulo é calculada, e sua distribuição de Si pode ser visualizada intuitivamente. Em resumo, os espectros MS/MS que exibem alta especificidade para herbivoria e genótipo são caracterizados por altos valores de Si, e as estatísticas de curtose indicam a distribuição da pelagem no canto direito da cauda. Uma dessas distribuições de coloides magros foi detectada em M1, na qual a amida de fenol apresentou a maior fração de Si (Figura 4B). O 17-HGL-DTG induzível por herbivoria mencionado anteriormente em M7 apresentou um índice de Si moderado, indicando um grau moderado de regulação diferencial entre os dois tipos de OS. Em contraste, a maioria dos metabólitos especializados produzidos constitutivamente, como rutina, CGA e acil açúcares, estão entre os menores índices de Si. Para melhor explorar a complexidade estrutural e a distribuição de Si entre os metabólitos especiais, uma rede molecular foi construída para cada módulo (Figura 4B). Uma previsão importante da teoria OD (resumida na Figura 1B) é que a reorganização de metabólitos específicos após a herbivoria deve levar a alterações unidirecionais em metabólitos com alto valor defensivo, especialmente pelo aumento de sua especificidade (em oposição à distribuição aleatória). A maioria dos derivados fenólicos acumulados em M1 está funcionalmente relacionada à redução do desempenho dos insetos (32). Ao comparar os valores de Si nos metabólitos de M1 entre as folhas induzidas e as folhas constituintes das plantas controle EV após 24 horas, observamos que a especificidade metabólica de muitos metabólitos após a herbivoria por insetos apresenta uma tendência de aumento significativa (Figura 4C). O aumento específico no valor de Si foi detectado apenas em fenolamidas defensivas, mas nenhum aumento no valor de Si foi detectado em outros fenóis e metabólitos desconhecidos coexistentes neste módulo. Este é um modelo especializado, relacionado à teoria OD. As principais previsões de alterações metabólicas causadas por herbívoros são consistentes. Para testar se essa particularidade do espectro de fenolamidas foi induzida pela ET específica de OS, plotamos o índice Si do metabólito e causamos um valor de expressão diferencial entre OSM e OSS1 nos genótipos EV e sETR1 (Figura 4D). Em sETR1, a diferença induzida por fenamida entre OSM e OSS1 foi bastante reduzida. O método de bi-clustering também foi aplicado aos dados de MS/MS coletados em cepas com JA insuficiente para inferir os principais módulos de MS/MS relacionados à especialização metabólica regulada por JA (Figura S6).
(A) Os resultados do agrupamento de 585 espectros de massas em tandem (MS/MS) com base em fragmentos compartilhados (similaridade NDP) e perda neutra compartilhada (similaridade NL) resultam em um módulo (M) consistente com a família de compostos conhecida ou com a composição de metabólitos desconhecidos ou pouco metabolizados. Ao lado de cada módulo, é mostrada a distribuição específica (Si) do metabólito (MS/MS). (B) Rede molecular modular: os nós representam os espectros de massas em tandem (MS/MS) e as arestas, as pontuações NDP (vermelho) e NL (azul) dos espectros de massas em tandem (ponto de corte > 0,6). O índice de especificidade do metabólito (Si) graduado é colorido com base no módulo (à esquerda) e mapeado na rede molecular (à direita). (C) Módulo M1 da planta EV em estado constitutivo (controle) e induzido (herbívoro simulado) em 24 horas: diagrama da rede molecular (o valor de Si representa o tamanho do nó; a fenolamida defensiva está destacada em azul). (D) Diagrama da rede molecular M1 da linha espectral sETR1 com percepção prejudicada de EV e ET: o composto fenólico representado pelo nó do círculo verde e a diferença significativa (valor de P) entre os tratamentos W + OSM e W + OSS1 como tamanho do nó. CP, N-cafeoil-tirosina; CS, N-cafeoil-espermidina; FP, éster de ácido N-ferúlico-ácido úrico; FS, N-ferulil-espermidina; CoP, N', N''-cumarolil-tirosina; DCS, N', N''-dicafeoil-espermidina; CFS, N', N''-cafeoil, feruloil-espermidina; Lycium barbarum em wolfberry Son; Nick. O-AS, O-acil açúcar.
Estendemos ainda mais a análise de um único genótipo atenuado de Nepenthes para populações naturais, onde fortes alterações intraespecíficas nos níveis de JA de herbívoros e nos níveis de metabólitos específicos foram previamente descritas em populações naturais (26). Utilizamos este conjunto de dados para abranger 43 germoplasmas. Esses germoplasmas consistem em 123 espécies de plantas de N. pallens. Essas plantas foram obtidas a partir de sementes coletadas em diferentes habitats nativos em Utah, Nevada, Arizona e Califórnia (Figura S7). Calculamos a diversidade do metaboloma (aqui denominada diversidade β em nível populacional) e a especialização causada pela OSM. De acordo com estudos anteriores, observamos uma ampla gama de alterações metabólicas ao longo dos eixos Hj e δj, indicando que os germoplasmas apresentam diferenças significativas na plasticidade de suas respostas metabólicas a herbívoros (Figura S7). Essa organização remete a observações anteriores sobre a amplitude dinâmica das alterações de JA causadas por herbívoros e manteve um valor muito alto em uma única população (26, 36). Ao usar JA e JA-Ile para testar a correlação geral entre Hj e δj, descobrimos que existe uma correlação positiva significativa entre JA e o índice de diversidade e especialização β do metaboloma (Figura S7). Isso sugere que a heterogeneidade na indução de JAs induzida por herbívoros, detectada em nível populacional, pode ser devida a polimorfismos metabólicos chave causados ​​pela seleção de insetos herbívoros.
Estudos anteriores demonstraram que os tipos de tabaco diferem muito em tipo e dependência relativa de defesas metabólicas induzidas e constitutivas. Acredita-se que essas alterações na transdução de sinal anti-herbivoria e nas capacidades de defesa sejam reguladas pela pressão populacional de insetos, pelo ciclo de vida da planta e pelos custos de produção de defesa no nicho em que uma determinada espécie cresce. Estudamos a consistência da remodelação do metaboloma foliar induzida por herbívoros em seis espécies de Nicotiana nativas da América do Norte e do Sul. Essas espécies são intimamente relacionadas a Nepenthes da América do Norte, nomeadamente Nicotiana bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. capim-atenuado, Nicotiana tabacum, tabaco-linear, tabaco (Nicotiana spegazzinii) e tabaco-folha (Nicotiana obtusifolia) (Figura 5A) (37). Seis dessas espécies, incluindo a espécie bem caracterizada N. please, são plantas anuais do clado petúnia, e N. obtusifolia é perene do clado irmão Trigonophyllae (38). Posteriormente, a indução de W + W, W + OSM e W + OSS1 foi realizada nessas sete espécies para estudar o rearranjo metabólico em nível de espécie na alimentação dos insetos.
(A) Árvore filogenética bootstrap baseada na máxima verossimilhança [para a síntese nuclear de glutamina (38)] e na distribuição geográfica de sete espécies de Nicotiana intimamente relacionadas (cores diferentes) (37). (B) Gráfico de dispersão da diversidade especializada para os perfis metabólicos de sete espécies de Nicotiana (939 MS/MS; arquivo de dados S1). No nível de espécie, a diversidade do metaboloma está negativamente correlacionada com o grau de especialização. A análise da correlação no nível de espécie entre a diversidade metabólica e a especialização e o acúmulo de JA é mostrada na Figura 2. S9. Cor, tipos diferentes; triângulo, W + OSS1; retângulo, W + OSM; (C) A dinâmica de JA e JA-Ile em Nicotiana é classificada de acordo com a amplitude de excitação do OS (ANOVA de duas vias e teste de comparações múltiplas de Tukey HSD, * P < 0,05, ** P < 0,01 e ** Para comparação de W + OS e W + W, P < 0,001). Diagrama de caixa da (D) diversidade e (E) especialização de cada espécie após simulação de herbivoria e metil JA (MeJA). O asterisco indica a diferença significativa entre W + OS e W + W ou lanolina mais W (Lan + W) ou Lan mais MeJA (Lan + MeJA) e o controle Lan (análise de variância de dois fatores, seguida pelo teste post hoc de comparações múltiplas de Tukey HSD, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001).
Utilizando o método de agrupamento duplo, identificamos 9 módulos de 939 espectros de massa em tandem (MS/MS) (arquivo de dados S1). A composição dos espectros MS/MS reconfigurados por diferentes tratamentos varia consideravelmente entre os diferentes módulos e entre as espécies (Figura S8). A visualização de Hj (aqui denominada diversidade gama em nível de espécie) e δj revela que diferentes espécies se agregam em grupos muito distintos no espaço metabólico, onde a divisão em nível de espécie é geralmente mais proeminente do que a excitação. Com exceção de N. linear e N. obliquus, elas exibem uma ampla gama dinâmica de efeitos de indução (Figura 5B). Em contraste, espécies como N. purpurea e N. obtusifolia apresentam uma resposta metabólica menos evidente ao tratamento, mas o metaboloma é mais diverso. A distribuição espécie-específica da resposta metabólica induzida resultou em uma correlação negativa significativa entre especialização e diversidade gama (PCC = -0,46, P = 4,9×10⁻⁸). As alterações nos níveis de JA induzidas por estresse oxidativo (EO) correlacionam-se positivamente com a especialização do metaboloma e negativamente com a diversidade gama metabólica exibida por cada espécie (Figura 5B e Figura S9). Vale ressaltar que as espécies coloquialmente denominadas espécies de “resposta ao sinal” na Figura 5C, como Nepenthes nematoides, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute e Nepenthes attenuated, apresentaram sinais significativos em 30 minutos. Os surtos recentes de JA e JA-Ile específicos para EO, enquanto outras bactérias denominadas “não responsivas ao sinal”, como Nepenthes mills, Nepenthes powdery e N. obtusifolia, mostram apenas indução de JA-Ile Edge sem qualquer especificidade para EO (Figura 5C). No nível metabólico, como mencionado anteriormente, para Nepenthes attenuated, as substâncias responsivas ao sinal apresentaram especificidade para EO e aumentaram significativamente δj, enquanto reduziram Hj. Esse efeito de ativação específico para OS não foi detectado em espécies classificadas como não reativas ao sinal (Figura 5, D e E). Os metabólitos específicos para OS são compartilhados com mais frequência entre espécies responsivas ao sinal, e esses agrupamentos de sinais se agrupam com espécies com respostas mais fracas ao sinal, enquanto espécies com respostas mais fracas ao sinal mostram menor interdependência (Figura S8). Esse resultado indica que a indução de JAs específica para OS e a reconfiguração do metaboloma subsequente também específica para OS estão acopladas no nível das espécies.
Em seguida, utilizamos uma pasta de lanolina contendo metil JA (MeJA) para tratar as plantas e investigar se esses modos de acoplamento são restringidos pela disponibilidade de JA aplicado exógeno, que estará presente no citoplasma das plantas. A rápida desesterificação do JA é observada. Encontramos a mesma tendência de mudança gradual de espécies responsivas ao sinal para espécies não responsivas ao sinal, causada pelo fornecimento contínuo de JA (Figura 5, D e E). Em resumo, o tratamento com MeJA reprogramou fortemente os metabolomas dos nematoides lineares N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens e N. mikimotoi, resultando em um aumento significativo em δj e uma diminuição em Hj. N. purpurea apresentou apenas um aumento em δj, mas não em Hj. N. obtusifolia, que anteriormente demonstrou acumular níveis extremamente baixos de JAs, também respondeu mal ao tratamento com MeJA em termos de reconfiguração do metaboloma. Esses resultados indicam que a produção de JA ou a transdução de sinal é fisiologicamente restrita em espécies não responsivas a sinais. Para testar essa hipótese, estudamos o transcriptoma de quatro espécies (N. pallens, N. mills, N. pink e N. microphylla) induzidas por W + W, W + OSMs e W + OSS1 (39). De acordo com o padrão de remodelação do metaboloma, as espécies estão bem separadas no espaço do transcriptoma, entre as quais N. attenuated apresentou o maior RDPI induzido por OS, enquanto N. gracilis apresentou o menor (Figura 6A). No entanto, verificou-se que a diversidade do transcriptoma induzida por N. oblonga foi a menor entre as quatro espécies, contrariamente à maior diversidade metabonômica de N. oblonga previamente demonstrada em sete espécies. Estudos anteriores mostraram que um conjunto de genes relacionados a sinais de defesa iniciais, incluindo sinais de JA, explica a especificidade das respostas de defesa iniciais induzidas por elicitores relacionados a herbívoros em espécies de Nicotiana (39). A comparação das vias de sinalização do JA entre essas quatro espécies revelou um padrão interessante (Figura 6B). A maioria dos genes nessa via, como AOC, OPR3, ACX e COI1, apresentou níveis relativamente altos de indução nessas quatro espécies. No entanto, um gene chave, JAR4, converte o JA em sua forma biologicamente ativa, o JA-Ile, cujos transcritos se acumulam, e seu nível de transcrição é muito baixo, especialmente em N. mills, Nepenthes pieris e N. microphylla. Além disso, apenas o transcrito de outro gene, AOS, não foi detectado em N. bifidum. Essas alterações na expressão gênica podem ser responsáveis ​​pelos fenótipos extremos induzidos pela baixa produção de JA em espécies anérgicas à sinalização e pela indução em N. gracilis.
(A) Análise da teoria da informação sobre a reprogramação das respostas transcricionais iniciais de quatro espécies de tabaco intimamente relacionadas, amostradas 30 minutos após a indução da herbivoria. O RDPI foi calculado comparando as folhas induzidas pelo herbívoro OS com o controle de ferimento. As cores indicam diferentes espécies e os símbolos indicam diferentes métodos de tratamento. (B) Análise da expressão gênica nas vias de sinalização do JA entre as quatro espécies. O caminho simplificado do JA é mostrado ao lado do gráfico de caixa. Cores diferentes indicam diferentes métodos de processamento. O asterisco indica que há uma diferença significativa entre o tratamento W + OS e o controle W + W (para o teste t de Student para diferenças pareadas, *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0,001). OPDA, ácido 12-oxofitodienoico; OPC-8: ácido 0,3-oxo-2(2′(Z)-pentenil)-ciclopentano-1-octanoico.
Na última parte, estudamos como a remodelação do metaboloma de diferentes espécies de plantas, específica para cada espécie de inseto, pode conferir resistência a herbívoros. Pesquisas anteriores enfatizaram o gênero Nicotiana. Sua resistência a Ms e larvas difere bastante (40). Aqui, estudamos a conexão entre esse modelo e sua plasticidade metabólica. Usando as quatro espécies de tabaco mencionadas acima e testando a correlação entre a diversidade e a especialização do metaboloma causadas por herbívoros e a resistência das plantas a Ms e Sl, descobrimos que a resistência, a diversidade e a especialização ao generalista Sl estão todas positivamente correlacionadas, enquanto a correlação entre a resistência a fêmeas especialistas e a especialização é fraca, e a correlação com a diversidade não é significativa (Figura S10). Com relação à resistência a S1, tanto a N. chinensis atenuada quanto a N. gracilis, que demonstraram anteriormente exibir níveis de transdução de sinal de JA e plasticidade do metaboloma, apresentaram respostas muito diferentes à indução por herbívoros, e também mostraram alta resistência semelhante. Sexo.
Nos últimos sessenta anos, a teoria da defesa vegetal forneceu uma estrutura teórica com base na qual os pesquisadores previram um número considerável de evoluções e funções de metabólitos especializados de plantas. A maioria dessas teorias não segue o procedimento normal de inferências fortes (41). Elas propõem previsões-chave (3) no mesmo nível de análise. Quando o teste de previsões-chave permite que teorias específicas sejam analisadas, isso fará com que o campo avance. Em vez disso, a nova teoria faz previsões em diferentes níveis de análise e adiciona uma nova camada de considerações descritivas (42). No entanto, as duas teorias propostas no nível funcional, MT e OD, podem ser facilmente explicadas como previsões importantes de mudanças metabólicas especializadas causadas por herbívoros: a teoria OD acredita que as mudanças no “espaço” metabólico especializado são altamente direcionais. A teoria MT acredita que essas mudanças serão não direcionais e localizadas aleatoriamente no espaço metabólico, e tendem a ter metabólitos de alto valor defensivo. Exames anteriores das previsões de OD e MT foram testados usando um conjunto restrito de compostos de “defesa” a priori. Esses testes centrados em metabólitos impedem a análise da extensão e trajetória da reconfiguração do metaboloma durante a herbivoria e não permitem testes dentro de uma estrutura estatística consistente, o que exige previsões-chave que possam ser consideradas como um todo. Quantificamos as mudanças no metaboloma vegetal. Aqui, utilizamos a tecnologia inovadora em metabolômica baseada em espectrometria de massas computacional e realizamos análises de deconvolução de espectrometria de massas na linguagem geral dos descritores da teoria da informação para testar a distinção entre as duas propostas no nível da metabolômica global. A principal previsão dessa teoria é a teoria da informação. A teoria da informação tem sido aplicada em muitos campos, especialmente no contexto da pesquisa sobre biodiversidade e fluxo de nutrientes (43). No entanto, até onde sabemos, esta é a primeira aplicação utilizada para descrever o espaço de informação metabólica das plantas e resolver problemas ecológicos relacionados a mudanças metabólicas temporárias em resposta a estímulos ambientais. Em particular, a capacidade desse método reside em sua habilidade de comparar padrões dentro e entre espécies de plantas para examinar como os herbívoros evoluíram de diferentes espécies para padrões macroevolutivos interespecíficos em diferentes níveis de evolução. Metabolismo.
A análise de componentes principais (PCA) converte um conjunto de dados multivariados em um espaço de dimensionalidade reduzida, permitindo explicar a tendência principal dos dados. Por isso, é geralmente utilizada como uma técnica exploratória para analisar conjuntos de dados, como a deconvolução do metaboloma. No entanto, a redução de dimensionalidade resulta na perda de parte do conteúdo informativo do conjunto de dados, e a PCA não fornece informações quantitativas sobre características particularmente relevantes para a teoria ecológica, como: como os herbívoros reconfiguram a diversidade em campos especializados (por exemplo, riqueza, distribuição e abundância de metabólitos)? Quais metabólitos são preditores do estado induzido de um determinado herbívoro? Sob a perspectiva da especificidade, diversidade e indutibilidade, o conteúdo informativo do perfil metabólico específico da folha é decomposto, e constata-se que a alimentação dos herbívoros pode ativar metabolismos específicos. Inesperadamente, observamos que, conforme descrito nos indicadores da teoria da informação implementados, a situação metabólica resultante apresenta grande sobreposição após os ataques dos dois herbívoros (o generalista noturno Sl) e a especialista em Solanáceas Ms. Embora seus comportamentos alimentares e concentrações sejam significativamente diferentes. Iniciador de conjugado de ácido graxo-aminoácido (FAC) em OS (31). Ao utilizar OS de herbívoros para tratar feridas perfurantes padronizadas, o tratamento simulado por herbívoros também apresentou tendência semelhante. Este procedimento padronizado para simular a resposta das plantas a ataques de herbívoros elimina os fatores de confusão causados ​​por mudanças no comportamento alimentar dos herbívoros, que levam a diferentes graus de dano em momentos distintos (34). O FAC, conhecido por ser a principal causa de OSM, reduz o JAS e outras respostas de hormônios vegetais em OSS1, enquanto OSS1 reduz centenas de vezes (31). No entanto, OSS1 causou níveis semelhantes de acúmulo de JA em comparação com OSM. Já foi demonstrado que a resposta ao JA em Nepenthes atenuada é muito sensível ao OSM, onde o FAC pode manter sua atividade mesmo diluído 1:1000 em água (44). Portanto, em comparação com o OSM, embora o FAC em OSS1 seja muito baixo, é suficiente para induzir uma liberação significativa de JA. Estudos anteriores mostraram que proteínas semelhantes a porinas (45) e oligossacarídeos (46) podem ser usados ​​como pistas moleculares para desencadear respostas de defesa da planta em OSS1. No entanto, ainda não está claro se esses elicitores em OSS1 são responsáveis ​​pelo acúmulo de JA observado no presente estudo.
Embora existam poucos estudos que descrevam as diferentes assinaturas metabólicas causadas pela aplicação de diferentes herbívoros ou de JA ou SA (ácido salicílico) exógenos (47), ninguém investigou a perturbação específica da espécie de herbívoro na rede de gramíneas e seus efeitos sobre as informações pessoais específicas. O impacto geral do metabolismo é estudado sistematicamente. Esta análise confirmou ainda que a conexão da rede hormonal interna com outros hormônios vegetais, além dos JAs, molda a especificidade da reorganização metabólica causada pelos herbívoros. Em particular, detectamos que a ET causada por OSM foi significativamente maior do que a causada por OSS1. Esse padrão é consistente com um maior conteúdo de FAC em OSM, o que é uma condição necessária e suficiente para desencadear um aumento na ET (48). No contexto da interação entre plantas e herbívoros, a função de sinalização da ET na dinâmica de metabólitos específicos de plantas ainda é esporádica e se concentra em apenas um único grupo de compostos. Além disso, a maioria dos estudos utilizou a aplicação exógena de ET ou seus precursores, ou ainda diversos inibidores, para estudar a regulação do ET. Essas aplicações químicas exógenas podem produzir muitos efeitos colaterais não específicos. Até onde sabemos, este estudo representa o primeiro exame sistemático em larga escala do papel do ET na produção e percepção de plantas transgênicas com deficiências, visando coordenar a dinâmica do metaboloma vegetal. A indução de ET específica para herbívoros pode, em última análise, modular a resposta do metaboloma. O aspecto mais significativo é a manipulação transgênica dos genes de biossíntese (ACO) e percepção (ETR1) do ET, que revelou o acúmulo de novo de fenolamidas específico para herbívoros. Já foi demonstrado que o ET pode ajustar o acúmulo de nicotina induzido por JA, regulando a putrescina N-metiltransferase (49). No entanto, do ponto de vista mecânico, não está claro como o ET ajusta a indução de fenamida. Além da função de transdução de sinal do ET, o fluxo metabólico também pode ser desviado para a S-adenosil-1-metionina para regular o investimento em amidas de poliaminofenol. A S-adenosil-1-metionina é um intermediário comum do ET na via biossintética das poliaminas. O mecanismo pelo qual o sinal do ET regula o nível de fenolamida necessita de estudos adicionais.
Por muito tempo, devido ao grande número de metabólitos especiais de estrutura desconhecida, a intensa atenção a categorias metabólicas específicas não permitiu avaliar rigorosamente as mudanças temporais na diversidade metabólica após interações biológicas. Atualmente, com base na análise da teoria da informação, o principal resultado da aquisição de espectros MS/MS com base em metabólitos não enviesados ​​é que herbívoros que se alimentam ou simulam outros herbívoros continuam a reduzir a diversidade metabólica geral do metaboloma foliar, ao mesmo tempo que aumentam seu grau de especialização. Esse aumento temporário na especificidade do metaboloma causado por herbívoros está associado a um aumento sinérgico na especificidade do transcriptoma. A característica que mais contribui para essa maior especialização do metaboloma (com um valor Si mais alto) é o metabólito especial com função herbívora previamente caracterizada. Esse modelo é consistente com a previsão da teoria da diversidade orgânica (OD), mas a previsão da teoria da transferência de metabólitos (MT) relacionada à aleatoriedade da reprogramação do metaboloma não é consistente. No entanto, esses dados também são consistentes com a previsão do modelo misto (melhor MT; Figura 1B), porque outros metabólitos não caracterizados com funções de defesa desconhecidas ainda podem seguir uma distribuição aleatória de Si.
Um padrão notável, também capturado por esta pesquisa, é que, desde o nível microevolutivo (planta individual e população de tabaco) até uma escala evolutiva maior (espécies de tabaco intimamente relacionadas), diferentes níveis de organização evolutiva apresentam diferenças significativas nas habilidades dos herbívoros em relação à “melhor defesa”. Moore et al. (20) e Kessler e Kalske (1) propuseram, independentemente, converter os três níveis funcionais de biodiversidade originalmente distinguidos por Whittaker (50) em mudanças temporais constitutivas e induzidas da diversidade química; esses autores não resumiram os procedimentos para coleta de dados metabolômicos em larga escala, nem descrevem como calcular a diversidade metabólica a partir desses dados. Neste estudo, pequenos ajustes na classificação funcional de Whittaker considerarão a diversidade α-metabólica como a diversidade de espectros MS/MS em uma determinada planta, a diversidade β-metabólica como o metabolismo intraespecífico básico de um grupo de populações e a diversidade γ-metabólica como uma extensão da análise de espécies semelhantes.
O sinal do JA é essencial para uma ampla gama de respostas metabólicas em herbívoros. No entanto, há uma carência de testes quantitativos rigorosos sobre a contribuição da regulação intraespecífica da biossíntese de JA para a diversidade do metaboloma, e ainda não se sabe se o sinal do JA é um sítio geral para a diversificação metabólica induzida por estresse em uma escala macroevolutiva superior. Observamos que a natureza herbívora de Nepenthes herbivorus induz a especialização do metaboloma, e a variação dessa especialização dentro da população de espécies de Nicotiana e entre espécies de Nicotiana intimamente relacionadas está sistematicamente correlacionada de forma positiva com a sinalização do JA. Além disso, quando o sinal do JA é prejudicado, a especificidade metabólica induzida por um herbívoro de genótipo único é anulada (Figura 3, C e E). Como as alterações no espectro metabólico das populações de Nepenthes naturalmente atenuadas são principalmente quantitativas, as mudanças na diversidade β metabólica e na especificidade observadas nesta análise podem ser causadas, em grande parte, pela forte excitação de categorias de compostos ricos em metabólitos. Essas classes de compostos dominam parte do perfil do metaboloma e levam a uma correlação positiva com os sinais de JA.
Como os mecanismos bioquímicos das espécies de tabaco intimamente relacionadas são muito diferentes, os metabólitos são especificamente identificados no aspecto qualitativo, o que torna a análise mais precisa. O processamento do perfil metabólico obtido pela teoria da informação revela que a indução por herbívoros exacerba o equilíbrio entre a diversidade gama metabólica e a especialização. O sinal do ácido jasmônico (JA) desempenha um papel central nesse equilíbrio. O aumento na especialização do metaboloma é consistente com a principal previsão de densidade óptica (DO) e está positivamente correlacionado com o sinal do JA, enquanto o sinal do JA está negativamente correlacionado com a diversidade gama metabólica. Esses modelos indicam que a capacidade de DO das plantas é determinada principalmente pela plasticidade do JA, seja em uma escala microevolutiva ou em uma escala evolutiva maior. Experimentos de aplicação exógena de JA que contornam os defeitos na biossíntese do JA revelam ainda que espécies de tabaco intimamente relacionadas podem ser distinguidas em espécies responsivas e não responsivas ao sinal, assim como seu modo de plasticidade do JA e do metaboloma induzida por herbívoros. Espécies não responsivas a sinais não conseguem responder devido à sua incapacidade de produzir JA endógeno e, portanto, estão sujeitas a limitações fisiológicas. Isso pode ser causado por mutações em alguns genes-chave na via de sinalização do JA (AOS e JAR4 em N. crescens). Esse resultado destaca que esses padrões macroevolutivos interespecíficos podem ser impulsionados principalmente por mudanças na percepção e responsividade hormonal interna.
Além da interação entre plantas e herbívoros, a exploração da diversidade metabólica está relacionada a todos os importantes avanços teóricos na pesquisa da adaptação biológica ao ambiente e da evolução de características fenotípicas complexas. Com o aumento da quantidade de dados adquiridos por instrumentos de espectrometria de massas modernos, o teste de hipóteses sobre a diversidade metabólica agora pode transcender as diferenças individuais/categoriais de metabólitos e realizar análises globais para revelar padrões inesperados. No processo de análise em larga escala, uma metáfora importante é a ideia de conceber mapas significativos que possam ser usados ​​para explorar os dados. Portanto, um resultado importante da combinação atual da metabolômica MS/MS não enviesada e da teoria da informação é que ela fornece uma métrica simples que pode ser usada para construir mapas para navegar pela diversidade metabólica em diferentes escalas taxonômicas. Este é o requisito básico deste método para o estudo da micro/macroevolução e da ecologia de comunidades.
Em nível macroevolutivo, o cerne da teoria da coevolução planta-inseto de Ehrlich e Raven (51) é prever que a variação da diversidade metabólica interespecífica é a causa da diversificação das linhagens de plantas. No entanto, nos cinquenta anos desde a publicação deste trabalho seminal, essa hipótese raramente foi testada (52). Isso se deve, em grande parte, às características filogenéticas de características metabólicas comparáveis ​​em linhagens de plantas distantes. Essa raridade pode ser usada para ancorar métodos de análise direcionados. O fluxo de trabalho MS/MS atual, processado pela teoria da informação, quantifica a similaridade estrutural MS/MS de metabólitos desconhecidos (sem seleção prévia de metabólitos) e converte esses MS/MS em um conjunto de MS/MS, comparando-os, assim, em modelos macroevolutivos profissionais de metabolismo, em uma escala de classificação. Indicadores estatísticos simples. O processo é semelhante à análise filogenética, que pode usar o alinhamento de sequências para quantificar a taxa de diversificação ou evolução de caracteres sem previsão prévia.
Em nível bioquímico, a hipótese de triagem de Firn e Jones (53) mostra que a diversidade metabólica é mantida em diferentes níveis para fornecer matéria-prima para exercer as atividades biológicas de metabólitos anteriormente não relacionados ou substituídos. Os métodos da teoria da informação fornecem uma estrutura na qual essas transições evolutivas específicas de metabólitos que ocorrem durante a especialização metabólica podem ser quantificadas como parte do processo de triagem evolutiva proposto: adaptação biologicamente ativa de baixa especificidade para alta especificidade. Metabólitos inibidos de um determinado ambiente.
Em suma, nos primórdios da biologia molecular, importantes teorias de defesa vegetal foram desenvolvidas, e os métodos dedutivos baseados em hipóteses são amplamente considerados o único meio de progresso científico. Isso se deve, em grande parte, às limitações técnicas da mensuração do metaboloma completo. Embora os métodos baseados em hipóteses sejam particularmente úteis na escolha de outros mecanismos causais, sua capacidade de ampliar nossa compreensão das redes bioquímicas é mais limitada do que a dos métodos computacionais atualmente disponíveis na ciência de dados contemporânea. Portanto, teorias que não podem ser previstas estão muito além do alcance dos dados disponíveis, de modo que o ciclo de formulação/teste hipotético do progresso na área de pesquisa não pode ser abolido (4). Prevemos que o fluxo de trabalho computacional da metabolômica apresentado aqui poderá reacender o interesse nas questões recentes (como) e finais (porquê) da diversidade metabólica e contribuir para uma nova era da ciência de dados guiada por teorias. Essa era reexaminou as importantes teorias que inspiraram as gerações anteriores.
A alimentação direta do herbívoro foi realizada criando larvas de segundo instar (S1) em uma única folha de uma planta carnívora de coloração pálida, em uma única roseira em floração, com 10 repetições por planta. As larvas foram fixadas com grampos, e o tecido foliar remanescente foi coletado 24 e 72 horas após a infecção, congelado rapidamente e os metabólitos foram extraídos.
Simule o tratamento herbívoro de forma altamente sincronizada. O método consiste em usar rodas de tecido com padrão para perfurar três fileiras de espinhos em cada lado da nervura central das três folhas totalmente expandidas da planta durante o estágio de crescimento da guirlanda de tecido e aplicar imediatamente Ms diluído 1:5. Ou use dedos enluvados para inserir S1 OS na ferida da perfuração. Colha e processe uma folha conforme descrito acima. Use o método descrito anteriormente para extrair metabólitos primários e hormônios vegetais (54).
Para aplicações exógenas de JA, as três folhas do pecíolo de cada uma das seis roseiras floridas de cada espécie foram tratadas com 20 μl de pasta de lanolina contendo 150 μg de MeJA (Lan + MeJA), e com 20 μl de lanolina mais tratamento de ferimento (Lan + W), ou com 20 μl de lanolina pura como controle. As folhas foram colhidas 72 horas após o tratamento, congeladas instantaneamente em nitrogênio líquido e armazenadas a -80 °C até o uso.
Quatro linhagens transgênicas de JA e ET, nomeadamente irAOC (36), irCOI1 (55), irACO e sETR1 (48), foram identificadas em nosso grupo de pesquisa. A linhagem irAOC apresentou uma forte diminuição nos níveis de JA e JA-Ile, enquanto a irCOI1 não foi sensível aos JAs. Comparada com o grupo controle (EV), a acumulação de JA-Ile aumentou. De forma semelhante, a linhagem irACO reduz a produção de ET e, comparada com o grupo controle (EV), a linhagem sETR1, que é insensível ao ET, aumenta a produção de ET.
Um espectrômetro a laser fotoacústico (sensor de ET em tempo real Sensor Sense ETD-300) foi utilizado para realizar a medição de ET de forma não invasiva. Imediatamente após o tratamento, metade das folhas foi cortada e transferida para um frasco de vidro selado de 4 ml, e o espaço livre foi deixado acumular por 5 horas. Durante a medição, cada frasco foi purgado com um fluxo de 2 litros/hora de ar puro durante 8 minutos, ar esse que havia passado previamente por um catalisador fornecido pela Sensor Sense para remover CO2 e água.
Os dados do microarray foram originalmente publicados em (35) e salvos no Banco de Dados Abrangente de Expressão Gênica do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) (número de acesso GSE30287). Os dados correspondentes às folhas afetadas pelo tratamento W + OSMs e ao controle não danificado foram extraídos para este estudo. A intensidade bruta é log2. Antes da análise estatística, a linha de base foi convertida e normalizada para o seu 75º percentil usando o pacote de software R.
Os dados originais de sequenciamento de RNA (RNA-seq) de espécies de Nicotiana foram obtidos do NCBI Short Reading Archives (SRA), projeto número PRJNA301787, relatado por Zhou et al. (39) e processado conforme descrito em (56). Os dados brutos processados ​​por W + W, W + OSM e W + OSS1, correspondentes às espécies de Nicotiana, foram selecionados para análise neste estudo e processados ​​da seguinte maneira: Primeiro, as leituras brutas de RNA-seq foram convertidas para o formato FASTQ. O HISAT2 converte FASTQ para SAM, e o SAMtools converte os arquivos SAM em arquivos BAM ordenados. O StringTie foi usado para calcular a expressão gênica, e seu método de expressão considera o número de fragmentos por mil bases por milhão de fragmentos de transcrição sequenciados.
A coluna cromatográfica Acclaim (150 mm x 2,1 mm; tamanho de partícula 2,2 μm) utilizada na análise e a coluna de guarda de 4 mm x 4 mm são compostas do mesmo material. O seguinte gradiente binário é utilizado no sistema de Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência (UHPLC) Dionex UltiMate 3000: 0 a 0,5 minutos, fase isocrática com 90% A [água deionizada, 0,1% (v/v) de acetonitrila e 0,05% de ácido fórmico], 10% B (acetonitrila e 0,05% de ácido fórmico); 0,5 a 23,5 minutos, a fase de gradiente é composta por 10% A e 90% B, respectivamente; 23,5 a 25 minutos, fase isocrática com 10% A e 90% B. A vazão é de 400 μL/min. Para todas as análises de MS, injete o eluente da coluna em um analisador de quadrupolo e tempo de voo (qTOF) equipado com uma fonte de eletrospray operando no modo de ionização positiva (tensão capilar, 4500 V; saída capilar 130 V; temperatura de secagem 200 °C; fluxo de ar de secagem 10 litros/min).
Realize análises de fragmentos MS/MS (doravante denominadas MS/MS) irrelevantes ou indistinguíveis dos dados para obter informações estruturais sobre o perfil metabólico detectável geral. O conceito do método MS/MS indiscriminado baseia-se no fato de o quadrupolo possuir uma janela de isolamento de massa muito ampla [portanto, considere todos os sinais de relação massa/carga (m/z) como fragmentos]. Por esse motivo, como o instrumento Impact II não era capaz de gerar uma inclinação CE, diversas análises independentes foram realizadas utilizando valores aumentados de energia de colisão induzida por dissociação (CE). Resumidamente, analise primeiro a amostra por UHPLC-ionização por eletrospray/qTOF-MS utilizando o modo de espectrometria de massa única (condições de baixa fragmentação geradas por fragmentação na fonte), com varredura de m/z 50 a 1500 a uma frequência de repetição de 5 Hz. Utilize nitrogênio como gás de colisão para análise MS/MS e realize medições independentes nas seguintes quatro voltagens de dissociação induzida por colisão: 20, 30, 40 e 50 eV. Durante todo o processo de medição, o quadrupolo apresenta a maior janela de isolamento de massa, de m/z 50 a 1500. Quando o experimento de largura de isolamento e m/z do corpo frontal é configurado para 200, a faixa de massa é ativada automaticamente pelo software do instrumento e 0 Da. Varra os fragmentos de massa como no modo de massa única. Utilize formiato de sódio (50 ml de isopropanol, 200 μl de ácido fórmico e 1 ml de solução aquosa de NaOH 1M) para calibração de massa. Utilizando o algoritmo de calibração de alta precisão da Bruker, o arquivo de dados é calibrado após a execução do espectro médio em um determinado período de tempo. Utilize a função de exportação do software Data Analysis v4.0 (Brook Dalton, Bremen, Alemanha) para converter os arquivos de dados brutos para o formato NetCDF. O conjunto de dados MS/MS foi salvo no banco de dados aberto de metabolômica MetaboLights (www.ebi.ac.uk) com o número de acesso MTBLS1471.
A montagem MS/MS pode ser realizada por meio da análise de correlação entre os sinais de qualidade MS1 e MS/MS para energias de colisão baixas e altas, utilizando regras recentemente implementadas. O script em R é utilizado para realizar a análise de correlação da distribuição do precursor ao produto, e o script em C# (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) é utilizado para implementar as regras.
Para reduzir os erros de falso positivo causados ​​pelo ruído de fundo e a falsa correlação resultante da detecção de certas características m/z em apenas algumas amostras, utilizamos a função “filled peak” do pacote XCMS do R (para correção de ruído de fundo). Essa função deve ser usada para substituir a intensidade “NA” (pico não detectado). Mesmo com a função “filled peak”, ainda existem muitos valores de intensidade “0” no conjunto de dados que podem afetar o cálculo da correlação. Em seguida, comparamos os resultados do processamento de dados obtidos com e sem a função “filled peak”, calculamos o valor do ruído de fundo com base na média dos valores estimados corrigidos e substituímos esses valores de intensidade 0 pelo valor de fundo calculado. Além disso, consideramos apenas as características cuja intensidade excedeu três vezes o valor de fundo, classificando-as como “picos verdadeiros”. Para os cálculos de PCC, consideramos apenas os sinais m/z do precursor da amostra (MS1) e os conjuntos de dados de fragmentos com pelo menos oito picos verdadeiros.
Se a intensidade da característica de qualidade do precursor em toda a amostra estiver significativamente correlacionada com a intensidade reduzida da mesma característica de qualidade quando submetida a baixa ou alta energia de colisão, e se a característica não for rotulada como um pico isotópico pelo CAMERA, ela poderá ser melhor definida. Em seguida, calculando todos os pares precursor-produto possíveis dentro de 3 s (a janela de tempo de retenção estimada para a retenção do pico), realiza-se a análise de correlação. Somente quando o valor de m/z for menor que o valor do precursor e a fragmentação MS/MS ocorrer na mesma posição da amostra no conjunto de dados que o precursor do qual deriva, ela será considerada um fragmento.
Com base nessas duas regras simples, excluímos os fragmentos especificados com valores de m/z maiores que o m/z do precursor identificado, e com base na posição da amostra onde o precursor aparece e no fragmento especificado. Também é possível selecionar as características de qualidade geradas por muitos fragmentos gerados na fonte em modo MS1 como precursores candidatos, gerando assim compostos MS/MS redundantes. Para reduzir essa redundância de dados, se a similaridade NDP dos espectros exceder 0,6 e eles pertencerem ao cromatograma “pcgroup” anotado pelo CAMERA, nós os mesclaremos. Finalmente, mesclamos todos os quatro resultados de CE associados ao precursor e aos fragmentos no espectro composto deconvoluído final, selecionando o pico de maior intensidade entre todos os picos candidatos com o mesmo valor de m/z em diferentes energias de colisão. As etapas de processamento subsequentes são baseadas no conceito de espectro composto e levam em consideração as diferentes condições de CE necessárias para maximizar a probabilidade de fragmentação, pois alguns fragmentos só podem ser detectados sob uma energia de colisão específica.
O RDPI (30) foi usado para calcular a indutibilidade do perfil metabólico. A diversidade do espectro metabólico (índice Hj) é derivada da abundância de precursores MS/MS usando a entropia de Shannon da distribuição de frequência MS/MS usando a seguinte equação descrita por Martínez et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij) onde Pij corresponde à frequência relativa do i-ésimo MS/MS na j-ésima amostra (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
A especificidade metabólica (índice Si) é definida como a identidade de expressão de um determinado MS/MS em relação à frequência entre as amostras consideradas. A especificidade do MS/MS é calculada como Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi)
Utilize a seguinte fórmula para medir o índice δj específico do metaboloma de cada amostra j e a média da especificidade MS/MS: δj = ∑i = 1mPijSi
Os espectros MS/MS são alinhados em pares e a similaridade é calculada com base nas duas pontuações. Primeiro, usando o método NDP padrão (também conhecido como método de correlação de cosseno), utiliza-se a seguinte equação para pontuar a similaridade do segmento entre os espectros: NDP = (∑iS1 & S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2 onde S1 e S2 são os valores correspondentes. Correspondentemente, para o espectro 1 e o espectro 2, bem como para WS1, i e WS2, i representa o peso baseado na intensidade do pico, de forma que a diferença do i-ésimo pico comum entre os dois espectros seja menor que 0,01 Da. O peso é calculado da seguinte forma: W = [intensidade do pico] m [qualidade] n, m = 0,5, n = 2, conforme sugerido pelo MassBank.
Um segundo método de pontuação foi implementado, que envolveu a análise das NL compartilhadas entre MS/MS. Para isso, utilizamos as 52 listas de NL frequentemente encontradas durante o processo de fragmentação de MS em conjunto, e as NL mais específicas (arquivo de dados S1) que foram previamente anotadas para o espectro MS/MS dos metabólitos secundários das espécies de Nepenthes enfraquecidas (9, 26). Criamos um vetor binário de 1 e 0 para cada MS/MS, correspondendo à presença e à inexistência de algumas NL, respectivamente. Com base na similaridade da distância euclidiana, a pontuação de similaridade de NL é calculada para cada par de vetores binários de NL.
Para realizar o agrupamento duplo, utilizamos o pacote R DiffCoEx, que se baseia numa extensão da Análise de Coexpressão Gênica Ponderada (WGCNA). Utilizando as matrizes de pontuação NDP e NL dos espectros MS/MS, usamos o DiffCoEx para calcular a matriz de correlação comparativa. O agrupamento binário foi realizado definindo o parâmetro “cutreeDynamic” como method = “hybrid”, cutHeight = 0.9999, deepSplit = T e minClusterSize = 10. O código-fonte R do DiffCoEx foi baixado do arquivo adicional 1 de Tesson et al. (57); o pacote de software R WGCNA necessário pode ser encontrado em https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Para realizar a análise de rede molecular MS/MS, calculamos a conectividade espectral pareada com base nos tipos de similaridade NDP e NL e utilizamos o software Cytoscape para visualizar a topologia da rede usando o layout orgânico na extensão do algoritmo de layout yFiles do CyFilescape.
Utilize o software R versão 3.0.1 para realizar a análise estatística dos dados. A significância estatística foi avaliada por meio de análise de variância (ANOVA) de dois fatores, seguida pelo teste post-hoc de Tukey (HSD). Para analisar a diferença entre o tratamento com herbívoros e o controle, a distribuição bicaudal dos dois grupos de amostras com a mesma variância foi analisada utilizando o teste t de Student.
Para acessar o material complementar deste artigo, visite http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1
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A teoria da informação fornece uma moeda universal para a comparação de metabolomas específicos e a previsão de teorias de defesa em testes.
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