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O agente causal da necrose fúngica em plantas, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, utiliza uma estratégia multifacetada para infectar diferentes plantas hospedeiras. Este estudo propõe o uso da diamina L-ornitina, um aminoácido não proteico que estimula a síntese de outros aminoácidos essenciais, como uma estratégia alternativa de manejo para aprimorar as respostas moleculares, fisiológicas e bioquímicas de Phaseolus vulgaris L. ao mofo branco causado por Pseudomonas sclerotiorum. Experimentos in vitro mostraram que a L-ornitina inibiu significativamente o crescimento micelial de S. pyrenoidosa de forma dose-dependente. Além disso, reduziu significativamente a severidade do mofo branco em condições de casa de vegetação. Ademais, a L-ornitina estimulou o crescimento das plantas tratadas, indicando que as concentrações testadas de L-ornitina não foram fitotóxicas para as plantas tratadas. Além disso, a L-ornitina aumentou a expressão de antioxidantes não enzimáticos (fenólicos solúveis totais e flavonoides) e antioxidantes enzimáticos (catalase (CAT), peroxidase (POX) e polifenol oxidase (PPO)), e aumentou a expressão de três genes relacionados a antioxidantes (PvCAT1, PvSOD e PvGR). Ademais, a análise in silico revelou a presença de uma proteína putativa de oxaloacetato acetil-hidrolase (SsOAH) no genoma de S. sclerotiorum, que apresentou alta similaridade com as proteínas de oxaloacetato acetil-hidrolase (SsOAH) de Aspergillus fijiensis (AfOAH) e Penicillium sp. (PlOAH) em termos de análise funcional, domínios conservados e topologia. Curiosamente, a adição de L-ornitina ao meio de caldo de dextrose de batata (PDB) diminuiu significativamente a expressão do gene SsOAH no micélio de S. sclerotiorum. Da mesma forma, a aplicação exógena de L-ornitina diminuiu significativamente a expressão do gene SsOAH no micélio fúngico coletado de plantas tratadas. Finalmente, a aplicação de L-ornitina diminuiu significativamente a secreção de ácido oxálico tanto no meio PDB quanto nas folhas infectadas. Em conclusão, a L-ornitina desempenha um papel fundamental na manutenção do estado redox, bem como no aumento da resposta de defesa das plantas infectadas. Os resultados deste estudo podem auxiliar no desenvolvimento de métodos inovadores e ecologicamente corretos para o controle do mofo branco e a mitigação de seu impacto na produção de feijão e outras culturas.
O mofo branco, causado pelo fungo necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, é uma doença devastadora que reduz a produtividade e representa uma séria ameaça à produção global de feijão (Phaseolus vulgaris L.) (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum é um dos patógenos fúngicos de solo mais difíceis de controlar, com uma ampla gama de hospedeiros, abrangendo mais de 600 espécies de plantas, e a capacidade de macerar rapidamente os tecidos hospedeiros de forma não específica (Liang e Rollins, 2018). Em condições desfavoráveis, o fungo passa por uma fase crítica de seu ciclo de vida, permanecendo dormente por longos períodos como estruturas pretas, duras e semelhantes a sementes, chamadas de escleródios, no solo, ou como crescimentos brancos e felpudos no micélio ou na medula do caule de plantas infectadas (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum é capaz de formar escleródios, o que lhe permite sobreviver em campos infectados por longos períodos e persistir durante a doença (Schwartz et al., 2005). Os escleródios são ricos em nutrientes, podem persistir no solo por longos períodos e servem como inóculo primário para infecções subsequentes (Schwartz et al., 2005). Em condições favoráveis, os escleródios germinam e produzem esporos aerotransportados que podem infectar todas as partes aéreas da planta, incluindo, entre outras, flores, caules ou vagens (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum utiliza uma estratégia de múltiplas etapas para infectar suas plantas hospedeiras, envolvendo uma série de eventos coordenados desde a germinação dos escleródios até o desenvolvimento dos sintomas. Inicialmente, S. sclerotiorum produz esporos suspensos (chamados ascósporos) a partir de estruturas semelhantes a cogumelos, denominadas apotécios, que se tornam aerotransportados e se desenvolvem em escleródios imóveis em restos de plantas infectadas (Bolton et al., 2006). O fungo então secreta ácido oxálico, um fator de virulência, para controlar o pH da parede celular da planta, promover a degradação enzimática e a invasão dos tecidos (Hegedus e Rimmer, 2005) e suprimir a explosão oxidativa da planta hospedeira. Esse processo de acidificação enfraquece a parede celular da planta, proporcionando um ambiente favorável para a operação normal e eficiente das enzimas degradadoras da parede celular (EDPC) do fungo, permitindo que o patógeno supere a barreira física e penetre nos tecidos da planta hospedeira (Marciano et al., 1983). Uma vez penetrado, o S. sclerotiorum secreta uma série de enzimas de defesa contra a água (CWDEs), como a poligalacturonase e a celulase, que facilitam sua disseminação nos tecidos infectados e causam necrose tecidual. A progressão das lesões e dos emaranhados de hifas leva aos sintomas característicos do mofo branco (Hegedus e Rimmer, 2005). Enquanto isso, as plantas hospedeiras reconhecem os padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) por meio de receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), desencadeando uma série de eventos de sinalização que, em última instância, ativam as respostas de defesa.
Apesar de décadas de esforços no controle da doença, a escassez de germoplasma resistente adequado persiste no feijão, assim como em outras culturas comerciais, devido à resistência, sobrevivência e adaptabilidade do patógeno. O manejo da doença é, portanto, extremamente desafiador e requer uma estratégia integrada e multifacetada que inclua uma combinação de práticas culturais, controle biológico e fungicidas químicos (O'Sullivan et al., 2021). O controle químico do mofo branco é o mais eficaz, pois os fungicidas, quando aplicados corretamente e no momento certo, podem controlar efetivamente a disseminação da doença, reduzir a severidade da infecção e minimizar as perdas de produtividade. No entanto, o uso excessivo e a dependência de fungicidas podem levar ao surgimento de cepas resistentes de S. sclerotiorum e impactar negativamente organismos não-alvo, a saúde do solo e a qualidade da água (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Portanto, a busca por alternativas ambientalmente amigáveis ​​tornou-se uma prioridade máxima.
As poliaminas (PAs), como a putrescina, a espermidina, a espermina e a cadaverina, podem servir como alternativas promissoras contra patógenos de plantas transmitidos pelo solo, reduzindo total ou parcialmente o uso de fungicidas químicos perigosos (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Em plantas superiores, as PAs estão envolvidas em muitos processos fisiológicos, incluindo, entre outros, a divisão celular, a diferenciação e a resposta a estresses abióticos e bióticos (Killiny e Nehela, 2020). Elas podem atuar como antioxidantes, ajudar a eliminar espécies reativas de oxigênio (ROS), manter a homeostase redox (Nehela e Killiny, 2023), induzir genes relacionados à defesa (Romero et al., 2018), regular diversas vias metabólicas (Nehela e Killiny, 2023), modular fitormônios endógenos (Nehela e Killiny, 2019), estabelecer resistência sistêmica adquirida (RSA) e regular interações planta-patógeno (Nehela e Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Vale ressaltar que os mecanismos e funções específicos das PAs na defesa vegetal variam dependendo da espécie vegetal, dos patógenos e das condições ambientais. A PA mais abundante nas plantas é biossintetizada a partir da poliamina essencial L-ornitina (Killiny e Nehela, 2020).
A L-ornitina desempenha múltiplas funções no crescimento e desenvolvimento das plantas. Por exemplo, estudos anteriores demonstraram que, no arroz (Oryza sativa), a ornitina pode estar associada à reciclagem de nitrogênio (Liu et al., 2018), à produtividade, qualidade e aroma do arroz (Lu et al., 2020) e à resposta ao estresse hídrico (Yang et al., 2000). Além disso, a aplicação exógena de L-ornitina aumentou significativamente a tolerância à seca na beterraba sacarina (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) e atenuou o estresse salino em plantas de cebola (Allium cepa) (Çavuşoǧlu e Çavuşoǧlu, 2021) e caju (Anacardium occidentale) (da Rocha et al., 2012). O papel potencial da L-ornitina na defesa contra o estresse abiótico pode ser atribuído ao seu envolvimento no acúmulo de prolina nas plantas tratadas. Por exemplo, genes relacionados ao metabolismo da prolina, como os genes da ornitina delta aminotransferase (delta-OAT) e da prolina desidrogenase (ProDH1 e ProDH2), já foram relatados como envolvidos na defesa de Nicotiana benthamiana e Arabidopsis thaliana contra cepas não hospedeiras de Pseudomonas syringae (Senthil-Kumar e Mysore, 2012). Por outro lado, a ornitina descarboxilase (ODC) fúngica é necessária para o crescimento do patógeno (Singh et al., 2020). O direcionamento da ODC de Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici por meio do silenciamento gênico induzido pelo hospedeiro (HIGS) aumentou significativamente a resistência de plantas de tomate à murcha de Fusarium (Singh et al., 2020). No entanto, o papel potencial da aplicação exógena de ornitina contra estresses bióticos, como fitopatógenos, ainda não foi bem estudado. Mais importante ainda, os efeitos da ornitina na resistência a doenças e os fenômenos bioquímicos e fisiológicos associados permanecem em grande parte inexplorados.
Compreender a complexidade da infecção por S. sclerotiorum em leguminosas é importante para o desenvolvimento de estratégias de controle eficazes. Neste estudo, buscamos identificar o papel potencial da diamina L-ornitina como um fator chave no fortalecimento dos mecanismos de defesa e da resistência de leguminosas à infecção por Sclerotinia sclerotiorum. Nossa hipótese é que, além de fortalecer as respostas de defesa das plantas infectadas, a L-ornitina também desempenha um papel fundamental na manutenção do estado redox. Propomos que os efeitos potenciais da L-ornitina estejam relacionados à regulação de mecanismos de defesa antioxidante enzimáticos e não enzimáticos e à interferência com fatores de patogenicidade/virulência fúngica e proteínas associadas. Essa dupla funcionalidade da L-ornitina a torna uma candidata promissora para uma estratégia sustentável de mitigação do impacto do mofo branco e aumento da resistência de leguminosas comuns a esse potente patógeno fúngico. Os resultados deste estudo podem auxiliar no desenvolvimento de métodos inovadores e ecologicamente corretos para o controle do mofo branco e a mitigação de seu impacto na produção de leguminosas.
Neste estudo, utilizou-se como material experimental uma variedade comercial suscetível de feijão comum, Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Sementes saudáveis ​​foram gentilmente cedidas pelo Departamento de Pesquisa de Leguminosas do Instituto de Pesquisa de Culturas de Campo (FCRI), Centro de Pesquisa Agrícola (ARC), Egito. Cinco sementes foram semeadas em vasos plásticos (diâmetro interno de 35 cm, profundidade de 50 cm) preenchidos com solo infectado com S. sclerotiorum, em condições de casa de vegetação (25 ± 2 °C, umidade relativa de 75 ± 1%, fotoperíodo de 8 h de luz/16 h de escuro). De 7 a 10 dias após a semeadura (DAS), as mudas foram desbastadas, deixando-se apenas duas mudas com crescimento uniforme e três folhas totalmente expandidas em cada vaso. Todas as plantas em vasos foram regadas a cada duas semanas e fertilizadas mensalmente na dose recomendada para a variedade em questão.
Para preparar uma solução de L-ornitinadiamina (também conhecida como ácido (+)-(S)-2,5-diaminopentanoico; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha) com concentração de 500 mg/L, 50 mg foram dissolvidos em 100 mL de água destilada estéril. A solução estoque foi então diluída e utilizada nos experimentos subsequentes. Resumidamente, seis séries de concentrações de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) foram testadas in vitro. Além disso, água destilada estéril foi utilizada como controle negativo (Mock) e o fungicida comercial “Rizolex-T” em pó molhável a 50% (toclofós-metil 20% + tiram 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Governadoria de Gharbia, Egito) foi utilizado como controle positivo. O fungicida comercial “Rizolex-T” foi testado in vitro em cinco concentrações (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L).
Amostras de caules e vagens de feijão comum apresentando sintomas típicos de mofo branco (taxa de infestação: 10–30%) foram coletadas em fazendas comerciais. Embora a maioria dos materiais vegetais infectados tenha sido identificada por espécie/variedade (variedade comercial suscetível Giza 3), outros, especialmente aqueles obtidos em mercados locais, eram de espécies desconhecidas. Os materiais infectados coletados foram inicialmente desinfetados superficialmente com solução de hipoclorito de sódio a 0,5% por 3 minutos, enxaguados diversas vezes com água destilada estéril e secos com papel de filtro estéril para remover o excesso de água. Os órgãos infectados foram então cortados em pequenos pedaços do tecido central (entre os tecidos sadios e infectados), cultivados em meio de ágar dextrose de batata (PDA) e incubados a 25 ± 2 °C com um ciclo de 12 h de luz/12 h de escuro por 5 dias para estimular a formação de escleródios. O método da ponta micelial também foi utilizado para purificar isolados fúngicos de culturas mistas ou contaminadas. O isolado fúngico purificado foi inicialmente identificado com base em suas características morfológicas culturais e, posteriormente, confirmado como S. sclerotiorum com base em características microscópicas. Finalmente, todos os isolados purificados foram testados quanto à patogenicidade na cultivar suscetível de feijão comum Giza 3 para atender aos postulados de Koch.
Além disso, o isolado de S. sclerotiorum mais invasivo (isolado nº 3) foi confirmado por meio do sequenciamento do espaçador transcrito interno (ITS), conforme descrito por White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Resumidamente, os isolados foram cultivados em caldo de batata-dextrose (PDB) e incubados a 25 ± 2 °C por 5 a 7 dias. O micélio fúngico foi então coletado, filtrado em gaze, lavado duas vezes com água estéril e seco com papel de filtro estéril. O DNA genômico foi isolado utilizando o kit Quick-DNA™ Fungal/Bacterial Miniprep (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). A região ITS do rDNA foi então amplificada utilizando o par de primers específico ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; tamanho esperado: 540 pb) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Os produtos de PCR purificados foram submetidos ao sequenciamento (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). As sequências de ITS rDNA foram sequenciadas bidirecionalmente utilizando o método de sequenciamento de Sanger. As sequências de consulta montadas foram então comparadas com os dados mais recentes do GenBank e do Centro Nacional de Informação sobre Biotecnologia (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) utilizando o software BLASTn. A sequência de consulta foi comparada com outras 20 cepas/isolados de S. sclerotiorum obtidos dos dados mais recentes do NCBI GenBank (Tabela Suplementar S1) usando o ClustalW no pacote de análise genética evolutiva molecular (MEGA-11; versão 11) (Kumar et al., 2024). A análise evolutiva foi realizada utilizando o método de máxima verossimilhança e o modelo geral de substituição de nucleotídeos reversível no tempo (Nei e Kumar, 2000). A árvore com a maior verossimilhança logarítmica é mostrada. A árvore inicial para a busca heurística é selecionada escolhendo-se a árvore com a maior verossimilhança logarítmica entre a árvore de vizinho mais próximo (NJ) (Kumar et al., 2024) e a árvore de máxima parcimônia (MP). A árvore NJ foi construída utilizando uma matriz de distância pareada calculada com base no modelo geral reversível no tempo (Nei e Kumar, 2000).
A atividade antibacteriana da L-ornitina e do bactericida “Rizolex-T” foi determinada in vitro pelo método de difusão em ágar. Método: A quantidade apropriada da solução estoque de L-ornitina (500 mg/L) foi misturada homogeneamente com 10 mL do meio de cultura PDA para preparar soluções com concentrações finais de 12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L, respectivamente. Cinco concentrações do fungicida “Rizolex-T” (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L) e água destilada estéril foram utilizadas como controle. Após a solidificação do meio, um disco de micélio recém-preparado da cultura de Sclerotinia sclerotiorum, com 4 mm de diâmetro, foi transferido para o centro da placa de Petri e cultivado a 25±2°C até que o micélio cobrisse toda a placa de Petri controle, após o que o crescimento fúngico foi registrado. Calcule a porcentagem de inibição do crescimento radial de S. sclerotiorum usando a equação 1:
O experimento foi repetido duas vezes, com seis repetições biológicas para cada grupo controle/experimental e cinco vasos (duas plantas por vaso) para cada repetição biológica. Cada repetição biológica foi analisada duas vezes (duas repetições técnicas) para garantir a precisão, confiabilidade e reprodutibilidade dos resultados experimentais. Além disso, a análise de regressão probit foi utilizada para calcular a concentração inibitória de 50% (CI50) e a CI99 (Prentice, 1976).
Para avaliar o potencial da L-ornitina em condições de estufa, foram realizados dois experimentos consecutivos em vasos. Resumidamente, os vasos foram preenchidos com solo argiloso-arenoso esterilizado (3:1) e inoculados com uma cultura recém-preparada de S. sclerotiorum. Primeiramente, o isolado mais invasivo de S. sclerotiorum (isolado nº 3) foi cultivado cortando-se um escleródio ao meio, colocando-o com a face voltada para baixo em meio PDA e incubando-o a 25 °C no escuro (24 h) por 4 dias para estimular o crescimento micelial. Em seguida, quatro discos de ágar com 5 mm de diâmetro foram retirados da borda do escleródio e inoculados com 100 g de uma mistura esterilizada de farelo de trigo e arroz (1:1, v/v). Todos os frascos foram incubados a 25 ± 2 °C sob um ciclo de 12 h de luz/12 h de escuro por 5 dias para estimular a formação de escleródios. O conteúdo de todos os frascos foi homogeneizado antes da adição do solo. Em seguida, 100 g da mistura de farelo colonizador foram adicionados a cada vaso para garantir uma concentração constante de patógenos. Os vasos inoculados foram regados para ativar o crescimento fúngico e colocados em condições de estufa por 7 dias.
Cinco sementes da variedade Giza 3 foram então semeadas em cada vaso. Nos vasos tratados com L-ornitina e o fungicida Rizolex-T, as sementes esterilizadas foram imersas por duas horas em uma solução aquosa dos dois compostos, com concentração final de IC99 de aproximadamente 250 mg/L e 50 mg/L, respectivamente, e depois secas ao ar por uma hora antes da semeadura. Como controle negativo, as sementes foram imersas em água destilada esterilizada. Após 10 dias, antes da primeira rega, as plântulas foram desbastadas, deixando-se apenas duas plântulas em cada vaso. Adicionalmente, para garantir a infecção por S. sclerotiorum, caules de feijão no mesmo estádio de desenvolvimento (10 dias) foram cortados em dois locais diferentes com um bisturi esterilizado e aproximadamente 0,5 g da mistura de farelo colonizador foi colocada em cada corte, seguido de alta umidade para estimular a infecção e o desenvolvimento da doença em todas as plantas inoculadas. As plantas de controle foram feridas de forma semelhante e uma quantidade igual (0,5 g) de mistura de farelo estéril e não colonizada foi colocada na ferida e mantida sob alta umidade para simular o ambiente para o desenvolvimento da doença e garantir a consistência entre os grupos de tratamento.
Método de tratamento: Mudas de feijão foram irrigadas com 500 ml de uma solução aquosa de L-ornitina (250 mg/l) ou do fungicida Rizolex-T (50 mg/l) por via foliar. O tratamento foi repetido três vezes, com intervalo de 10 dias entre as aplicações. O grupo controle (placebo) recebeu 500 ml de água destilada estéril. Todos os tratamentos foram realizados em casa de vegetação (25 ± 2 °C, 75 ± 1% de umidade relativa e fotoperíodo de 8 h de luz/16 h de escuro). Os vasos foram irrigados quinzenalmente e tratados mensalmente com um fertilizante NPK balanceado (20-20-20, com 3,6% de enxofre e micronutrientes; Zain Seeds, Egito) na concentração de 3–4 g/l, por pulverização foliar, seguindo as recomendações para a variedade específica e as instruções do fabricante. Salvo indicação em contrário, folhas maduras totalmente expandidas (2ª e 3ª folhas a partir do ápice) foram coletadas de cada réplica biológica 72 horas após o tratamento (hpt), homogeneizadas, agrupadas e armazenadas a -80 °C para análises posteriores, incluindo, entre outras, a localização histoquímica in situ de indicadores de estresse oxidativo, peroxidação lipídica, antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos e expressão gênica.
A intensidade da infecção por mofo branco foi avaliada semanalmente, 21 dias após a inoculação (dai), utilizando uma escala de 1 a 9 (Tabela Suplementar S2) baseada na escala de Petzoldt e Dickson (1996), modificada por Teran et al. (2006). Resumidamente, os caules e ramos das plantas de feijão foram examinados a partir do ponto de inoculação para acompanhar a progressão das lesões ao longo dos entrenós e nós. A distância da lesão, do ponto de inoculação até o ponto mais distante ao longo do caule ou ramo, foi então medida e uma pontuação de 1 a 9 foi atribuída com base na localização da lesão, onde (1) indicava ausência de infecção visível próxima ao ponto de inoculação e (2–9) indicava um aumento gradual no tamanho da lesão e sua progressão ao longo dos nós/entrenós (Tabela Suplementar S2). A intensidade da infecção por mofo branco foi então convertida em porcentagem utilizando a fórmula 2:
Além disso, a área sob a curva de progressão da doença (AUDPC) foi calculada usando a fórmula (Shaner e Finney, 1977), que foi recentemente adaptada para a podridão branca do feijão comum (Chauhan et al., 2020) usando a equação 3:
Onde Yi = severidade da doença no tempo ti, Yi+1 = severidade da doença no tempo seguinte ti+1, ti = tempo da primeira medição (em dias), ti+1 = tempo da próxima medição (em dias), n = número total de pontos de tempo ou pontos de observação. Os parâmetros de crescimento da planta de feijão, incluindo altura da planta (cm), número de ramos por planta e número de folhas por planta, foram registrados semanalmente durante 21 dias em todas as repetições biológicas.
Em cada repetição biológica, amostras de folhas (segunda e terceira folhas totalmente desenvolvidas a partir do ápice) foram coletadas no 45º dia após o tratamento (15 dias após o último tratamento). Cada repetição biológica consistiu em cinco vasos (duas plantas por vaso). Cerca de 500 mg do tecido triturado foram utilizados para a extração de pigmentos fotossintéticos (clorofila a, clorofila b e carotenoides) utilizando acetona a 80% a 4 °C no escuro. Após 24 h, as amostras foram centrifugadas e o sobrenadante foi coletado para a determinação colorimétrica dos teores de clorofila a, clorofila b e carotenoides utilizando um espectrofotômetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japão) de acordo com o método de (Lichtenthaler, 1987), medindo-se a absorbância em três comprimentos de onda diferentes (A470, A646 e A663 nm). Finalmente, o conteúdo de pigmentos fotossintéticos foi calculado usando as seguintes fórmulas 4–6 descritas por Lichtenthaler (1987).
Setenta e duas horas após o tratamento (hpt), folhas (a segunda e a terceira folhas totalmente desenvolvidas a partir do ápice) foram coletadas de cada repetição biológica para localização histoquímica in situ de peróxido de hidrogênio (H2O2) e ânion superóxido (O2•−). Cada repetição biológica consistiu em cinco vasos (duas plantas por vaso). Cada repetição biológica foi analisada em duplicata (duas repetições técnicas) para garantir a precisão, confiabilidade e reprodutibilidade do método. H2O2 e O2•− foram determinados utilizando 0,1% de 3,3′-diaminobenzidina (DAB; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha) ou nitroblue tetrazolium (NBT; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha), respectivamente, seguindo os métodos descritos por Romero-Puertas et al. (2004) e Adam et al. (1989) com pequenas modificações. Para a localização histoquímica de H₂O₂ in situ, as cúspides foram infiltradas a vácuo com 0,1% de DAB em tampão Tris 10 mM (pH 7,8) e incubadas à temperatura ambiente sob luz por 60 minutos. As cúspides foram branqueadas em TCA 0,15% (v/v) em etanol:clorofórmio 4:1 (v/v) (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egito) e expostas à luz até escurecerem. De forma semelhante, as válvulas foram infiltradas a vácuo com tampão fosfato de potássio 10 mM (pH 7,8) contendo 0,1% (p/v) de HBT para a localização histoquímica de O₂•⁻ in situ. As cúspides foram incubadas sob luz à temperatura ambiente por 20 minutos, branqueadas como descrito acima e, em seguida, iluminadas até o aparecimento de manchas azul-escuras/violeta. A intensidade da cor marrom resultante (como indicador de H2O2) ou azul-violeta (como indicador de O2•−) foi avaliada usando a versão Fiji do pacote de processamento de imagens ImageJ (http://fiji.sc; acessado em 7 de março de 2024).
O malondialdeído (MDA; como marcador de peroxidação lipídica) foi determinado de acordo com o método de Du e Bramlage (1992), com ligeiras modificações. Folhas de cada repetição biológica (segunda e terceira folhas totalmente desenvolvidas a partir do ápice) foram coletadas 72 horas após o tratamento (hpt). Cada repetição biológica incluiu cinco vasos (duas plantas por vaso). Cada repetição biológica foi analisada em duplicata (duas repetições técnicas) para garantir a precisão, confiabilidade e reprodutibilidade do método. Resumidamente, 0,5 g de tecido foliar moído foi utilizado para a extração de MDA com ácido tricloroacético (TCA) a 20% (MilliporeSigma, Burlington, MA, EUA) contendo 0,01% de hidroxitolueno butilado (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA). O teor de MDA no sobrenadante foi então determinado colorimetricamente, medindo-se a absorbância a 532 e 600 nm usando um espectrofotômetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japão) e expresso em nmol g−1 FW.
Para a avaliação de antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos, folhas (a segunda e a terceira folhas totalmente desenvolvidas a partir do ápice) foram coletadas de cada repetição biológica 72 horas após o tratamento (hpt). Cada repetição biológica consistiu em cinco vasos (duas plantas por vaso). Cada amostra biológica foi analisada em duplicata (duas amostras técnicas). Duas folhas foram trituradas com nitrogênio líquido e utilizadas diretamente para a determinação de antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos, aminoácidos totais, teor de prolina, expressão gênica e quantificação de oxalato.
O teor de fenólicos solúveis totais foi determinado utilizando o reagente de Folin-Ciocalteu (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) com ligeiras modificações do método descrito por Kahkonen et al. (1999). Resumidamente, aproximadamente 0,1 g de tecido foliar homogeneizado foi extraído com 20 ml de metanol a 80% no escuro durante 24 h, e o sobrenadante foi coletado após centrifugação. 0,1 ml do extrato da amostra foi misturado com 0,5 ml de reagente de Folin-Ciocalteu (10%), agitado por 30 s e deixado no escuro por 5 min. Em seguida, 0,5 ml de solução de carbonato de sódio a 20% (Na₂CO₃; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Cairo, Egito) foi adicionado a cada tubo, misturado completamente e incubado à temperatura ambiente no escuro por 1 h. Após a incubação, a absorbância da mistura reacional foi medida a 765 nm utilizando um espectrofotômetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japão). A concentração de fenóis solúveis totais nos extratos das amostras foi determinada utilizando uma curva de calibração de ácido gálico (Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA) e expressa em miligramas de equivalente de ácido gálico por grama de peso fresco (mg EAG g-1 de peso fresco).
O teor total de flavonoides solúveis foi determinado de acordo com o método de Djeridane et al. (2006), com ligeiras modificações. Resumidamente, 0,3 ml do extrato metanólico acima mencionado foi misturado com 0,3 ml de solução de cloreto de alumínio a 5% (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA), agitado vigorosamente e incubado à temperatura ambiente por 5 minutos. Em seguida, adicionou-se 0,3 ml de solução de acetato de potássio a 10% (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egito), a mistura foi homogeneizada e incubada à temperatura ambiente por 30 minutos no escuro. Após a incubação, a absorbância da mistura reacional foi medida a 430 nm utilizando um espectrofotômetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japão). A concentração total de flavonoides solúveis nos extratos das amostras foi determinada utilizando uma curva de calibração de rutina (TCI America, Portland, OR, EUA) e expressa em miligramas de equivalente de rutina por grama de peso fresco (mg RE g-1 de peso fresco).
O teor total de aminoácidos livres nas folhas de feijão foi determinado utilizando um reagente de ninhidrina modificado (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EUA), baseado no método proposto por Yokoyama e Hiramatsu (2003) e modificado por Sun et al. (2006). Resumidamente, 0,1 g de tecido moído foi extraído com tampão pH 5,4, e 200 μL do sobrenadante foram reagidos com 200 μL de ninhidrina (2%) e 200 μL de piridina (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, EUA), incubados em banho-maria fervente por 30 min, resfriados e a absorbância foi medida a 580 nm utilizando um espectrofotômetro UV-160A (Shimadzu Corporation, Japão). Por outro lado, a prolina foi determinada pelo método de Bates (Bates et al., 1973). A prolina foi extraída com ácido sulfossalicílico a 3% (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EUA) e, após centrifugação, 0,5 ml do sobrenadante foi misturado com 1 ml de ácido acético glacial (Fisher Scientific, Hampton, NH, EUA) e reagente de ninhidrina, incubado a 90 °C por 45 min, resfriado e medido a 520 nm usando o mesmo espectrofotômetro descrito anteriormente. Os aminoácidos livres totais e a prolina nos extratos foliares foram determinados usando curvas de calibração de glicina e prolina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), respectivamente, e expressos em mg/g de peso fresco.
Para determinar a atividade enzimática das enzimas antioxidantes, aproximadamente 500 mg de tecido homogeneizado foram extraídos com 3 ml de tampão Tris 50 mM (pH 7,8) contendo 1 mM de EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e 7,5% de polivinilpirrolidona (PVP; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA), centrifugados a 10.000 × g por 20 min sob refrigeração (4 °C), e o sobrenadante (extrato enzimático bruto) foi coletado (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). A catalase (CAT) foi então reagida com 2 ml de tampão fosfato de sódio 0,1 M (pH 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e 100 μl de solução de H2O2 269 mM para determinar sua atividade enzimática de acordo com o método de Aebi (1984) com ligeiras modificações (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). A atividade enzimática da peroxidase dependente de guaiacol (POX) foi determinada utilizando o método de Harrach et al. (2009). (2008) com pequenas modificações (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023) e a atividade enzimática da polifenol oxidase (PPO) foi determinada após reação com 2,2 ml de tampão fosfato de sódio 100 mM (pH 6,0), 100 μl de guaiacol (TCI chemicals, Portland, OR, EUA) e 100 μl de H2O2 12 mM. O método foi ligeiramente modificado a partir de (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). O ensaio foi realizado após reação com 3 ml de solução de catecol (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, EUA) (0,01 M) preparada na hora em tampão fosfato 0,1 M (pH 6,0). A atividade da CAT foi medida monitorando a decomposição do H2O2 a 240 nm (A240), a atividade da POX foi medida monitorando o aumento da absorbância a 436 nm (A436) e a atividade da PPO foi medida registrando as flutuações de absorbância a 495 nm (A495) a cada 30 s durante 3 min usando um espectrofotômetro UV-160A (Shimadzu, Japão).
A RT-PCR em tempo real foi utilizada para detectar os níveis de transcritos de três genes relacionados a antioxidantes, incluindo catalase peroxissomal (PvCAT1; número de acesso GenBank KF033307.1), superóxido dismutase (PvSOD; número de acesso GenBank XM_068639556.1) e glutationa redutase (PvGR; número de acesso GenBank KY195009.1), em folhas de feijão (a segunda e a terceira folhas totalmente desenvolvidas a partir do ápice) 72 horas após o último tratamento. Resumidamente, o RNA foi isolado utilizando o kit Simply P Total RNA Extraction (Cat. nº BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) de acordo com o protocolo do fabricante. Em seguida, o cDNA foi sintetizado utilizando o kit TOP script™ cDNA Synthesis, seguindo as instruções do fabricante. As sequências dos primers para os três genes mencionados estão listadas na Tabela Suplementar S3. O gene PvActin-3 (número de acesso GenBank: XM_068616709.1) foi utilizado como gene de referência e a expressão gênica relativa foi calculada utilizando o método 2-ΔΔCT (Livak e Schmittgen, 2001). A estabilidade da actina sob estresse biótico (interação incompatível entre leguminosas comuns e o fungo causador da antracnose Colletotrichum lindemuthianum) e estresse abiótico (seca, salinidade, baixa temperatura) foi demonstrada (Borges et al., 2012).
Inicialmente, realizamos uma análise in silico de todo o genoma das proteínas oxaloacetato acetil-hidrolase (OAH) em S. sclerotiorum usando a ferramenta BLAST proteína-proteína (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Resumidamente, usamos OAH de Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taxide: 1191702; número de acesso GenBank XP_040799428.1; 342 aminoácidos) e Penicillium lagena (PlOAH; taxide: 94218; número de acesso GenBank XP_056833920.1; 316 aminoácidos) como sequências de consulta para mapear a proteína homóloga em S. sclerotiorum (taxide: 5180). A análise BLASTp foi realizada utilizando os dados genômicos mais recentes de S. sclerotiorum disponíveis no GenBank, no site do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Além disso, o gene OAH predito de S. sclerotiorum (SsOAH) e a análise evolutiva e a árvore filogenética de AfOAH de A. fijiensis CBS 313.89 e PlOAH de P. lagena foram inferidos usando o método de máxima verossimilhança no MEGA11 (Tamura et al., 2021) e o modelo baseado na matriz JTT (Jones et al., 1992). A árvore filogenética foi combinada com a análise de alinhamento múltiplo das sequências de proteínas de todos os genes OAH preditos (SsOAH) de S. sclerotiorum e a sequência de consulta usando a ferramenta Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos e Agarwala, 2007). Além disso, as sequências de aminoácidos de SsOAH de S. sclerotiorum com melhor correspondência foram alinhadas com as sequências de consulta (AfOAH e PlOAH) (Larkin et al., 2007) usando o ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), e as regiões conservadas no alinhamento foram visualizadas usando a ferramenta ESPript (versão 3.0; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Além disso, os domínios funcionais representativos previstos e os sítios conservados da SsOAH de S. sclerotiorum foram classificados interativamente em diferentes famílias usando a ferramenta InterPro (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Finalmente, a modelagem da estrutura tridimensional (3D) da SsOAH de S. sclerotiorum prevista foi realizada usando o mecanismo de reconhecimento de homologia/analogia de proteínas (servidor Phyre2 versão 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015) e validada usando o servidor SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). As estruturas tridimensionais previstas (formato PDB) foram visualizadas interativamente usando o pacote UCSF-Chimera (versão 1.15; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) (Pettersen et al., 2004).
A PCR quantitativa em tempo real com fluorescência foi utilizada para determinar o nível transcricional da oxaloacetato acetil-hidrolase (SsOAH; número de acesso GenBank: XM_001590428.1) no micélio de Sclerotinia sclerotiorum. Resumidamente, S. sclerotiorum foi inoculada em um frasco contendo meio PDB e colocada em uma incubadora com agitação (modelo: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, EUA) a 25 ± 2 °C por 24 h a 150 rpm e na ausência de luz (24 h) para estimular o crescimento micelial. Posteriormente, as células foram tratadas com L-ornitina e o fungicida Rizolex-T nas concentrações finais de IC50 (aproximadamente 40 e 3,2 mg/L, respectivamente) e então cultivadas por mais 24 h nas mesmas condições. Após a incubação, as culturas foram centrifugadas a 2500 rpm por 5 min e o sobrenadante (micélio fúngico) foi coletado para análise da expressão gênica. Da mesma forma, o micélio fúngico foi coletado em 0, 24, 48, 72, 96 e 120 h pós-infecção de plantas infectadas que apresentavam mofo branco e micélio algodonoso na superfície dos tecidos infectados. O RNA foi extraído do micélio fúngico e, em seguida, o cDNA foi sintetizado conforme descrito anteriormente. As sequências dos primers para SsOAH estão listadas na Tabela Suplementar S3. SsActin (número de acesso GenBank: XM_001589919.1) foi utilizado como gene de referência, e a expressão gênica relativa foi calculada utilizando o método 2-ΔΔCT (Livak e Schmittgen, 2001).
O ácido oxálico foi determinado em caldo de dextrose de batata (PDB) e em amostras de plantas contendo o fungo patogênico Sclerotinia sclerotiorum, de acordo com o método de Xu e Zhang (2000), com pequenas modificações. Resumidamente, isolados de S. sclerotiorum foram inoculados em frascos contendo PDB e cultivados em incubadora com agitação (modelo I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, EUA) a 150 rpm, a 25 ± 2 °C, por 3 a 5 dias, em escuridão constante (24 h), para estimular o crescimento micelial. Após a incubação, a cultura fúngica foi filtrada em papel de filtro Whatman nº 1 e centrifugada a 2500 rpm por 5 min para remover o micélio residual. O sobrenadante foi coletado e armazenado a 4 °C para posterior determinação quantitativa de oxalato. Para o preparo das amostras de plantas, aproximadamente 0,1 g de fragmentos de tecido vegetal foram extraídos três vezes com água destilada (2 ml cada vez). As amostras foram então centrifugadas a 2500 rpm durante 5 minutos, o sobrenadante foi filtrado a seco através de papel de filtro Whatman nº 1 e recolhido para posterior análise.
Para a análise quantitativa do ácido oxálico, a mistura reacional foi preparada em um tubo de vidro com tampa, na seguinte ordem: 0,2 ml de amostra (ou filtrado de cultura em PDB ou solução padrão de ácido oxálico), 0,11 ml de azul de bromofenol (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, EUA), 0,198 ml de ácido sulfúrico 1 M (H₂SO₄; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egito) e 0,176 ml de dicromato de potássio 100 mM (K₂Cr₂O₇; TCI Chemicals, Portland, OR, EUA). A solução foi então diluída para 4,8 ml com água destilada, vigorosamente homogeneizada e imediatamente colocada em banho-maria a 60 °C. Após 10 minutos, a reação foi interrompida pela adição de 0,5 ml de solução de hidróxido de sódio (NaOH; 0,75 M). A absorbância (A600) da mistura de reação foi medida a 600 nm usando um espectrofotômetro UV-160 (Shimadzu Corporation, Japão). Meio PDB e água destilada foram usados ​​como controles para a quantificação dos filtrados de cultura e das amostras de plantas, respectivamente. As concentrações de ácido oxálico nos filtrados de cultura, expressas em microgramas de ácido oxálico por mililitro de meio PDB (μg.mL−1), e nos extratos foliares, expressas em microgramas de ácido oxálico por grama de peso fresco (μg.g−1 PF), foram determinadas usando uma curva de calibração de ácido oxálico (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, EUA).
Ao longo do estudo, todos os experimentos foram planejados em um delineamento inteiramente casualizado (DIC) com seis repetições biológicas por tratamento e cinco vasos por repetição biológica (duas plantas por vaso), salvo indicação em contrário. As repetições biológicas foram analisadas em duplicata (duas repetições técnicas). As repetições técnicas foram utilizadas para verificar a reprodutibilidade do mesmo experimento, mas não foram incluídas na análise estatística para evitar repetições espúrias. Os dados foram analisados ​​estatisticamente por meio de análise de variância (ANOVA) seguida pelo teste de Tukey-Kramer (HSD) (p ≤ 0,05). Para os experimentos in vitro, os valores de IC50 e IC99 foram calculados utilizando o modelo probit e os intervalos de confiança de 95% foram calculados.
Um total de quatro isolados foram coletados de diferentes campos de soja na província de El Ghabiya, Egito. Em meio PDA, todos os isolados produziram micélio branco cremoso que rapidamente se tornou branco algodonoso (Figura 1A) e, em seguida, bege ou marrom no estágio de esclerócio. Os escleródios são geralmente densos, pretos, esféricos ou de formato irregular, com 5,2 a 7,7 mm de comprimento e 3,4 a 5,3 mm de diâmetro (Figura 1B). Embora quatro isolados tenham desenvolvido um padrão marginal de escleródios na borda do meio de cultura após 10 a 12 dias de incubação a 25 ± 2 °C (Figura 1A), o número de escleródios por placa foi significativamente diferente entre eles (P < 0,001), sendo o isolado 3 o que apresentou o maior número de escleródios (32,33 ± 1,53 escleródios por placa; Figura 1C). De forma semelhante, o isolado nº 3 produziu mais ácido oxálico em PDB do que os outros isolados (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; Fig. 1D). O isolado nº 3 apresentou características morfológicas e microscópicas típicas do fungo fitopatogênico Sclerotinia sclerotiorum. Por exemplo, em meio PDA, as colônias do isolado nº 3 cresceram rapidamente, apresentaram coloração branco-creme (Figura 1A), com o inverso bege ou amarelo-salmão claro, e necessitaram de 6 a 7 dias a 25 ± 2 °C para cobrir completamente a superfície de uma placa de 9 cm de diâmetro. Com base nas características morfológicas e microscópicas descritas, o isolado nº 3 foi identificado como Sclerotinia sclerotiorum.
Figura 1. Características e patogenicidade de isolados de S. sclerotiorum de culturas de leguminosas comuns. (A) Crescimento micelial de quatro isolados de S. sclerotiorum em meio PDA, (B) escleródios de quatro isolados de S. sclerotiorum, (C) número de escleródios (por placa), (D) secreção de ácido oxálico em meio PDB (μg.mL−1) e (E) severidade da doença (%) de quatro isolados de S. sclerotiorum na cultivar comercial suscetível de leguminosa Giza 3 em condições de casa de vegetação. Os valores representam a média ± DP de cinco repetições biológicas (n = 5). Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas entre os tratamentos (p < 0,05). (F–H) Sintomas típicos de mofo branco apareceram nos caules e síliquas da parte aérea, respectivamente, 10 dias após a inoculação com o isolado nº 3 (dpi). (I) A análise evolutiva da região do espaçador transcrito interno (ITS) do isolado #3 de S. sclerotiorum foi realizada utilizando o método de máxima verossimilhança e comparada com 20 isolados/cepas de referência obtidos do banco de dados do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Os números acima das linhas de agrupamento indicam a cobertura da região (%) e os números abaixo das linhas de agrupamento indicam o comprimento do ramo.
Além disso, para confirmar a patogenicidade, quatro isolados de S. sclerotiorum obtidos foram utilizados para inocular a cultivar comercial de feijão suscetível Giza 3 em condições de casa de vegetação, o que está de acordo com os postulados de Koch (Fig. 1E). Embora todos os isolados fúngicos obtidos fossem patogênicos e capazes de infectar o feijão-verde (cv. Giza 3), causando sintomas típicos de mofo branco em todas as partes aéreas (Fig. 1F), especialmente nos caules (Fig. 1G) e vagens (Fig. 1H) aos 10 dias pós-inoculação (dpi), o isolado 3 foi o mais agressivo em dois experimentos independentes. O isolado 3 apresentou a maior severidade da doença (%) nas plantas de feijão (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 e 76,7 ± 3,1 aos 7, 14 e 21 dias pós-infecção, respectivamente; Figura 1F).
A identificação do isolado mais invasivo de S. sclerotiorum, o isolado nº 3, foi confirmada com base no sequenciamento do espaçador transcrito interno (ITS) (Figura 1I). A análise filogenética entre o isolado nº 3 e 20 isolados/cepas de referência mostrou alta similaridade (>99%) entre eles. Vale ressaltar que o isolado de S. sclerotiorum nº 3 (533 pb) apresenta alta similaridade com o isolado americano de S. sclerotiorum LPM36, isolado de sementes secas de ervilha (número de acesso GenBank MK896659.1; 540 pb), e com o isolado chinês de S. sclerotiorum YKY211 (número de acesso GenBank OR206374.1; 548 pb), causador da podridão violeta do caule (Matthiola incana), todos agrupados separadamente no topo do dendrograma (Figura 1I). A nova sequência foi depositada no banco de dados do NCBI e denominada “Sclerotinia sclerotiorum – isolado YN-25” (número de acesso GenBank PV202792). Observa-se que o isolado 3 é o mais invasivo; portanto, este isolado foi escolhido para estudo em todos os experimentos subsequentes.
A atividade antibacteriana da diamina L-ornitina (Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemanha) em diferentes concentrações (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) contra o isolado 3 de S. sclerotiorum foi investigada in vitro. É importante ressaltar que a L-ornitina exerceu um efeito antibacteriano e inibiu gradualmente o crescimento radial das hifas de S. sclerotiorum de maneira dose-dependente (Figura 2A, B). Na maior concentração testada (125 mg/L), a L-ornitina demonstrou a maior taxa de inibição do crescimento micelial (99,62 ± 0,27%; Figura 2B), equivalente à do fungicida comercial Rizolex-T (taxa de inibição de 99,45 ± 0,39%; Figura 2C) na maior concentração testada (10 mg/L), indicando eficácia similar.
Figura 2. Atividade antibacteriana in vitro da L-ornitina contra Sclerotinia sclerotiorum. (A) Comparação da atividade antibacteriana de diferentes concentrações de L-ornitina contra S. sclerotiorum com o fungicida comercial Rizolex-T (10 mg/L). (B, C) Taxa de inibição (%) do crescimento micelial de S. sclerotiorum após tratamento com diferentes concentrações de L-ornitina (12,5, 25, 50, 75, 100 e 125 mg/L) ou Rizolex-T (2, 4, 6, 8 e 10 mg/L), respectivamente. Os valores representam a média ± DP de cinco repetições biológicas (n = 5). Letras diferentes indicam diferenças estatísticas entre os tratamentos (p < 0,05). (D, E) Análise de regressão do modelo Probit para L-ornitina e o fungicida comercial Rizolex-T, respectivamente. A linha de regressão do modelo probit é mostrada como uma linha azul contínua, e o intervalo de confiança (95%) é mostrado como uma linha vermelha tracejada.
Além disso, foi realizada uma análise de regressão probit e os gráficos correspondentes são mostrados na Tabela 1 e nas Figuras 2D e 2E. Resumidamente, o valor aceitável da inclinação (y = 2,92x − 4,67) e as estatísticas significativas associadas (Cox & Snell R² = 0,3709, Nagelkerke R² = 0,4998 e p < 0,0001; Figura 2D) da L-ornitina indicaram uma atividade antifúngica aprimorada contra S. sclerotiorum em comparação com o fungicida comercial Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R² = 0,1242, Nagelkerke R² = 0,1708 e p < 0,0001) (Tabela 1).
Tabela 1. Valores de concentração inibitória de meia-máxima (IC50) e IC99 (mg/l) de L-ornitina e do fungicida comercial “Rizolex-T” contra S. sclerotiorum.
De modo geral, a L-ornitina (250 mg/L) reduziu significativamente o desenvolvimento e a severidade do mofo branco em plantas de feijão-comum tratadas, em comparação com plantas infectadas com S. sclerotiorum não tratadas (controle; Figura 3A). Resumidamente, embora a severidade da doença em plantas do grupo controle infectadas não tratadas tenha aumentado gradualmente (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 e 92,33 ± 3,06%), a L-ornitina reduziu significativamente a severidade da doença (%) ao longo do experimento (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 e 26,36 ± 3,07) aos 7, 14 e 21 dias após o tratamento (dpt), respectivamente (Figura 3A). De forma semelhante, quando plantas de feijão infectadas com S. sclerotiorum foram tratadas com 250 mg/L de L-ornitina, a área sob a curva de progressão da doença (AUDPC) diminuiu de 1274,33 ± 33,13 no controle não tratado para 281,03 ± 7,95, valor ligeiramente inferior ao do controle positivo com 50 mg/L do fungicida Rizolex-T (183,61 ± 7,71; Fig. 3B). A mesma tendência foi observada no segundo experimento.
Figura 3. Efeito da aplicação exógena de L-ornitina no desenvolvimento da podridão branca do feijão comum causada por Sclerotinia sclerotiorum em condições de casa de vegetação. (A) Curva de progressão da doença da podridão branca do feijão comum após tratamento com 250 mg/L de L-ornitina. (B) Área sob a curva de progressão da doença (AUDPC) da podridão branca do feijão comum após tratamento com L-ornitina. Os valores representam a média ± DP de cinco repetições biológicas (n = 5). Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas entre os tratamentos (p < 0,05).
A aplicação exógena de 250 mg/L de L-ornitina aumentou gradualmente a altura da planta (Fig. 4A), o número de ramos por planta (Fig. 4B) e o número de folhas por planta (Fig. 4C) após 42 dias. Embora o fungicida comercial Rizolex-T (50 mg/L) tenha apresentado o maior efeito sobre todos os parâmetros nutricionais estudados, a aplicação exógena de 250 mg/L de L-ornitina apresentou o segundo maior efeito em comparação com os controles não tratados (Figs. 4A–C). Por outro lado, o tratamento com L-ornitina não teve efeito significativo no teor dos pigmentos fotossintéticos clorofila a (Fig. 4D) e clorofila b (Fig. 4E), mas aumentou ligeiramente o teor total de carotenoides (0,56 ± 0,03 mg/g de peso fresco) em comparação com o controle negativo (0,44 ± 0,02 mg/g de peso fresco) e o controle positivo (0,46 ± 0,02 mg/g de peso fresco; Fig. 4F). No geral, esses resultados indicam que a L-ornitina não é fitotóxica para as leguminosas tratadas e pode até estimular seu crescimento.
Figura 4. Efeito da aplicação exógena de L-ornitina nas características de crescimento e pigmentos fotossintéticos de folhas de feijão infectadas com Sclerotinia sclerotiorum em condições de casa de vegetação. (A) Altura da planta (cm), (B) Número de ramos por planta, (C) Número de folhas por planta, (D) Teor de clorofila a (mg g-1 de peso fresco), (E) Teor de clorofila b (mg g-1 de peso fresco), (F) Teor total de carotenoides (mg g-1 de peso fresco). Os valores representam a média ± desvio padrão de cinco repetições biológicas (n = 5). Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas entre os tratamentos (p < 0,05).
A localização histoquímica in situ de espécies reativas de oxigênio (ROS; expressas como peróxido de hidrogênio [H2O2]) e radicais livres (expressos como ânions superóxido [O2•−]) revelou que a aplicação exógena de L-ornitina (250 mg/L) reduziu significativamente o acúmulo de H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 de peso fresco; Fig. 5A) e O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 de peso fresco; Fig. 5B) em comparação com o acúmulo tanto em plantas infectadas não tratadas (173,31 ± 12,06 e 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 de peso fresco, respectivamente) quanto em plantas tratadas com 50 mg/L do fungicida comercial Rizolex-T (170,12 ± 9,50 e 157,00 nmol.g−1 de peso fresco, respectivamente). ± 7,81 nmol.g−1 fr wt, respectivamente) em 72 h. Altos níveis de H2O2 e O2•− se acumularam sob alta pressão (Fig. 5A, B). Da mesma forma, o ensaio de malondialdeído (MDA) baseado em TCA mostrou que plantas de feijão infectadas com S. sclerotiorum acumularam níveis mais elevados de MDA (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) em suas folhas (Fig. 5C). No entanto, a aplicação exógena de L-ornitina reduziu significativamente a peroxidação lipídica, como evidenciado pela diminuição do teor de MDA nas plantas tratadas (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
Figura 5. Efeito da aplicação exógena de L-ornitina sobre os principais marcadores de estresse oxidativo e mecanismos de defesa antioxidante não enzimáticos em folhas de feijão infectadas com S. sclerotiorum 72 horas após a infecção em condições de casa de vegetação. (A) Peróxido de hidrogênio (H2O2; nmol g−1 FW) às 72 hpt, (B) ânion superóxido (O2•−; nmol g−1 FW) às 72 hpt, (C) malondialdeído (MDA; nmol g−1 FW) às 72 hpt, (D) fenóis solúveis totais (mg GAE g−1 FW) às 72 hpt, (E) flavonoides solúveis totais (mg RE g−1 FW) às 72 hpt, (F) aminoácidos livres totais (mg g−1 FW) às 72 hpt e (G) teor de prolina (mg g−1 FW) às 72 hpt. Os valores representam a média ± desvio padrão (média ± DP) de 5 réplicas biológicas (n = 5). Letras diferentes indicam diferenças estatisticamente significativas entre os tratamentos (p < 0,05).