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Nanopartículas (NPs) de insulina com alto teor de carga têm encontrado diversas aplicações em diferentes formas farmacêuticas. Este trabalho teve como objetivo avaliar o efeito dos processos de liofilização e secagem por atomização na estrutura de nanopartículas de quitosana carregadas com insulina, com ou sem manitol como crioprotetor. Também avaliamos a qualidade dessas nanopartículas por meio de sua redissolução. Antes da desidratação, o tamanho de partícula das nanopartículas reticuladas de quitosana/tripolifosfato de sódio/insulina foi otimizado para 318 nm, o índice de polidispersão (PDI) foi de 0,18, a eficiência de encapsulação foi de 99,4% e o teor de carga foi de 25,01%. Após a reconstituição, todas as nanopartículas, exceto aquelas produzidas pelo método de liofilização sem o uso de manitol, mantiveram sua estrutura esférica. Comparadas às nanopartículas contendo manitol e desidratadas por atomização, as nanopartículas secas por atomização sem manitol também apresentaram o menor tamanho médio de partícula (376 nm) e o maior teor de carga. (25,02%) com taxa de encapsulação semelhante (98,7%) e PDI (0,20) por técnicas de secagem ou liofilização. As nanopartículas secas por atomização sem manitol também resultaram na liberação mais rápida de insulina e na maior eficiência de absorção celular. Este trabalho demonstra que a secagem por atomização pode desidratar nanopartículas de insulina sem a necessidade de crioprotetores, em comparação com os métodos convencionais de liofilização, proporcionando maior capacidade de carga, menor necessidade de aditivos e custos operacionais significativamente menores.
Desde sua descoberta em 1922, a insulina e seus medicamentos têm salvado a vida de pacientes com diabetes tipo 1 (DM1) e diabetes tipo 2 (DM2). No entanto, devido às suas propriedades como uma proteína de alto peso molecular, a insulina se agrega facilmente, é degradada por enzimas proteolíticas e eliminada pelo efeito de primeira passagem. Pessoas diagnosticadas com diabetes tipo 1 precisam de injeções de insulina pelo resto da vida. Muitos pacientes inicialmente diagnosticados com diabetes tipo 2 também necessitam de injeções de insulina a longo prazo. As injeções diárias de insulina são uma fonte significativa de dor e desconforto diários para esses indivíduos, com efeitos negativos na saúde mental. Como resultado, outras formas de administração de insulina que causam menos desconforto, como a administração oral de insulina, estão sendo amplamente estudadas, pois têm o potencial de restaurar a qualidade de vida de aproximadamente 5 bilhões de pessoas com diabetes em todo o mundo.
A nanotecnologia proporcionou um avanço significativo nas tentativas de administração oral de insulina4,6,7, que encapsula e protege a insulina da degradação, permitindo sua liberação direcionada a locais específicos do corpo. No entanto, o uso de formulações de nanopartículas apresenta diversas limitações, principalmente devido a problemas de estabilidade das suspensões de partículas. Pode ocorrer agregação durante o armazenamento, o que reduz a biodisponibilidade das nanopartículas carregadas com insulina8. Além disso, a estabilidade química da matriz polimérica das nanopartículas e da insulina também deve ser considerada para garantir a estabilidade das nanopartículas (NPs) de insulina. Atualmente, a tecnologia de liofilização é o padrão ouro para a criação de NPs estáveis, prevenindo alterações indesejadas durante o armazenamento9.
No entanto, a liofilização requer a adição de crioprotetores para evitar que a estrutura esférica das nanopartículas seja afetada pelo estresse mecânico dos cristais de gelo. Isso reduz significativamente a quantidade de nanopartículas de insulina após a liofilização, uma vez que o crioprotetor ocupa a maior parte da massa. Portanto, as nanopartículas de insulina produzidas frequentemente se mostram inadequadas para a fabricação de formulações em pó seco, como comprimidos e filmes orais, devido à necessidade de grandes quantidades de nanopartículas secas para atingir a janela terapêutica da insulina.
A secagem por aspersão é um processo industrial bem conhecido e de baixo custo para a produção de pós secos a partir de fases líquidas na indústria farmacêutica^10,11. O controle sobre o processo de formação de partículas permite o encapsulamento adequado de diversos compostos bioativos^12,13. Além disso, tornou-se uma técnica eficaz para a preparação de proteínas encapsuladas para administração oral. Durante a secagem por aspersão, a água evapora muito rapidamente, o que ajuda a manter a temperatura do núcleo da partícula baixa^11,14, possibilitando sua aplicação no encapsulamento de componentes termossensíveis. Antes da secagem por aspersão, o material de revestimento deve ser homogeneizado completamente com a solução contendo os ingredientes a serem encapsulados^11,14. Ao contrário da liofilização, a homogeneização prévia ao encapsulamento na secagem por aspersão melhora a eficiência do encapsulamento durante a desidratação. Como o processo de encapsulamento por secagem por aspersão não requer crioprotetores, ele pode ser usado para produzir nanopartículas secas com alto teor de carga.
Este estudo relata a produção de nanopartículas (NPs) carregadas com insulina por meio da reticulação de quitosana e tripolifosfato de sódio utilizando o método de gelificação iônica. A gelificação iônica é um método de preparação que permite a produção de nanopartículas através de interações eletrostáticas entre duas ou mais espécies iônicas sob determinadas condições. As técnicas de liofilização e secagem por atomização foram utilizadas para desidratar as nanopartículas otimizadas de quitosana/tripolifosfato de sódio/insulina reticuladas. Após a desidratação, sua morfologia foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (MEV). Sua capacidade de recombinação foi avaliada pela medição da distribuição de tamanho, carga superficial, índice de polidispersão (PDI), eficiência de encapsulação e teor de insulina. A qualidade das nanopartículas resolubilizadas produzidas por diferentes métodos de desidratação também foi avaliada comparando-se sua proteção contra a insulina, comportamento de liberação e eficácia de internalização celular.
O pH da solução mista e a proporção de quitosana e insulina são dois fatores-chave que afetam o tamanho das partículas e a eficiência de encapsulação (EE) das nanopartículas (NPs) finais, pois influenciam diretamente o processo de gelificação ionotrópica. O pH da solução mista apresentou alta correlação com o tamanho das partículas e a eficiência de encapsulação (Fig. 1a). Como mostrado na Fig. 1a, com o aumento do pH de 4,0 para 6,0, o tamanho médio das partículas (nm) diminuiu e a EE aumentou significativamente, enquanto que, ao atingir o pH 6,5, o tamanho médio das partículas começou a aumentar e a EE permaneceu inalterada. À medida que a proporção de quitosana para insulina aumenta, o tamanho médio das partículas também aumenta. Além disso, nenhuma alteração na EE foi observada quando as nanopartículas foram preparadas com uma proporção mássica de quitosana/insulina superior a 2,5:1 (m/m) (Fig. 1b). Portanto, as condições ótimas de preparação neste estudo (pH 6,0, proporção mássica de quitosana/insulina de 2,5:1) foram utilizada para preparar nanopartículas carregadas com insulina para estudos posteriores. Nessas condições de preparação, o tamanho médio das nanopartículas de insulina foi otimizado para 318 nm (Fig. 1c), o índice de polidispersão (PDI) foi de 0,18, a eficiência de encapsulação foi de 99,4%, o potencial zeta foi de 9,8 mV e o carregamento de insulina foi de 25,01% (m/m). Com base nos resultados da microscopia eletrônica de transmissão (MET), as nanopartículas otimizadas apresentaram formato aproximadamente esférico e discreto, com tamanho relativamente uniforme (Fig. 1d).
Otimização de parâmetros de nanopartículas de insulina: (a) efeito do pH no diâmetro médio e na eficiência de encapsulação (EE) de nanopartículas de insulina (preparadas na proporção de massa de quitosana e insulina de 5:1); (b) influência da proporção de massa de quitosana e insulina no diâmetro médio e na eficiência de encapsulação (EE) de NPs de insulina (preparadas em pH 6); (c) distribuição do tamanho de partícula das nanopartículas de insulina otimizadas; (d) micrografia TEM das NPs de insulina otimizadas.
É sabido que a quitosana é um polieletrólito fraco com pKa de 6,5. Ela apresenta carga positiva em meio ácido, pois seu principal grupo amino é protonado por íons hidrogênio¹⁵. Portanto, é frequentemente utilizada como carreadora para encapsular macromoléculas com carga negativa. Neste estudo, a quitosana foi utilizada para encapsular insulina, cujo ponto isoelétrico é de 5,3. Como a quitosana é utilizada como material de revestimento, com o aumento de sua proporção, a espessura da camada externa das nanopartículas aumenta correspondentemente, resultando em um tamanho médio de partícula maior. Além disso, níveis mais elevados de quitosana permitem encapsular mais insulina. Em nosso caso, a eficiência de encapsulação (EE) foi máxima quando a proporção entre quitosana e insulina atingiu 2,5:1, e não houve alteração significativa na EE com o aumento contínuo dessa proporção.
Além da proporção de quitosana e insulina, o pH também desempenhou um papel crucial na preparação de NPs. Gan et al.¹⁷ estudaram o efeito do pH no tamanho das partículas de nanopartículas de quitosana. Eles observaram uma diminuição contínua no tamanho das partículas até que o pH atingisse 6,0, e um aumento significativo no tamanho das partículas foi observado em pH > 6,0, o que está de acordo com nossas observações. Esse fenômeno se deve ao fato de que, com o aumento do pH, a molécula de insulina adquire uma carga superficial negativa, favorecendo, assim, interações eletrostáticas com o complexo quitosana/tripolifosfato de sódio (TPP), resultando em tamanho de partícula pequeno e alta eficiência de encapsulação (EE). No entanto, quando o pH foi ajustado para 6,5, os grupos amino da quitosana foram desprotonados, resultando no dobramento da quitosana. Assim, um pH alto resulta em menor exposição dos íons amino ao TPP e à insulina, resultando em menor reticulação, maior tamanho médio final das partículas e menor EE.
A análise das propriedades morfológicas de nanopartículas (NPs) liofilizadas e secas por atomização pode orientar a seleção de melhores técnicas de desidratação e formação de pó. O método preferido deve proporcionar estabilidade do fármaco, formato uniforme das partículas, alta carga de fármaco e boa solubilidade na solução original. Neste estudo, para melhor comparar as duas técnicas, NPs de insulina com ou sem 1% de manitol foram utilizadas durante a desidratação. O manitol é usado como agente de volume ou crioprotetor em diversas formulações de pó seco para liofilização e secagem por atomização. Para as nanopartículas de insulina liofilizadas sem manitol, como mostrado na Figura 2a, observou-se uma estrutura de pó altamente porosa com superfícies grandes, irregulares e rugosas sob microscopia eletrônica de varredura (MEV). Poucas partículas discretas foram detectadas no pó após a desidratação (Figura 2e). Esses resultados indicaram que a maioria das NPs se decompôs durante a liofilização sem qualquer crioprotetor. Para as nanopartículas de insulina liofilizadas e secas por atomização contendo 1% de manitol, observaram-se nanopartículas esféricas com superfícies lisas. (Fig. 2b, d, f, h). As nanopartículas de insulina secas por atomização sem manitol permaneceram esféricas, mas com a superfície enrugada (Fig. 2c). As superfícies esféricas e enrugadas são discutidas mais detalhadamente nos testes de liberação e internalização celular abaixo. Com base na aparência visível das NPs secas, tanto as NPs secas por atomização sem manitol quanto as NPs liofilizadas e secas por atomização com manitol resultaram em pós finos de NPs (Fig. 2f, g, h). Quanto maior a área superficial entre as partículas, maior a solubilidade e, portanto, maior a taxa de liberação.
Morfologia de diferentes NPs de insulina desidratadas: (a) Imagem de MEV de NPs de insulina liofilizadas sem manitol; (b) Imagem de MEV de NPs de insulina liofilizadas com manitol; (c) Imagem de MEV de NPs de insulina secas por atomização sem manitol; (d) Imagem de MEV de NPs de insulina secas por atomização com manitol; (e) Imagem de NPs de insulina em pó liofilizadas sem manitol; (f) Imagem de NPs de insulina liofilizadas com manitol; (g) Imagem de NPs de insulina em pó secas por atomização sem manitol; (h) Imagem de NPs de insulina em pó secas por atomização com manitol.
Durante a liofilização, o manitol atua como crioprotetor, mantendo as NPs em forma amorfa e prevenindo danos causados ​​por cristais de gelo¹⁹. Em contraste, não há etapa de congelamento durante a secagem por atomização. Portanto, o manitol não é necessário neste método. De fato, as NPs secas por atomização sem manitol produziram NPs mais finas, como descrito anteriormente. No entanto, o manitol ainda pode atuar como um agente de preenchimento no processo de secagem por atomização para conferir às NPs uma estrutura mais esférica²⁰ (Fig. 2d), o que contribui para a obtenção de um comportamento de liberação uniforme dessas NPs encapsuladas. Além disso, é evidente que algumas partículas grandes podem ser detectadas tanto nas NPs de insulina liofilizadas quanto nas secas por atomização contendo manitol (Fig. 2b,d), o que pode ser devido ao acúmulo de manitol no núcleo da partícula juntamente com a insulina encapsulada. Para a camada de quitosana. Vale ressaltar que, neste estudo, para garantir que a estrutura esférica permaneça intacta após a desidratação, a proporção de manitol e quitosana foi mantida em 5:1, de modo que uma grande quantidade de carga também possa aumentar o tamanho das partículas das NPs secas.
A espectroscopia de reflectância total atenuada por transformada de Fourier no infravermelho (FTIR-ATR) caracterizou a mistura física de insulina livre, quitosana, quitosana, TPP e insulina. Todas as NPs desidratadas foram caracterizadas por espectroscopia FTIR-ATR. Notavelmente, intensidades de banda de 1641, 1543 e 1412 cm⁻¹ foram observadas em NPs encapsuladas liofilizadas com manitol e em NPs secas por atomização com e sem manitol (Fig. 3). Como relatado anteriormente, esses aumentos na intensidade foram associados à reticulação entre quitosana, TPP e insulina. A investigação da interação entre quitosana e insulina mostrou que, nos espectros FTIR de nanopartículas de quitosana carregadas com insulina, a banda da quitosana se sobrepôs à da insulina, aumentando a intensidade da carbonila (1641 cm⁻¹) e da banda da amina (1543 cm⁻¹). Os grupos tripolifosfato do TPP estão ligados a grupos amônio em quitosana, formando uma banda em 1412 cm-1.
Espectros FTIR-ATR de insulina livre, quitosana, misturas físicas de quitosana/TPP/insulina e NPs desidratadas por diferentes métodos.
Além disso, esses resultados são consistentes com os mostrados em MEV, que demonstraram que as NPs encapsuladas permaneceram intactas tanto quando pulverizadas quanto liofilizadas com manitol, mas, na ausência de manitol, apenas a secagem por pulverização produziu partículas encapsuladas. Em contraste, os resultados espectrais de FTIR-ATR das NPs liofilizadas sem manitol foram muito semelhantes à mistura física de quitosana, TPP e insulina. Esse resultado indica que as ligações cruzadas entre quitosana, TPP e insulina não estão mais presentes nas NPs liofilizadas sem manitol. A estrutura das NPs foi destruída durante a liofilização sem crioprotetor, o que pode ser observado nos resultados de MEV (Fig. 2a). Com base na morfologia e nos resultados de FTIR das NPs de insulina desidratadas, apenas as NPs liofilizadas, secas por pulverização e sem manitol foram utilizadas para os experimentos de reconstituição, sendo as NPs sem manitol descartadas devido à decomposição destas durante a desidratação. discutir.
A desidratação é utilizada para armazenamento a longo prazo e reprocessamento em outras formulações. A capacidade das nanopartículas secas de se reconstituírem após o armazenamento é crucial para sua utilização em diferentes formulações, como comprimidos e filmes. Observamos que o tamanho médio das partículas das nanopartículas de insulina secas por atomização, na ausência de manitol, aumentou apenas ligeiramente após a reconstituição. Por outro lado, o tamanho das partículas das nanopartículas de insulina secas por atomização e liofilizadas com manitol aumentou significativamente (Tabela 1). O índice de polidispersão (PDI) e a eficiência de encapsulação (EE) não sofreram alterações significativas (p > 0,05) após a recombinação de todas as nanopartículas neste estudo (Tabela 1). Esse resultado indica que a maioria das partículas permaneceu intacta após a redissolução. No entanto, a adição de manitol resultou em uma redução significativa da carga de insulina nas nanopartículas de manitol liofilizadas e secas por atomização (Tabela 1). Em contraste, o teor de insulina das nanopartículas secas por atomização sem manitol permaneceu o mesmo (Tabela 1).
É sabido que a carga de nanopartículas é crucial quando utilizadas para fins de administração de fármacos. Para NPs com baixas cargas, são necessárias quantidades muito grandes de material para atingir o limiar terapêutico. No entanto, a alta viscosidade de tais concentrações elevadas de NPs leva a inconvenientes e dificuldades na administração oral e em formulações injetáveis, respectivamente. Além disso, NPs de insulina também podem ser utilizadas para a fabricação de comprimidos e biofilmes viscosos, o que requer o uso de grandes quantidades de NPs em baixos níveis de carga, resultando em comprimidos grandes e biofilmes espessos que não são adequados para aplicações orais. Portanto, NPs desidratadas com alta carga de insulina são altamente desejáveis. Nossos resultados sugerem que a alta carga de insulina em NPs secas por atomização sem manitol pode oferecer muitas vantagens atraentes para esses métodos alternativos de administração.
Todas as NPs desidratadas foram mantidas em refrigerador por três meses. Os resultados de MEV mostraram que a morfologia de todas as NPs desidratadas não sofreu alterações significativas durante o período de armazenamento de três meses (Fig. 4). Após a reconstituição em água, todas as NPs apresentaram uma ligeira diminuição na EE e liberaram uma pequena quantidade (~5%) de insulina durante o período de armazenamento de três meses (Tabela 2). No entanto, o tamanho médio das partículas de todas as nanopartículas aumentou. O tamanho das partículas das NPs secas por atomização sem manitol aumentou para 525 nm, enquanto o das NPs secas por atomização e liofilizadas com manitol aumentou para 872 e 921 nm, respectivamente (Tabela 2).
Morfologia de diferentes NPs de insulina desidratadas armazenadas por três meses: (a) Imagem de MEV de NPs de insulina liofilizadas com manitol; (b) Imagem de MEV de nanopartículas de insulina secas por pulverização sem manitol; (c) Imagens de MEV de NPs de insulina secas por pulverização sem manitol.
Além disso, observou-se a formação de precipitados nas nanopartículas de insulina reconstituídas, secas por aspersão com manitol e liofilizadas (Fig. S2). Isso pode ser causado pela suspensão inadequada de partículas grandes na água. Todos os resultados acima demonstram que a técnica de secagem por aspersão pode proteger as nanopartículas de insulina da desidratação e que altas concentrações de nanopartículas de insulina podem ser obtidas sem o uso de cargas ou crioprotetores.
A retenção de insulina foi testada em meio com pH = 2,5 com pepsina, tripsina e α-quimotripsina para demonstrar a capacidade protetora das NPs contra a digestão enzimática após a desidratação. A retenção de insulina das NPs desidratadas foi comparada à das NPs recém-preparadas, e a insulina livre foi usada como controle negativo. Neste estudo, a insulina livre apresentou rápida eliminação em 4 horas em todos os três tratamentos enzimáticos (Fig. 5a–c). Em contraste, o teste de eliminação de insulina das NPs liofilizadas com manitol e das NPs secas por atomização com ou sem manitol mostrou uma proteção significativamente maior dessas NPs contra a digestão enzimática, semelhante à das NPs de insulina recém-preparadas (Figura 1). Com o auxílio das nanopartículas em pepsina, tripsina e α-quimotripsina, mais de 50%, 60% e 75% da insulina puderam ser protegidos em 4 horas, respectivamente (Fig. 5a–c). Essa capacidade de proteção contra a insulina pode aumentar a probabilidade de maior absorção de insulina na corrente sanguínea25. Esses resultados sugerem que a secagem por aspersão com ou sem manitol e a liofilização com manitol podem preservar a capacidade de proteção contra a insulina das NPs após a desidratação.
Comportamento de proteção e liberação de NPs de insulina desidratadas: (a) proteção da insulina em solução de pepsina; (b) proteção da insulina em solução de tripsina; (c) proteção da insulina por solução de α-quimotripsina; (d) comportamento de liberação de NPs desidratadas em solução com pH = 2,5; (e) comportamento de liberação de NPs desidratadas em solução com pH = 6,6; (f) comportamento de liberação de NPs desidratadas em solução com pH = 7,0.
Nanopartículas de insulina seca, recém-preparadas e reconstituídas, foram incubadas em diferentes soluções tampão (pH = 2,5, 6,6, 7,0) a 37 °C, simulando o ambiente de pH do estômago, duodeno e parte superior do intestino delgado, para examinar o efeito da insulina na resistência à insulina. Comportamento de liberação em diferentes ambientes. Fragmento do trato gastrointestinal. Em pH = 2,5, as NPs carregadas com insulina e as NPs de insulina seca ressuspendidas apresentaram uma liberação inicial rápida na primeira hora, seguida por uma liberação lenta ao longo das próximas 5 horas (Fig. 5d). Essa liberação rápida inicial provavelmente resulta da rápida dessorção superficial de moléculas de proteína que não estão totalmente imobilizadas na estrutura interna da partícula. Em pH = 6,5, as NPs carregadas com insulina e as NPs de insulina seca reconstituídas apresentaram uma liberação suave e lenta ao longo de 6 horas, visto que o pH da solução de teste era semelhante ao da solução de preparação das NPs (Fig. 5e). Em pH = 7, as NPs se mostraram instáveis ​​e se decompuseram quase completamente nas primeiras duas horas (Fig. 5f). Isso ocorre porque a desprotonação da quitosana acontece em pH mais alto, resultando em uma rede polimérica menos compacta e na liberação da insulina carregada.
Além disso, as NPs de insulina secas por pulverização sem manitol apresentaram um perfil de liberação mais rápido do que as outras NPs desidratadas (Fig. 5d–f). Como descrito anteriormente, as NPs de insulina reconstituídas secas sem manitol apresentaram o menor tamanho de partícula. Partículas pequenas proporcionam uma área de superfície maior, de modo que a maior parte do fármaco relevante estará na superfície da partícula ou próximo a ela, resultando em uma liberação rápida do fármaco26.
A citotoxicidade das NPs foi investigada pelo ensaio MTT. Como mostrado na Figura S4, todas as NPs desidratadas não apresentaram efeito significativo na viabilidade celular em concentrações de 50 a 500 μg/ml, sugerindo que todas as NPs desidratadas podem ser usadas com segurança para atingir a janela terapêutica.
O fígado é o principal órgão através do qual a insulina exerce suas funções fisiológicas. As células HepG2 são uma linhagem celular de hepatoma humano comumente usada como modelo in vitro de captação por hepatócitos. Neste estudo, células HepG2 foram utilizadas para avaliar a captação celular de nanopartículas (NPs) desidratadas por liofilização e secagem por atomização. A captação celular foi avaliada por microscopia confocal de varredura a laser (CLSM) utilizando citometria de fluxo e análise visual após várias horas de incubação com insulina FITC livre na concentração de 25 μg/mL, NPs carregadas com insulina FITC recém-preparadas e NPs carregadas com insulina FITC desidratadas em concentrações iguais de insulina. Observações quantitativas por CLSM foram realizadas. As NPs liofilizadas sem manitol foram destruídas durante a desidratação e não foram avaliadas neste teste. As intensidades de fluorescência intracelular das NPs carregadas com insulina recém-preparadas, das NPs liofilizadas com manitol e das NPs secas por atomização com e sem manitol (Fig. 6a) foram analisadas. 4,3, 2,6, 2,4 e 4,1 vezes maiores do que as insulinas livres, respectivamente (Fig. 6b). Esses resultados sugerem que a insulina encapsulada é mais potente na captação celular do que a insulina livre, principalmente devido ao menor tamanho das nanopartículas carregadas com insulina produzidas no estudo.
Captação de células HepG2 após 4 h de incubação com NPs recém-preparadas e NPs desidratadas: (a) Distribuição da captação de insulina-FITC pelas células HepG2. (b) Média geométrica das intensidades de fluorescência analisadas por citometria de fluxo (n = 3), *P < 0,05 em comparação com a insulina livre.
Da mesma forma, as imagens de CLSM mostraram que as intensidades de fluorescência do FITC das NPs carregadas com insulina-FITC recém-preparadas e das NPs carregadas com insulina-FITC obtidas por secagem por atomização (sem manitol) foram muito maiores do que as das outras amostras (Fig. 6a). Além disso, com a adição de manitol, a maior viscosidade da solução aumentou a resistência à absorção celular, resultando em menor proliferação de insulina. Esses resultados sugerem que as NPs obtidas por secagem por atomização sem manitol apresentaram a maior eficiência de absorção celular, pois seu tamanho de partícula era menor do que o das NPs liofilizadas após a redissolução.
A quitosana (peso molecular médio de 100 kDa, 75–85% desacetilada) foi adquirida da Sigma-Aldrich (Oakville, Ontário, Canadá). O tripolifosfato de sódio (TPP) foi adquirido da VWR (Radnor, Pensilvânia, EUA). A insulina humana recombinante utilizada neste estudo foi obtida da Fisher Scientific (Waltham, MA, EUA). A insulina humana marcada com isotiocianato de fluoresceína (FITC) e o dicloridrato de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (Oakville, Ontário, Canadá). A linhagem celular HepG2 foi obtida da ATCC (Manassas, Virgínia, EUA). Todos os outros reagentes eram de grau analítico ou cromatográfico.
Prepare uma solução de CS a 1 mg/mL dissolvendo-a em água bidestilada (água DD) contendo 0,1% de ácido acético. Prepare soluções de TPP e insulina a 1 mg/mL dissolvendo-as em água DD e ácido acético a 0,1%, respectivamente. A pré-emulsão foi preparada com um homogeneizador de alta velocidade Polytron PCU-2-110 (Brinkmann Ind., Westbury, NY, EUA). O processo de preparação é o seguinte: primeiramente, 2 mL da solução de TPP são adicionados a 4 mL da solução de insulina, e a mistura é agitada por 30 minutos até completa homogeneização. Em seguida, a solução resultante é adicionada gota a gota à solução de CS através de uma seringa sob agitação em alta velocidade (10.000 rpm). As misturas são mantidas sob agitação em alta velocidade (15.000 rpm) em banho de gelo por 30 minutos e o pH é ajustado para obter nanopartículas de insulina reticuladas. Para homogeneizar ainda mais e reduzir o tamanho das partículas de insulina, elas são A amostra foi sonicada por mais 30 minutos em banho de gelo usando um sonicador tipo sonda (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltow, Alemanha).
As nanopartículas de insulina (NPs) foram analisadas quanto ao diâmetro médio (Z-average), índice de polidispersão (PDI) e potencial zeta por meio de espalhamento dinâmico de luz (DLS) utilizando um Litesizer 500 (Anton Paar, Graz, Áustria), após diluição em água deionizada a 25 °C. A morfologia e a distribuição de tamanho foram caracterizadas por microscopia eletrônica de transmissão (MET) em um microscópio Hitachi H7600 (Hitachi, Tóquio, Japão), e as imagens foram posteriormente analisadas utilizando o software de imagem Hitachi (Hitachi, Tóquio, Japão). Para avaliar a eficiência de encapsulação (EE) e a capacidade de carga (CC) das NPs de insulina, as NPs foram pipetadas em tubos de ultrafiltração com um limite de exclusão molecular de 100 kDa e centrifugadas a 500 xg por 30 min. A insulina não encapsulada no filtrado foi quantificada utilizando um sistema HPLC Agilent Série 1100 (Agilent, Santa Clara, Califórnia, EUA) composto por uma bomba quaternária, amostrador automático e coluna. aquecedor e detector DAD. A insulina foi analisada por uma coluna C18 (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, EUA) e detectada a 214 nm. A fase móvel era acetonitrila e água, contendo 0,1% de TFA, com gradiente de 10/90 a 100/0, e a corrida durou 10 minutos. A fase móvel foi bombeada a uma vazão de 1,0 ml/min. A temperatura da coluna foi ajustada para 20 °C. Calcule as porcentagens de EE e LC usando as equações (1) e (2).
Diversas proporções de CS/insulina, variando de 2,0 a 4,0, foram testadas para otimizar as nanopartículas de insulina. Diferentes quantidades de solução de CS foram adicionadas durante o preparo, enquanto a mistura de insulina/TPP foi mantida constante. As nanopartículas de insulina foram preparadas na faixa de pH de 4,0 a 6,5, controlando-se cuidadosamente o pH da mistura após a adição de todas as soluções (insulina, TPP e CS). A eficiência de encapsulação (EE) e o tamanho das partículas das nanopartículas de insulina foram avaliados em diferentes valores de pH e proporções de massa de CS/insulina para otimizar a formação das nanopartículas de insulina.
As nanopartículas de insulina otimizadas foram colocadas em um recipiente de alumínio e cobertas com papel absorvente, fixado com fita adesiva. Em seguida, os recipientes foram colocados em um liofilizador Labconco FreeZone (Labconco, Kansas City, MO, EUA) equipado com uma bandeja de secagem. A temperatura e a pressão de vácuo foram ajustadas para -10 °C e 0,350 Torr durante as primeiras 2 horas, e para 0 °C e 0,120 Torr durante as 22 horas restantes das 24 horas, para obter as nanopartículas de insulina secas.
O secador por pulverização Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Suíça) foi utilizado para gerar insulina encapsulada. Os parâmetros de secagem selecionados foram: temperatura de 100 °C, vazão de alimentação de 3 L/min e vazão de gás de 4 L/min.
As nanopartículas de insulina, antes e depois da desidratação, foram caracterizadas por espectroscopia FTIR-ATR. As nanopartículas desidratadas, bem como a insulina livre e a quitosana, foram analisadas utilizando um espectrofotômetro FTIR Spectrum 100 (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, EUA) equipado com um acessório universal de amostragem ATR (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, EUA). As médias dos sinais foram obtidas a partir de 16 varreduras com resolução de 4 cm⁻² na faixa de frequência de 4000-600 cm⁻².
A morfologia das nanopartículas de insulina secas foi avaliada por meio de imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de nanopartículas de insulina liofilizadas e secas por atomização, obtidas com um microscópio eletrônico de varredura com feixe de íons focalizado (FIB-SEM) Helios NanoLab 650 (FEI, Hillsboro, Oregon, EUA). Os principais parâmetros utilizados foram tensão de 5 keV e corrente de 30 mA.
Todas as nanopartículas de insulina desidratadas foram redissolvidas em água destilada. O tamanho das partículas, o índice de polidispersão (PDI), a eficiência de encapsulação (EE) e a capacidade de carga (LC) foram testados novamente usando o mesmo método mencionado anteriormente para avaliar sua qualidade após a desidratação. A estabilidade das nanopartículas de anidroinsulina também foi medida testando as propriedades das nanopartículas após armazenamento prolongado. Neste estudo, todas as nanopartículas, após a desidratação, foram armazenadas em refrigerador por três meses. Após três meses de armazenamento, as nanopartículas foram testadas quanto ao tamanho morfológico das partículas, PDI, EE e LC.
Dissolva 5 mL de NPs reconstituídas em 45 mL contendo fluido gástrico simulado (pH 1,2, contendo 1% de pepsina), fluido intestinal (pH 6,8, contendo 1% de tripsina) ou solução de quimotripsina (100 g/mL, em tampão fosfato, pH 7,8) para avaliar a eficácia da insulina na proteção das NPs após a desidratação. As soluções foram incubadas a 37 °C com agitação a 100 rpm. Alíquotas de 500 μL da solução foram coletadas em diferentes intervalos de tempo e a concentração de insulina foi determinada por HPLC.
O comportamento de liberação in vitro de nanopartículas (NPs) de insulina recém-preparadas e desidratadas foi testado pelo método da bolsa de diálise (corte de peso molecular de 100 kDa, Spectra Por Inc.). NPs secas, recém-preparadas e reconstituídas, foram dialisadas em fluidos com pH 2,5, pH 6,6 e pH 7,0 (solução salina tamponada com fosfato 0,1 M, PBS) para simular o ambiente de pH do estômago, duodeno e intestino delgado superior, respectivamente. Todas as amostras foram incubadas a 37 °C com agitação contínua a 200 rpm. O fluido da bolsa de diálise de 5 mL foi aspirado nos seguintes tempos: 0,5, 1, 2, 3, 4 e 6 h, e o volume foi imediatamente reposto com dialisato fresco. A contaminação por insulina no fluido foi analisada por HPLC, e a taxa de liberação de insulina das nanopartículas foi calculada a partir da razão entre a insulina livre liberada e a insulina total encapsulada nas nanopartículas (Equação 3).
As células da linhagem de carcinoma hepatocelular humano HepG2 foram cultivadas em placas de 60 mm de diâmetro utilizando meio de cultura DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) contendo 10% de soro fetal bovino, 100 UI/mL de penicilina e 100 μg/mL de estreptomicina. As culturas foram mantidas a 37 °C, 95% de umidade relativa e 5% de CO2. Para os ensaios de internalização, as células HepG2 foram semeadas a uma densidade de 1 × 10⁵ células/mL em um sistema de lâminas de câmara Nunc Lab-Tek de 8 poços (Thermo Fisher, NY, EUA). Para os ensaios de citotoxicidade, as células foram semeadas em placas de 96 poços (Corning, NY, EUA) a uma densidade de 5 × 10⁴ células/mL.
O ensaio MTT foi utilizado para avaliar a citotoxicidade de nanopartículas de insulina (NPs) recém-preparadas e desidratadas. Células HepG2 foram semeadas em placas de 96 poços na densidade de 5 × 10⁴ células/mL e cultivadas por 7 dias antes do teste. As NPs de insulina foram diluídas em diversas concentrações (50 a 500 μg/mL) em meio de cultura e, em seguida, administradas às células. Após 24 horas de incubação, as células foram lavadas 3 vezes com PBS e incubadas com meio contendo 0,5 mg/mL de MTT por mais 4 horas. A citotoxicidade foi avaliada pela medição da redução enzimática do tetrazólio amarelo MTT a formazan púrpura a 570 nm, utilizando um leitor de placas de espectrofotômetro Tecan Infinite M200 Pro (Tecan, Männedorf, Suíça).
A eficiência de internalização celular das NPs foi testada por microscopia confocal de varredura a laser e análise por citometria de fluxo. Cada poço do sistema de lâminas de câmara Nunc Lab-Tek foi tratado com insulina-FITC livre, NPs carregadas com insulina-FITC e 25 μg/mL de NPs de insulina-FITC desidratadas reconstituídas, na mesma concentração, e incubado por 4 horas. As células foram lavadas 3 vezes com PBS e fixadas com paraformaldeído a 4%. Os núcleos foram corados com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). A localização da insulina foi observada usando um microscópio confocal de varredura a laser/dois fótons Olympus FV1000 (Olympus, Shinjuku City, Tóquio, Japão). Para a análise por citometria de fluxo, foram utilizadas as mesmas concentrações de 10 μg/mL de insulina-FITC livre, NPs carregadas com insulina-FITC e NPs de insulina-FITC desidratadas reconstituídas. Nanopartículas de insulina marcadas com FITC desidratadas foram adicionadas a placas de 96 poços contendo células HepG2 e incubadas por 4 horas. Após 4 horas de incubação, as células foram removidas e lavadas 3 vezes com FBS. 5 × 10⁴ células por amostra foram analisadas por um citômetro de fluxo BD LSR II (BD, Franklin Lakes, Nova Jersey, Estados Unidos).
Todos os valores são expressos como média ± desvio padrão. As comparações entre todos os grupos foram avaliadas usando ANOVA de uma via ou teste t pelo IBM SPSS Statistics 26 para Mac (IBM, Endicott, Nova York, EUA) e p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.
Este estudo demonstra a flexibilidade e a capacidade da secagem por aspersão para desidratar nanopartículas de quitosana/TPP/insulina reticuladas, com melhor reconstituição em comparação aos métodos padrão de liofilização que utilizam agentes de volume ou crioprotetores, além de maior capacidade de encapsulação. As nanopartículas de insulina otimizadas apresentaram um tamanho médio de partícula de 318 nm e uma eficiência de encapsulação de 99,4%. Os resultados de MEV e FTIR após a desidratação mostraram que a estrutura esférica foi mantida apenas nas NPs secas por aspersão com e sem manitol e nas liofilizadas com manitol, enquanto as NPs liofilizadas sem manitol se decompuseram durante a desidratação. No teste de capacidade de reconstituição, as nanopartículas de insulina secas por aspersão sem manitol apresentaram o menor tamanho médio de partícula e a maior capacidade de encapsulação após a reconstituição. Os perfis de liberação de todas essas NPs desidratadas mostraram que elas foram liberadas rapidamente em soluções com pH = 2,5 e pH = 7, e apresentaram grande estabilidade em solução com pH = 6,5. Em comparação com outras NPs desidratadas e redissolvidas, as NPs de insulina apresentaram melhor desempenho em termos de tamanho médio de partícula e maior capacidade de encapsulação. As nanopartículas (NPs) secas por atomização sem manitol apresentaram a liberação mais rápida. Esse resultado é consistente com o observado no ensaio de internalização celular, visto que as NPs secas por atomização na ausência de manitol mantiveram quase que completamente a eficiência de internalização celular das NPs recém-preparadas. Esses resultados sugerem que as nanopartículas de insulina secas, preparadas por atomização sem manitol, são as mais adequadas para posterior processamento em outras formas farmacêuticas anidras, como comprimidos orais ou filmes bioadesivos.
Devido a questões de propriedade intelectual, os conjuntos de dados gerados e/ou analisados ​​durante o presente estudo não estão disponíveis publicamente, mas podem ser obtidos junto aos respectivos autores mediante solicitação razoável.
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