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O ácido propiônico (PPA) é utilizado para estudar o papel da disfunção mitocondrial em distúrbios do neurodesenvolvimento, como o transtorno do espectro autista. Sabe-se que o PPA interfere na biogênese, no metabolismo e na renovação mitocondrial. No entanto, os efeitos do PPA na dinâmica mitocondrial, na fissão e na fusão permanecem problemáticos devido à complexa natureza temporal desses mecanismos. Neste estudo, utilizamos técnicas complementares de imagem quantitativa para investigar como o PPA afeta a ultraestrutura, a morfologia e a dinâmica mitocondrial em células SH-SY5Y, semelhantes a neurônios. O PPA (5 mM) causou uma diminuição significativa na área mitocondrial (p < 0,01), no diâmetro e na circunferência de Feret (p < 0,05) e na área 2 (p < 0,01). A análise do localizador de eventos mitocondriais mostrou um aumento significativo (p < 0,05) nos eventos de fissão e fusão, mantendo assim a integridade da rede mitocondrial sob condições de estresse. Além disso, a expressão de mRNA de cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) e OPA1 (p < 0,05) foi significativamente reduzida. Isso ilustra a remodelação da morfologia, biogênese e dinâmica mitocondrial para manter a função sob condições de estresse. Nossos dados fornecem novas informações sobre os efeitos do PPA na dinâmica mitocondrial e destacam a utilidade das técnicas de imagem para o estudo dos complexos mecanismos regulatórios envolvidos nas respostas ao estresse mitocondrial.
As mitocôndrias são participantes integrais em uma variedade de funções celulares além de seus papéis típicos na produção de energia e biossíntese. O metabolismo mitocondrial é um regulador chave da sinalização de cálcio, homeostase metabólica e redox, sinalização inflamatória, modificações epigenéticas, proliferação celular, diferenciação e morte celular programada¹. Em particular, o metabolismo mitocondrial é crítico para o desenvolvimento, sobrevivência e função neuronal e está amplamente implicado em várias manifestações de neuropatologia²,³,⁴.
Na última década, o estado metabólico emergiu como um regulador central da neurogênese, diferenciação, maturação e plasticidade5,6. Recentemente, a morfologia e a dinâmica mitocondrial tornaram-se componentes particularmente importantes da mitose, um processo dinâmico que mantém um conjunto de mitocôndrias saudáveis ​​dentro das células. A dinâmica mitocondrial é regulada por vias complexas e interdependentes, que vão desde a biogênese e bioenergética mitocondrial até a fissão, fusão, transporte e eliminação mitocondrial7,8. A disrupção de qualquer um desses mecanismos integrativos prejudica a manutenção de redes mitocondriais saudáveis ​​e tem profundas consequências funcionais para o neurodesenvolvimento9,10. De fato, a desregulação da dinâmica mitocondrial é observada em muitos transtornos psiquiátricos, neurodegenerativos e do neurodesenvolvimento, incluindo os transtornos do espectro autista (TEA)11,12.
O TEA (Transtorno do Espectro Autista) é um distúrbio do neurodesenvolvimento heterogêneo com uma arquitetura genética e epigenética complexa. A hereditariedade do TEA é indiscutível, mas a etiologia molecular subjacente permanece pouco compreendida. Dados acumulados de modelos pré-clínicos, estudos clínicos e conjuntos de dados moleculares multiômicos fornecem evidências crescentes de disfunção mitocondrial no TEA^13,14. Anteriormente, realizamos uma triagem de metilação de DNA em todo o genoma em uma coorte de pacientes com TEA e identificamos genes diferencialmente metilados agrupados ao longo de vias metabólicas mitocondriais¹⁵. Posteriormente, relatamos a metilação diferencial de reguladores centrais da biogênese e dinâmica mitocondrial, que foi associada ao aumento do número de cópias de mtDNA e à alteração do perfil metabólico urinário no TEA¹⁶. Nossos dados fornecem evidências crescentes de que a dinâmica e a homeostase mitocondriais desempenham um papel central na fisiopatologia do TEA. Portanto, aprimorar a compreensão mecanística da relação entre a dinâmica, a morfologia e a função mitocondrial é um objetivo fundamental da pesquisa em andamento sobre doenças neurológicas caracterizadas por disfunção mitocondrial secundária.
Técnicas moleculares são frequentemente utilizadas para estudar o papel de genes específicos nas respostas ao estresse mitocondrial. No entanto, essa abordagem pode ser limitada pela natureza multifacetada e temporal dos mecanismos de controle mitótico. Além disso, a expressão diferencial de genes mitocondriais é um indicador indireto de alterações funcionais, especialmente porque apenas um número limitado de genes é normalmente analisado. Portanto, métodos mais diretos para o estudo da função e bioenergética mitocondrial têm sido propostos¹⁷. A morfologia mitocondrial está intimamente relacionada à dinâmica mitocondrial. A forma, a conectividade e a estrutura mitocondrial são cruciais para a produção de energia e para a sobrevivência mitocondrial e celular^5,18. Além disso, os vários componentes da mitose focam em alterações na morfologia mitocondrial, que podem servir como parâmetros úteis para avaliar a disfunção mitocondrial e fornecer uma base para estudos mecanísticos subsequentes.
A morfologia mitocondrial pode ser observada diretamente por meio de microscopia eletrônica de transmissão (MET), permitindo o estudo detalhado da ultraestrutura celular. A MET visualiza diretamente a morfologia, a forma e a estrutura das cristas mitocondriais na resolução de mitocôndrias individuais, em vez de depender exclusivamente da transcrição gênica, da expressão proteica ou de parâmetros funcionais mitocondriais em populações celulares^17,19,20. Além disso, a MET facilita o estudo das interações entre as mitocôndrias e outras organelas, como o retículo endoplasmático e os autofagossomos, que desempenham papéis fundamentais na função e homeostase mitocondrial^21,22. Assim, a MET se torna um bom ponto de partida para o estudo da disfunção mitocondrial antes de se concentrar em vias ou genes específicos. À medida que a função mitocondrial se torna cada vez mais relevante para a neuropatologia, torna-se evidente a necessidade de estudar direta e quantitativamente a morfologia e a dinâmica mitocondrial em modelos neuronais in vitro.
Neste artigo, examinamos a dinâmica mitocondrial em um modelo neuronal de disfunção mitocondrial no transtorno do espectro autista (TEA). Anteriormente, relatamos a metilação diferencial da propionil-CoA carboxilase beta (PCCB) no TEA15, uma subunidade da enzima propionil-CoA carboxilase mitocondrial PCC. Sabe-se que a desregulação da PCC causa acúmulo tóxico de derivados propionílicos, incluindo o ácido propiônico (PPA)23,24,25. O PPA demonstrou perturbar o metabolismo neuronal e alterar o comportamento in vivo, sendo um modelo animal estabelecido para o estudo de mecanismos de neurodesenvolvimento envolvidos no TEA26,27,28. Além disso, o PPA demonstrou perturbar o potencial de membrana mitocondrial, a biogênese e a respiração in vitro, sendo amplamente utilizado para modelar a disfunção mitocondrial em neurônios29,30. No entanto, o impacto da disfunção mitocondrial induzida por PPA na morfologia e dinâmica mitocondrial permanece pouco compreendido.
Este estudo utiliza técnicas de imagem complementares para quantificar os efeitos do PPA na morfologia, dinâmica e função mitocondrial em células SH-SY5Y. Primeiramente, desenvolvemos um método de microscopia eletrônica de transmissão (MET) para visualizar alterações na morfologia e ultraestrutura mitocondrial^17,31,32. Dada a natureza dinâmica das mitocôndrias³³, também utilizamos a análise do localizador de eventos mitocondriais (MEL) para quantificar as alterações no equilíbrio entre eventos de fissão e fusão, número e volume mitocondrial sob estresse de PPA. Finalmente, examinamos se a morfologia e a dinâmica mitocondrial estão associadas a alterações na expressão de genes envolvidos na biogênese, fissão e fusão. Em conjunto, nossos dados ilustram o desafio de elucidar a complexidade dos mecanismos que regulam a dinâmica mitocondrial. Destacamos a utilidade da MET no estudo da morfologia mitocondrial como um parâmetro convergente mensurável da mitose em células SH-SY5Y. Além disso, destacamos que os dados de TEM fornecem as informações mais completas quando combinados com técnicas de imagem que também capturam eventos dinâmicos em resposta ao estresse metabólico. Uma caracterização mais aprofundada dos mecanismos regulatórios moleculares que sustentam a mitose das células neuronais pode fornecer informações importantes sobre o componente mitocondrial do sistema nervoso e das doenças neurodegenerativas.
Para induzir estresse mitocondrial, células SH-SY5Y foram tratadas com PPA utilizando propionato de sódio (NaP) nas concentrações de 3 mM e 5 mM. Antes da microscopia eletrônica de transmissão (MET), as amostras foram submetidas a criopreservação por congelamento de alta pressão (Figura 1a). Desenvolvemos um método automatizado de análise de imagens mitocondriais para medir oito parâmetros morfológicos das populações mitocondriais em três réplicas biológicas. Observamos que o tratamento com PPA alterou significativamente quatro parâmetros: área 2, área, perímetro e diâmetro de Feret (Figuras 1b–e). A área 2 diminuiu significativamente com o tratamento com PPA nas concentrações de 3 mM e 5 mM (p = 0,0183 e p = 0,002, respectivamente) (Figura 1b), enquanto a área (p = 0,003), o perímetro (p = 0,0106) e o diâmetro de Feret também diminuíram significativamente. Houve uma redução significativa (p = 0,0172) no grupo tratado com 5 mM em comparação com o grupo controle (Fig. 1c–e). Reduções significativas na área e na circunferência mostraram que as células tratadas com 5 mM de PPA apresentavam mitocôndrias menores e mais arredondadas, e que essas mitocôndrias eram menos alongadas do que as das células controle. Isso também é consistente com uma diminuição significativa no diâmetro de Feret, um parâmetro independente que indica uma redução na maior distância entre as bordas das partículas. Alterações na ultraestrutura das cristas foram observadas: as cristas tornaram-se menos pronunciadas sob a influência do estresse induzido por PPA (Fig. 1a, painel B). No entanto, nem todas as imagens refletiram claramente a ultraestrutura das cristas, portanto, uma análise quantitativa dessas alterações não foi realizada. Esses dados de MET podem refletir três cenários possíveis: (1) o PPA aumenta a fissão ou inibe a fusão, fazendo com que as mitocôndrias existentes diminuam de tamanho; (2) o aumento da biogênese cria novas mitocôndrias menores; ou (3) induz ambos os mecanismos simultaneamente. Embora essas condições não possam ser distinguidas por TEM, alterações morfológicas significativas indicam mudanças na homeostase e dinâmica mitocondrial sob estresse de PPA. Posteriormente, exploramos parâmetros adicionais para caracterizar melhor essa dinâmica e os mecanismos potenciais subjacentes.
O ácido propiônico (PPA) remodela a morfologia mitocondrial. (a) Imagens representativas de microscopia eletrônica de transmissão (MET) mostrando que o tamanho das mitocôndrias diminui e elas se tornam menores e mais arredondadas com o aumento do tratamento com PPA; 0 mM (não tratado), 3 mM e 5 mM, respectivamente. As setas vermelhas indicam as mitocôndrias. (b–e) Células SH-SY5Y tratadas com PPA por 24 h foram preparadas para MET e os resultados foram analisados ​​usando Fiji/ImageJ. Quatro dos oito parâmetros mostraram diferenças significativas entre as células controle (não tratadas, 0 mM PPA) e as tratadas (3 mM e 5 mM PPA). (b) Região 2, (c) Área, (d) Perímetro, (e) Diâmetro de Feret. A análise de variância de uma via (controle vs. tratamento) e o teste de comparações múltiplas de Dunnett foram usados ​​para determinar diferenças significativas (p < 0,05). Os pontos de dados representam o valor mitocondrial médio para cada célula individual, e as barras de erro representam a média ± erro padrão da média (EPM). Os dados apresentados representam n = 3, com pelo menos 24 células por réplica; um total de 266 imagens foram analisadas; * indica p < 0,05, ** indica p < 0,01.
Para caracterizar melhor como a dinâmica mitocondrial responde ao PPA, coramos as mitocôndrias com éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE) e usamos microscopia de lapso de tempo e análise MEL para localizar e quantificar as mitocôndrias após 24 horas em concentrações de 3 e 5 mM de PPA. Tratamento de eventos de fissão e fusão (Fig. 2a). Após a análise MEL, as mitocôndrias foram analisadas para quantificar o número de estruturas mitocondriais e seu volume médio. Observamos um pequeno, porém significativo, aumento no número de eventos de fissão ocorrendo a 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)] em comparação com a fissão [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] e a fusão [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] e a fusão [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] 0,05)] <0,05)] foram significativamente aumentadas a 5 mM em comparação com o controle (Fig. 3b). O número de mitocôndrias aumentou significativamente tanto a 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)] quanto a 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (Fig. 3c), enquanto o volume médio de cada estrutura mitocondrial permaneceu inalterado (Fig. 3c). 3d). Em conjunto, isso sugere que a remodelação da dinâmica mitocondrial serve como uma resposta compensatória que mantém com sucesso a integridade da rede mitocondrial. O aumento no número de eventos de fissão a 3 mM de PPA sugere que o aumento no número de mitocôndrias se deve em parte à fissão mitocondrial, mas, considerando que o volume mitocondrial médio permanece essencialmente inalterado, a biogênese não pode ser descartada como uma resposta compensatória adicional. No entanto, esses dados são consistentes com as estruturas mitocondriais menores e arredondadas observadas por MET e também demonstram alterações significativas na dinâmica mitocondrial induzidas pelo PPA.
O ácido propiônico (PPA) induz a remodelação mitocondrial dinâmica para manter a integridade da rede. Células SH-SY5Y foram cultivadas, tratadas com 3 e 5 mM de PPA por 24 horas e coradas com TMRE e Hoechst 33342, seguido de análise MEL. (a) Imagens representativas de microscopia time-lapse mostrando projeções de intensidade máxima em cores e binarizadas no tempo 2 (t2) para cada condição. Regiões selecionadas indicadas em cada imagem binária são ampliadas e exibidas em 3D em três diferentes intervalos de tempo (t1-t3) para ilustrar a dinâmica ao longo do tempo; eventos de fusão são destacados em verde; eventos de fissão são destacados em vermelho. (b) Número médio de eventos dinâmicos por condição. (c) Número médio de estruturas mitocondriais por célula. (d) Volume médio (µm³) de cada estrutura mitocondrial por célula. Os dados apresentados são representativos de n = 15 células por grupo de tratamento. As barras de erro apresentadas representam a média ± erro padrão da média (SEM), barra de escala = 10 μm, * p < 0,05.
O ácido propiônico (PPA) causa supressão transcricional de genes associados à dinâmica mitocondrial. Células SH-SY5Y foram tratadas com 3 e 5 mM de PPA por 24 h. A quantificação relativa dos genes foi realizada por RT-qPCR e normalizada para B2M. Genes de biogênese mitocondrial: (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 e (d) NFE2L2. Genes de fusão e fissão mitocondrial: (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 e (i) DRP1. Diferenças significativas (p < 0,05) foram testadas por ANOVA de uma via (controle vs. tratamento) e teste de comparações múltiplas de Dunnett: * indica p < 0,05, ** indica p < 0,01 e **** indica p < 0,0001. As barras representam a expressão média ± erro padrão da média (EPM). Os dados apresentados representam n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) e n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) réplicas biológicas.
Dados de análises TEM e MEL indicam que o PPA altera a morfologia e a dinâmica mitocondrial. No entanto, essas técnicas de imagem não fornecem informações sobre os mecanismos subjacentes que impulsionam esses processos. Portanto, examinamos a expressão de mRNA de nove reguladores-chave da dinâmica mitocondrial, biogênese e mitose em resposta ao tratamento com PPA. Quantificamos o oncogene do mieloma celular (cMYC), o fator respiratório nuclear (NRF1), o fator de transcrição mitocondrial 1 (TFAM), o fator de transcrição semelhante a NFE2 BZIP (NFE2L2), a proteína semelhante à gastrina 2 (STOML2), a proteína 1 da atrofia do nervo óptico (OPA1), a mitofusina 1 (MFN1), a mitofusina 2 (MFN2) e a proteína 1 relacionada à dinamina (DRP1) após 24 horas de tratamento com 3 mM e 5 mM de PPA. Observamos alterações no tratamento com PPA em concentrações de 3 mM (p = 0,0053, p = 0,0415 e p < 0,0001, respectivamente) e 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233 e p < 0,0001, respectivamente) (Fig. 3a–c). A diminuição na expressão de mRNA foi dose-dependente: a expressão de cMYC, NRF1 e TFAM diminuiu 5,7, 2,6 e 1,9 vezes em 3 mM, respectivamente, e 11,2, 3 e 2,2 vezes em 5 mM. Em contraste, o gene central da biogênese redox, NFE2L2, não foi alterado em nenhuma concentração de PPA, embora uma tendência semelhante de diminuição da expressão, dependente da dose, tenha sido observada (Fig. 3d).
Também examinamos a expressão de genes clássicos envolvidos na regulação da fissão e fusão. Acredita-se que o STOML2 esteja envolvido na fusão, mitofagia e biogênese, e sua expressão foi significativamente reduzida (p < 0,0001) por 3 mM (redução de 2,4 vezes) e 5 mM (redução de 2,8 vezes) de PPA (Fig. 1). 3d). Da mesma forma, a expressão do gene de fusão OPA1 diminuiu em 3 mM (redução de 1,6 vezes) e 5 mM (redução de 1,9 vezes) de PPA (p = 0,006 e p = 0,0024, respectivamente) (Fig. 3f). No entanto, não encontramos diferenças significativas na expressão dos genes de fusão MFN1, MFN2 ou do gene de fissão DRP1 sob estresse de PPA por 24 h (Fig. 3g–i). Além disso, observamos que os níveis de quatro proteínas de fusão e fissão (OPA1, MFN1, MFN2 e DRP1) não se alteraram nas mesmas condições (Fig. 4a–d). É importante ressaltar que esses dados refletem um único momento e podem não refletir alterações na expressão ou nos níveis de atividade das proteínas durante os estágios iniciais do estresse por PPA. No entanto, reduções significativas na expressão de cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 e OPA1 indicam uma desregulação transcricional significativa do metabolismo, biogênese e dinâmica mitocondrial. Ademais, esses dados destacam a utilidade das técnicas de imagem para o estudo direto das alterações no estado final da função mitocondrial.
Os níveis das proteínas dos fatores de fusão e fissão não se alteraram após o tratamento com ácido propiônico (PPA). Células SH-SY5Y foram tratadas com 3 e 5 mM de PPA por 24 horas. Os níveis de proteína foram quantificados por Western blot e os níveis de expressão foram normalizados para a proteína total. A expressão média da proteína e os Western blots representativos das proteínas alvo e da proteína total são mostrados. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. As barras representam a média ± erro padrão da média (EPM), e os dados mostrados são representativos de n = 3 réplicas biológicas. Comparações múltiplas (p < 0,05) foram realizadas utilizando análise de variância unidirecional (ANOVA) e o teste de Dunnett. O gel e o blot originais são mostrados na Figura S1.
A disfunção mitocondrial está associada a doenças multissistêmicas, que variam de doenças metabólicas, cardiovasculares e musculares a doenças neurológicas^1,10. Muitas doenças neurodegenerativas e neurodegenerativas estão associadas à disfunção mitocondrial, destacando a importância dessas organelas ao longo da vida do cérebro. Essas doenças incluem a doença de Parkinson, a doença de Alzheimer e o TEA^3,4,18. No entanto, o acesso ao tecido cerebral para o estudo dessas doenças é difícil, especialmente em nível mecanístico, tornando os sistemas de modelos celulares uma alternativa necessária. Neste estudo, utilizamos um sistema de modelo celular com células SH-SY5Y tratadas com PPA para recapitular a disfunção mitocondrial observada em doenças neuronais, particularmente nos transtornos do espectro autista. O uso desse modelo de PPA para estudar a dinâmica mitocondrial em neurônios pode fornecer informações sobre a etiologia do TEA.
Exploramos a possibilidade de usar a microscopia eletrônica de transmissão (MET) para visualizar alterações na morfologia mitocondrial. É importante ressaltar que a MET deve ser usada corretamente para maximizar sua eficácia. A preparação de amostras criopreservadas permite uma melhor preservação das estruturas neuronais, fixando simultaneamente os componentes celulares e reduzindo a formação de artefatos³⁴. De acordo com isso, observamos que as células SH-SY5Y, semelhantes a neurônios, apresentavam organelas subcelulares intactas e mitocôndrias alongadas (Fig. 1a). Isso destaca a utilidade das técnicas de preparação criogênica para o estudo da morfologia mitocondrial em modelos de células neuronais. Embora as medições quantitativas sejam cruciais para a análise objetiva dos dados de MET, ainda não há consenso sobre quais parâmetros específicos devem ser medidos para confirmar as alterações morfológicas mitocondriais. Com base em um grande número de estudos que examinaram quantitativamente a morfologia mitocondrial^17,31,32, desenvolvemos um pipeline automatizado de análise de imagens mitocondriais que mede oito parâmetros morfológicos, a saber: área, área², razão de aspecto, perímetro, circularidade, grau, diâmetro de Feret e arredondamento.
Entre eles, o PPA reduziu significativamente a área 2, a área, o perímetro e o diâmetro de Feret (Fig. 1b–e). Isso demonstrou que as mitocôndrias se tornaram menores e mais arredondadas, o que está de acordo com estudos anteriores que mostram uma diminuição na área mitocondrial após 72 horas de estresse mitocondrial induzido por PPA30. Essas características morfológicas podem indicar fissão mitocondrial, um processo necessário para sequestrar componentes danificados da rede mitocondrial e promover sua degradação por meio da mitofagia35,36,37. Por outro lado, a diminuição no tamanho médio das mitocôndrias pode estar associada ao aumento da biogênese, que resulta na formação de pequenas mitocôndrias nascentes. O aumento da fissão ou da biogênese representa uma resposta compensatória para manter a mitose contra o estresse mitocondrial. No entanto, a diminuição do crescimento mitocondrial, a fusão prejudicada ou outras condições não podem ser descartadas.
Embora as imagens de alta resolução criadas por TEM permitam a determinação de características morfológicas ao nível de mitocôndrias individuais, esse método produz instantâneos bidimensionais em um único ponto no tempo. Para estudar as respostas dinâmicas ao estresse metabólico, coramos as mitocôndrias com TMRE e utilizamos microscopia de lapso de tempo com análise MEL, que permite a visualização 3D de alto rendimento das alterações na rede mitocondrial ao longo do tempo33,38. Observamos alterações sutis, porém significativas, na dinâmica mitocondrial sob estresse de PPA (Fig. 2). A 3 mM, o número de eventos de fissão aumentou significativamente, enquanto os eventos de fusão permaneceram os mesmos que no controle. Um aumento no número de eventos de fissão e fusão foi observado a 5 mM de PPA, mas essas alterações foram aproximadamente proporcionais, sugerindo que a cinética de fissão e fusão atinge o equilíbrio em concentrações mais elevadas (Fig. 2b). O volume mitocondrial médio permaneceu inalterado tanto em 3 mM quanto em 5 mM de PPA, indicando que a integridade da rede mitocondrial foi preservada (Fig. 2d). Isso reflete a capacidade das redes mitocondriais dinâmicas de responder a um estresse metabólico leve, mantendo efetivamente a homeostase sem causar fragmentação da rede. Em 3 mM de PPA, o aumento na fissão é suficiente para promover a transição para um novo equilíbrio, mas uma remodelação cinética mais profunda é necessária em resposta ao estresse induzido por concentrações mais altas de PPA.
O número de mitocôndrias aumentou em ambas as concentrações de estresse por PPA, mas o volume mitocondrial médio não apresentou alteração significativa (Fig. 2c). Isso pode ser devido ao aumento da biogênese ou da divisão celular; entretanto, na ausência de uma diminuição significativa no volume mitocondrial médio, é mais provável que a biossíntese aumente. Contudo, os dados da Figura 2 corroboram a existência de dois mecanismos compensatórios: um aumento no número de eventos de fissão, consistente com a regulação positiva da fissão mitocondrial, e um aumento no número de eventos, consistente com a biogênese mitocondrial. Em última análise, a compensação dinâmica para estresse leve pode consistir em processos simultâneos envolvendo fissão, fusão, biogênese e mitofagia. Embora autores anteriores tenham demonstrado que o PPA aumenta a mitose30,39 e a mitofagia29, fornecemos evidências de remodelação da dinâmica de fissão e fusão mitocondrial em resposta ao PPA. Esses dados confirmam as alterações morfológicas observadas por MET e fornecem mais informações sobre os mecanismos associados à disfunção mitocondrial induzida por PPA.
Como nem a análise por TEM nem a análise por MEL forneceram evidências diretas dos mecanismos de regulação gênica subjacentes às alterações morfológicas observadas, examinamos a expressão de RNA de genes envolvidos no metabolismo, biogênese e dinâmica mitocondrial. O proto-oncogene cMYC é um fator de transcrição envolvido na regulação das mitocôndrias, glicólise e metabolismo de aminoácidos e ácidos graxos⁴⁰. Além disso, sabe-se que o cMYC regula a expressão de quase 600 genes mitocondriais envolvidos na transcrição, tradução e montagem de complexos mitocondriais, incluindo NRF1 e TFAM⁴¹. NRF1 e TFAM são dois reguladores centrais da mitose, atuando a jusante de PGC-1α para ativar a replicação do mtDNA. Essa via é ativada pela sinalização de cAMP e AMPK e é sensível ao gasto energético e ao estresse metabólico. Também examinamos o NFE2L2, um regulador redox da biogênese mitocondrial, para determinar se os efeitos do PPA poderiam ser mediados pelo estresse oxidativo.
Embora a expressão de NFE2L2 tenha permanecido inalterada, observamos uma diminuição consistente e dose-dependente na expressão de cMYC, NRF1 e TFAM após 24 horas de tratamento com 3 mM e 5 mM de PPA (Fig. 3a–c). A redução da expressão de cMYC já foi relatada como uma resposta ao estresse mitocondrial42 e, inversamente, a redução da expressão de cMYC pode causar disfunção mitocondrial por meio da remodelação do metabolismo mitocondrial, da conectividade da rede e da polarização da membrana43. Curiosamente, o cMYC também está envolvido na regulação da fissão e fusão mitocondrial42,43 e é conhecido por aumentar a fosforilação de DRP1 e a localização mitocondrial durante a divisão celular44, bem como por mediar a remodelação morfológica mitocondrial em células-tronco neuronais45. De fato, fibroblastos deficientes em cMYC exibem tamanho mitocondrial reduzido, consistente com as alterações induzidas pelo estresse de PPA43. Esses dados ilustram uma relação interessante, porém ainda não totalmente esclarecida, entre o cMYC e a dinâmica mitocondrial, representando um alvo promissor para futuros estudos sobre a remodelação induzida pelo estresse do PPA.
A redução de NRF1 e TFAM é consistente com o papel do cMYC como um importante ativador transcricional. Esses dados também são consistentes com estudos anteriores em células de câncer de cólon humano, que mostraram que o PPA reduziu a expressão de mRNA de NRF1 em 22 horas, o que foi associado à depleção de ATP e ao aumento de ROS46. Esses autores também relataram que a expressão de TFAM aumentou em 8,5 horas, mas retornou aos níveis basais em 22 horas. Em contraste, Kim et al. (2019) mostraram que a expressão de mRNA de TFAM diminuiu significativamente após 4 horas de estresse por PPA em células SH-SY5Y; no entanto, após 72 horas, a expressão da proteína TFAM aumentou significativamente, assim como o número de cópias de mtDNA. Portanto, a diminuição no número de genes de biogênese mitocondrial que observamos após 24 horas não exclui a possibilidade de que o aumento no número de mitocôndrias esteja associado à ativação da biogênese em momentos anteriores. Estudos anteriores demonstraram que o PPA aumenta significativamente a expressão do mRNA e da proteína PGC-1α em células SH-SY5Y após 4 horas e 30 minutos, enquanto o ácido propiônico promove a biogênese mitocondrial em hepatócitos de bezerro via PGC-1α após 12 horas e 39 minutos. Curiosamente, o PGC-1α não é apenas um regulador transcricional direto de NRF1 e TFAM, mas também regula a atividade de MFN2 e DRP1 por meio da regulação da fissão e fusão mitocondrial. Em conjunto, esses dados destacam a estreita relação entre os mecanismos que regulam as respostas compensatórias mitocondriais induzidas pelo PPA. Além disso, nossos dados refletem uma desregulação significativa da regulação transcricional da biogênese e do metabolismo sob estresse por PPA.
Os genes STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 e DRP1 estão entre os principais reguladores da fissão, fusão e dinâmica mitocondrial37,48,49. Existem muitos outros genes envolvidos na dinâmica mitocondrial; no entanto, STOML2, OPA1 e MFN2 já foram identificados como diferencialmente metilados em coortes de TEA,16 e diversos estudos independentes relataram alterações nesses fatores de transcrição em resposta ao estresse mitocondrial50,51. 52. A expressão de OPA1 e STOML2 foi significativamente reduzida pelo tratamento com 3 mM e 5 mM de PPA (Fig. 3e, f). OPA1 é um dos reguladores clássicos da fusão mitocondrial por meio da interação direta com MFN1 e 2 e desempenha um papel na remodelação das cristas e na morfologia mitocondrial53. O papel preciso da STOML2 na dinâmica mitocondrial permanece incerto, mas as evidências sugerem que ela desempenha um papel na fusão mitocondrial, na biogênese e na mitofagia.
STOML2 está envolvido na manutenção do acoplamento respiratório mitocondrial e na formação de complexos da cadeia respiratória54,55 e demonstrou alterar profundamente as características metabólicas das células cancerígenas56. Estudos mostraram que STOML2 promove o potencial de membrana mitocondrial e a biogênese por meio da interação com BAN e cardiolipina55,57,58. Além disso, estudos independentes mostraram que a interação entre STOML2 e PINK1 regula a mitofagia59,60. Notavelmente, foi relatado que STOML2 interage diretamente com MFN2 e o estabiliza, além de desempenhar um papel importante na estabilização de isoformas longas de OPA1, inibindo a protease responsável pela degradação de OPA153,61,62. A redução na expressão de STOML2 observada em reações de PPA pode tornar essas proteínas de fusão mais suscetíveis à degradação por meio de vias dependentes de ubiquitina e proteassoma48. Embora o papel preciso de STOML2 e OPA1 na resposta dinâmica ao PPA não esteja claro, a diminuição da expressão desses genes de fusão (Figura 3) pode perturbar o equilíbrio entre fissão e fusão e levar à diminuição do tamanho mitocondrial (Figura 3). 1).
Por outro lado, a expressão da proteína OPA1 permaneceu inalterada após 24 h, enquanto os níveis de mRNA e proteína de MFN1, MFN2 ou DRP1 não sofreram alterações significativas após o tratamento com PPA (Fig. 3g-i, Fig. 4). Isso pode indicar que não há alterações na regulação desses fatores envolvidos na fusão e fissão mitocondrial. No entanto, vale ressaltar que cada um desses quatro genes também é regulado por modificações pós-transcricionais (MPT) que controlam a atividade proteica. OPA1 possui oito variantes de splicing alternativo que são clivadas proteoliticamente nas mitocôndrias para produzir duas isoformas distintas⁶³. O equilíbrio entre as isoformas longa e curta determina, em última análise, o papel de OPA1 na fusão mitocondrial e na manutenção da rede mitocondrial⁶⁴. A atividade de DRP1 é regulada pela fosforilação da proteína quinase II dependente de cálcio/calmodulina (CaMKII), enquanto a degradação de DRP1 é regulada por ubiquitinação e SUMOilação⁶⁵. Finalmente, tanto DRP1 quanto MFN1/2 são GTPases, portanto, sua atividade pode ser influenciada pela taxa de produção de GTP nas mitocôndrias 66. Assim, embora a expressão dessas proteínas permaneça constante, isso pode não refletir uma atividade ou localização proteica inalterada 67,68. De fato, os repertórios de proteínas com modificações pós-traducionais (PTM) existentes frequentemente servem como a primeira linha de defesa responsável por mediar respostas agudas ao estresse. Na presença de estresse metabólico moderado em nosso modelo, é provável que as PTM promovam o aumento da atividade de proteínas de fusão e fissão para restaurar suficientemente a integridade mitocondrial sem exigir ativação adicional desses genes em nível de mRNA ou proteína.
Em conjunto, os dados acima destacam a regulação complexa e dependente do tempo da morfologia mitocondrial e os desafios de elucidar esses mecanismos. Para estudar a expressão gênica, é necessário primeiro identificar genes-alvo específicos na via. No entanto, nossos dados mostram que genes na mesma via não respondem da mesma forma ao mesmo estresse. De fato, estudos anteriores demonstraram que diferentes genes na mesma via podem exibir perfis de resposta temporal distintos30,46. Além disso, existem mecanismos pós-transcricionais complexos que interrompem a relação entre transcrição e função gênica. Estudos proteômicos podem fornecer informações sobre o impacto das modificações pós-traducionais (PTMs) e a função proteica, mas também apresentam desafios, incluindo métodos de baixa produtividade, altas relações sinal-ruído e baixa resolução.
Neste contexto, o estudo da morfologia mitocondrial utilizando TEM e MEL tem grande potencial para abordar questões fundamentais sobre a relação entre a dinâmica e a função mitocondrial e como isso influencia doenças. Mais importante ainda, a TEM fornece um método direto para medir a morfologia mitocondrial como um ponto final convergente da disfunção e da dinâmica mitocondrial⁵¹. A MEL também fornece um método direto para visualizar eventos de fissão e fusão em um ambiente celular tridimensional, permitindo a quantificação da remodelação mitocondrial dinâmica mesmo na ausência de alterações na expressão gênica³³. Aqui, destacamos a utilidade das técnicas de imagem mitocondrial em doenças mitocondriais secundárias. Essas doenças são tipicamente caracterizadas por estresse metabólico crônico leve, caracterizado por uma remodelação sutil das redes mitocondriais, em vez de danos mitocondriais agudos. No entanto, a compensação mitocondrial necessária para manter a mitose sob estresse crônico tem profundas consequências funcionais. No contexto da neurociência, uma melhor compreensão desses mecanismos compensatórios pode fornecer informações importantes sobre a neuropatologia pleiotrópica associada à disfunção mitocondrial.
Em última análise, nossos dados destacam a utilidade das técnicas de imagem para a compreensão das consequências funcionais das interações complexas entre a expressão gênica, as modificações proteicas e a atividade proteica que controlam a dinâmica mitocondrial neuronal. Utilizamos PPA para modelar a disfunção mitocondrial em um modelo de célula neuronal, a fim de obter informações sobre o componente mitocondrial do TEA (Transtorno do Espectro Autista). Células SH-SY5Y tratadas com PPA apresentaram alterações na morfologia mitocondrial: as mitocôndrias tornaram-se pequenas e arredondadas, e as cristas ficaram pouco definidas quando observadas por MET (Microscopia Eletrônica de Transmissão). A análise MEL (Memorial Electron-Level) mostra que essas alterações ocorrem concomitantemente com um aumento nos eventos de fissão e fusão para manter a rede mitocondrial em resposta a um estresse metabólico leve. Além disso, o PPA interrompe significativamente a regulação transcricional do metabolismo e da homeostase mitocondrial. Identificamos cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 e OPA1 como reguladores mitocondriais chave afetados pelo estresse induzido por PPA e que podem desempenhar um papel na mediação das alterações na morfologia e função mitocondrial induzidas por PPA. Estudos futuros são necessários para melhor caracterizar as alterações temporais induzidas por PPA na expressão gênica e na atividade, localização e modificações pós-traducionais de proteínas. Nossos dados destacam a complexidade e a interdependência dos mecanismos regulatórios que medeiam a resposta ao estresse mitocondrial e demonstram a utilidade da microscopia eletrônica de transmissão (MET) e de outras técnicas de imagem para estudos mecanísticos mais direcionados.
A linhagem celular SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) foi adquirida da Sigma-Aldrich. As células SH-SY5Y foram cultivadas em meio de cultura DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/F-12) suplementado com L-glutamina (SC09411, ScienCell) em frascos de 25 cm² contendo 20% de soro fetal bovino (SFB) (10493106, ThermoFisher Scientific) e 1% de penicilina-estreptomicina (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) a 37 °C e 5% de CO₂. As células foram subcultivadas até atingirem 80% de confluência utilizando tripsina-EDTA 0,05% (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugadas a 300 g e plaqueadas a uma densidade de aproximadamente 7 × 10⁵ células/ml. Todos os experimentos foram realizados em células SH-SY5Y indiferenciadas entre as passagens 19 e 22. O PPA é administrado na forma de fosfato de sódio (NaP). Dissolva o pó de NaP (CAS nº 137-40-6, fórmula química C₃H₅NaO₂, P5436-100G, Sigma-Aldrich) em água MilliQ morna até uma concentração de 1 M e armazene a 4 °C. No dia do tratamento, dilua esta solução com PPA 1 M para obter concentrações de 3 mM e 5 mM de PPA em meio sem soro (DMEM/F-12 com L-glutamina). As concentrações de tratamento para todos os experimentos foram: sem PPA (0 mM, controle), 3 mM e 5 mM de PPA. Os experimentos foram realizados em pelo menos três réplicas biológicas.
Células SH-SY5Y foram semeadas em frascos de 25 cm³ a ​​uma densidade de 5,5 × 10⁵ células/ml e cultivadas por 24 horas. O tratamento com PPA foi adicionado ao frasco antes das 24 horas de incubação. Os pellets celulares foram coletados seguindo os protocolos normais de subcultura de tecido de mamíferos (descritos acima). O pellet celular foi ressuspendido em 100 µl de glutaraldeído a 2,5% em PBS 1× e armazenado a 4 °C até o processamento. As células SH-SY5Y foram centrifugadas brevemente para sedimentar as células e remover a solução de glutaraldeído a 2,5% em PBS 1×. O sedimento foi ressuspendido em um gel de agarose a 4% preparado em água destilada (a proporção de agarose para o volume do sedimento é de 1:1). Os fragmentos de agarose foram colocados em grades sobre placas planas e revestidos com 1-hexadeceno antes do congelamento de alta pressão. As amostras foram congeladas em acetona seca a 100% a -90 °C por 24 horas. A temperatura foi então elevada para -80 °C e adicionou-se uma solução de 1% de tetróxido de ósmio e 0,1% de glutaraldeído. As amostras foram armazenadas a -80 °C por 24 horas. Após esse período, a temperatura foi gradualmente aumentada até a temperatura ambiente ao longo de vários dias: de -80 °C para -50 °C por 24 horas, para -30 °C por 24 horas, para -10 °C por 24 horas e, finalmente, até a temperatura ambiente.
Após o preparo criogênico, as amostras foram impregnadas com resina e seções ultrafinas (∼100 nm) foram obtidas utilizando um ultramicrótomo Leica Reichert UltracutS (Leica Microsystems). As seções foram coradas com acetato de uranila a 2% e citrato de chumbo. As amostras foram observadas utilizando um microscópio eletrônico de transmissão FEI Tecnai 20 (ThermoFisher (anteriormente FEI), Eindhoven, Holanda) operando a 200 kV (transmissor Lab6) e uma câmera CCD Gatan (Gatan, Reino Unido) equipada com um filtro de energia Tridiem.
Em cada réplica técnica, foram adquiridas pelo menos 24 imagens de células individuais, totalizando 266 imagens. Todas as imagens foram analisadas utilizando a macro de Região de Interesse (ROI) e a macro de Mitocôndrias. A macro de mitocôndrias é baseada em métodos publicados^17,31,32 e permite o processamento em lote semiautomático de imagens de MET no Fiji/ImageJ⁶⁹. Resumidamente: a imagem é invertida e transformada em nova imagem utilizando subtração de fundo por bola rolante (raio de 60 pixels) e um filtro passa-banda FFT (utilizando limites superior e inferior de 60 e 8 pixels, respectivamente) e supressão de linhas verticais com uma tolerância de orientação de 5%. A imagem processada é automaticamente limiarizada utilizando um algoritmo de máxima entropia e uma máscara binária é gerada. Regiões da imagem associadas a ROIs selecionadas manualmente em imagens de MET brutas foram extraídas, caracterizando as mitocôndrias e excluindo a membrana plasmática e outras regiões de alto contraste. Para cada ROI extraída, partículas binárias maiores que 600 pixels foram analisadas, e a área, o perímetro, os eixos maior e menor, o diâmetro de Feret, a circularidade e a redondeza das partículas foram medidos usando as funções de medição integradas do Fiji/ImageJ. Seguindo Merrill, Flippo e Strack (2017), a área 2, a razão de aspecto da partícula (razão entre o eixo maior e o menor) e o fator de forma (FF) foram calculados a partir desses dados, onde FF = perímetro 2/4π x área. A definição da fórmula paramétrica pode ser encontrada em Merrill, Flippo e Strack (2017). As macros mencionadas estão disponíveis no GitHub (ver Declaração de Disponibilidade de Dados). Em média, aproximadamente 5.600 partículas foram analisadas por tratamento com PPA, totalizando aproximadamente 17.000 partículas (dados não mostrados).
As células SH-SH5Y foram colocadas em placas de cultura de 8 câmaras (ThermoFisher, nº 155411) para permitir a adesão durante a noite e, em seguida, incubadas com TMRE 1:1000 (ThermoFisher, nº T669) e Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). As imagens foram adquiridas usando lasers de 405 nm e 561 nm durante 10 minutos, e as imagens brutas foram adquiridas como pilhas z contendo 10 micrografias com um passo az de 0,2 μm entre os quadros de imagem em 12 pontos de tempo subsequentes. As imagens foram coletadas usando uma plataforma de super-resolução Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha) com uma lente LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27. As imagens foram analisadas no ImageJ usando um pipeline previamente descrito e o plugin ImageJ para medir eventos de fusão e fissão, número médio de estruturas mitocondriais e volume mitocondrial médio por célula33. As macros MEL estão disponíveis no GitHub (consulte a Declaração de Disponibilidade de Dados).
As células SH-SY5Y foram cultivadas em placas de seis poços a uma densidade de 0,3 × 10⁶ células/mL por 24 horas antes do tratamento. O RNA foi extraído utilizando o protocolo Quick-RNA™ Miniprep (ZR R1055, Zymo Research) com ligeiras modificações: adicionar 300 μL de tampão de lise de RNA a cada poço antes da remoção e lisar cada amostra como etapa final com 30 μL de água livre de DNase/RNase. Todas as amostras foram verificadas quanto à quantidade e qualidade utilizando um espectrofotômetro UV-Vis NanoDrop ND-1000. A proteína total dos lisados ​​celulares foi obtida utilizando 200 μL de tampão de lise RIPA, e a concentração proteica foi quantificada utilizando o ensaio de proteína de Bradford.
A síntese de cDNA foi realizada utilizando o kit Tetro™ cDNA Synthesis Kit (BIO-65043, Meridian Bioscience) de acordo com as instruções do fabricante, com algumas modificações. O cDNA foi sintetizado em reações de 20 μl utilizando de 0,7 a 1 μg de RNA total. Os primers foram selecionados a partir de artigos previamente publicados 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (Tabela S1) e as sondas correspondentes foram desenhadas utilizando a ferramenta PrimerQuest da Integrated DNA Technologies. Todos os genes de interesse foram normalizados em relação ao gene nuclear B2M. A expressão gênica de STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC e OPA1 foi medida por RT-qPCR. A mistura mestra incluiu a polimerase LUNA Taq (M3003L, New England Biolabs), primers forward e reverse a 10 μM, cDNA e água para PCR, resultando em um volume final de 10 μL para cada reação. A expressão dos genes de divisão e fissão (DRP1, MFN1/2) foi medida utilizando ensaios multiplex TaqMan. A mistura mestra Luna Universal Probe qPCR (M3004S, New England Biolabs) foi utilizada de acordo com as instruções do fabricante, com pequenas modificações. A mistura mestra para RT-qPCR multiplex inclui 1X de polimerase LUNA Taq, primers forward e reverse a 10 μM, sonda a 10 μM, cDNA e água para PCR, resultando em um volume final de 20 μL para cada reação. A RT-qPCR foi realizada utilizando o Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG — número de série: R0618110). As condições de ciclagem são apresentadas na Tabela S1. Todas as amostras de cDNA foram amplificadas em triplicata e uma curva padrão foi gerada usando uma série de diluições decimais. Valores discrepantes em amostras triplicadas com desvio padrão do limiar de ciclo (Ct) >0,5 foram removidos da análise para garantir a reprodutibilidade dos dados30,72. A expressão gênica relativa foi calculada usando o método 2-ΔΔCt79.
Amostras de proteína (60 μg) foram misturadas com tampão de amostra de Laemmli na proporção de 2:1 e submetidas à eletroforese em gel de poliacrilamida incolor a 12% (Bio-Rad nº 1610184). As proteínas foram transferidas para uma membrana de PVDF (fluoreto de polivinilideno) (nº 170-84156, Bio-Rad) utilizando o sistema Trans-Blot Turbo (nº 170-4155, Bio-Rad). A membrana foi bloqueada e incubada com os anticorpos primários apropriados (OPA1, MFN1, MFN2 e DRP1) (diluídos a 1:1000) por 48 horas, seguida de incubação com anticorpos secundários (1:10.000) por 1 hora. As membranas foram então visualizadas utilizando o substrato Clarity Western ECL (nº 170-5061, Bio-Rad) e registradas em um sistema Bio-Rad ChemiDoc MP. O programa ImageLab versão 6.1 foi utilizado para a análise de Western blot. O gel e o blot originais são mostrados na Figura S1. As informações sobre os anticorpos estão disponíveis na Tabela S2.
Os conjuntos de dados são apresentados como a média e o erro padrão da média (EPM) de pelo menos três amostras independentes. A normalidade dos dados foi testada pelo teste de Shapiro-Wilk (salvo indicação em contrário) antes de assumir uma distribuição gaussiana e desvios padrão iguais e prosseguir com as análises. Além disso, foram analisados ​​os dados utilizando o teste MEL LSD de Fisher (p < 0,05), ANOVA de uma via (média do tratamento vs. controle) e o teste de comparações múltiplas de Dunnett para determinar a significância (p < 0,05). Os valores de p significativos são indicados no gráfico como *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Todas as análises estatísticas e gráficos foram realizados e gerados utilizando o GraphPad Prism 9.4.0.
Macros para Fiji/ImageJ para análise de imagens TEM estão disponíveis publicamente no GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. A macro Mitochondrial Event Locator (MEL) está disponível publicamente no GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
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