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O diagnóstico precoce do tremor essencial (TE) pode ser desafiador, especialmente quando diferenciado de controles saudáveis ​​(CS) e da doença de Parkinson (DP). Recentemente, a análise de amostras de fezes para microbiota intestinal e seus metabólitos tem fornecido novos métodos para a descoberta de novos biomarcadores de doenças neurodegenerativas. Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), principais metabólitos da flora intestinal, estão reduzidos nas fezes em pacientes com DP. No entanto, os AGCC fecais nunca foram estudados em pacientes com TE. Nosso objetivo foi investigar os níveis fecais de AGCC em pacientes com TE, avaliar sua relação com os sintomas clínicos e a microbiota intestinal e determinar seu potencial diagnóstico. Os níveis fecais de AGCC e a microbiota intestinal foram medidos em 37 pacientes com TE, 37 pacientes com DP recém-diagnosticada e 35 CS. A constipação, a disfunção autonômica e a gravidade do tremor foram avaliadas por meio de escalas. Os níveis fecais de propionato, butirato e isobutirato foram menores em pacientes com TE do que em CS. Uma combinação de ácidos propiônico, butírico e isobutírico diferenciou o tremor essencial (TE) do grupo controle saudável (GC) com uma AUC de 0,751 (IC 95%: 0,634–0,867). Os níveis fecais de ácido isovalérico e ácido isobutírico foram menores no TE do que na doença de Parkinson (DP). O ácido isovalérico e o ácido isobutírico discriminam entre TE e DP com uma AUC de 0,743 (IC 95%: 0,629–0,857). O propionato fecal está inversamente associado à constipação e à disfunção autonômica. O ácido isobutírico e o ácido isovalérico estão inversamente relacionados à gravidade do tremor. A diminuição dos ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) fecais foi associada a uma diminuição na abundância de Faecalibacterium e Streptobacterium no TE. Assim, o conteúdo de AGCC nas fezes diminui no TE e está associado à gravidade do quadro clínico e a alterações na microbiota intestinal. Propionato, butirato, isobutirato e isovalerato fecais podem ser potenciais biomarcadores diagnósticos e de diagnóstico diferencial para ET (Treatmento Essencial).
O tremor essencial (TE) é uma doença neurodegenerativa crônica e progressiva, caracterizada principalmente por tremor nos membros superiores, que também pode afetar outras partes do corpo, como a cabeça, as cordas vocais e os membros inferiores¹. As características clínicas do TE incluem não apenas sintomas motores, mas também alguns sinais não motores, incluindo doenças gastrointestinais². Numerosos estudos têm sido conduzidos para examinar as características patológicas e fisiológicas do tremor essencial, mas mecanismos fisiopatológicos claros ainda não foram identificados^3,4. Estudos recentes sugerem que a disfunção do eixo microbiota-intestino-cérebro pode contribuir para doenças neurodegenerativas, e há evidências crescentes de uma possível ligação bidirecional entre a microbiota intestinal e doenças neurodegenerativas^5,6. Notavelmente, em um relato de caso, o transplante de microbiota fecal melhorou tanto o tremor essencial quanto a síndrome do intestino irritável em um paciente, o que pode indicar uma estreita relação entre a microbiota intestinal e o tremor essencial. Além disso, também encontramos alterações específicas na microbiota intestinal em pacientes com TE, o que reforça fortemente o importante papel da disbiose intestinal no TE⁸.
Em relação à disbiose intestinal em doenças neurodegenerativas, a DP é a mais estudada⁵. Uma microbiota desequilibrada pode aumentar a permeabilidade intestinal e ativar a glia intestinal, levando a alfa-sinucleinopatias⁹,¹⁰,¹¹. A DP e o TE compartilham algumas características comuns, como frequência semelhante de tremor em pacientes com TE e DP, sobreposição de tremor de repouso (tremor típico na DP) e tremor postural (encontrado principalmente em pacientes com TE), dificultando a distinção entre elas. Portanto, precisamos urgentemente abrir uma janela útil para diferenciar entre TE e DP. Nesse contexto, o estudo da disbiose intestinal específica e das alterações metabólicas associadas no TE, bem como a identificação de suas diferenças em relação à DP, podem se tornar potenciais biomarcadores para o diagnóstico e diagnóstico diferencial do TE.
Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) são os principais metabólitos produzidos pela fermentação bacteriana intestinal da fibra alimentar e acredita-se que desempenhem um papel crucial nas interações intestino-cérebro^13,14. Os AGCC são absorvidos pelas células do cólon e transportados para o fígado através do sistema venoso portal, e alguns AGCC entram na circulação sistêmica. Os AGCC têm efeitos locais na manutenção da integridade da barreira intestinal e na promoção da imunidade inata na mucosa intestinal¹⁵. Eles também têm efeitos a longo prazo na barreira hematoencefálica (BHE) estimulando proteínas de junção estreita e ativando neurônios por meio da estimulação de receptores acoplados à proteína G (GPCRs) para atravessar a BHE¹⁶. Acetato, propionato e butirato são os AGCC mais abundantes no cólon. Estudos anteriores mostraram níveis fecais reduzidos de ácidos acético, propiônico e butírico em pacientes com doença de Parkinson¹⁷. No entanto, os níveis fecais de AGCC nunca foram estudados em pacientes com tremor essencial (TE).
Assim, nosso estudo teve como objetivo identificar alterações específicas nos ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) fecais em pacientes com tremor essencial (TE) e suas diferenças em relação a pacientes com doença de Parkinson (DP), avaliar a relação dos AGCC fecais com os sintomas clínicos do TE e a microbiota intestinal, bem como determinar o potencial diagnóstico e diferencial das amostras fecais. Para controlar os fatores de confusão associados aos medicamentos antiparkinsonianos, selecionamos pacientes com doença de Parkinson de início recente como grupo controle.
As características demográficas e clínicas dos 37 pacientes com tremor essencial (TE), 37 pacientes com doença de Parkinson (DP) e 35 controles saudáveis ​​(CS) estão resumidas na Tabela 1. Os grupos TE, DP e CS foram pareados por idade, sexo e IMC. Os três grupos também apresentaram proporções semelhantes de tabagismo, consumo de álcool e consumo de café e chá. Os escores de Wexner (P = 0,004) e HAMD-17 (P = 0,001) do grupo DP foram maiores do que os do grupo CS, e os escores de HAMA (P = 0,011) e HAMD-17 (P = 0,011) do grupo TE foram maiores do que os do grupo CS. O tempo de evolução da doença no grupo TE foi significativamente maior do que no grupo DP (P < 0,001).
Houve diferenças significativas nos níveis fecais de ácido propiônico (P = 0,023), ácido acético (P = 0,039), ácido butírico (P = 0,020), ácido isovalérico (P = 0,045) e ácido isobutírico (P = 0,015). Em análises post hoc adicionais, os níveis de ácido propiônico (P = 0,023), ácido butírico (P = 0,007) e ácido isobutírico (P = 0,040) no grupo com tremor essencial (TE) foram significativamente menores do que no grupo controle saudável (CS). Pacientes com TE apresentaram níveis mais baixos de isovalerato (P = 0,014) e isobutirato (P = 0,005) do que pacientes com doença de Parkinson (DP). Além disso, os níveis fecais de ácido propiônico (P = 0,013), ácido acético (P = 0,016) e ácido butírico (P = 0,041) foram menores em pacientes com DP do que em pacientes com CC (Fig. 1 e Tabela Suplementar 1).
O termo "ag" representa uma comparação entre os grupos de ácido propiônico, ácido acético, ácido butírico, ácido isovalérico, ácido valérico, ácido caproico e ácido isobutírico, respectivamente. Houve diferenças significativas nos níveis fecais de ácido propiônico, ácido acético, ácido butírico, ácido isovalérico e ácido isobutírico entre os três grupos. ET: tremor essencial; HC: controle saudável; SCFA: AGCC. Diferenças significativas são indicadas por *P < 0,05 e **P < 0,01.
Considerando a diferença na evolução da doença entre o grupo com trombocitemia essencial (TE) e o grupo com doença de Parkinson (DP), estudamos 33 pacientes com DP inicial e 16 pacientes com TE (evolução da doença < 3 anos) para comparação adicional (Tabela Suplementar 2). Os resultados mostraram que o teor de ácido propiônico fecal em pacientes com TE foi significativamente menor do que em pacientes com DP inicial (P = 0,015). A diferença entre TE e o grupo controle saudável (GC) para os níveis de ácido butírico e isobutírico não foi significativa, mas observou-se uma tendência (P = 0,082). Os níveis fecais de isobutirato foram significativamente menores em pacientes com TE em comparação com pacientes com DP (P = 0,030). A diferença entre TE e DP para o ácido isovalérico não foi significativa, mas observou-se uma tendência (P = 0,084). Os níveis de ácido propiônico (P = 0,023), ácido acético (P = 0,020) e ácido butírico (P = 0,044) foram significativamente menores em pacientes com DP do que em pacientes do GC. Esses resultados (Figura Suplementar 1) são geralmente consistentes com os resultados principais. A diferença nos resultados entre a amostra geral e o subgrupo de pacientes em estágio inicial pode ser atribuída ao tamanho amostral menor no subgrupo, resultando em menor poder estatístico dos dados.
Em seguida, examinamos se os níveis fecais de AGCC (ácidos graxos de cadeia curta) poderiam distinguir pacientes com TE (teste de tremor essencial) de pacientes com CU (colite ulcerativa) ou DP (doença de Parkinson). De acordo com a análise ROC, a diferença na AUC (área sob a curva) dos níveis de propionato foi de 0,668 (IC 95%: 0,538-0,797), o que possibilitou distinguir pacientes com TE de indivíduos saudáveis. Pacientes com TE e GC (câncer gástrico) puderam ser distinguidos pelos níveis de butirato, com uma AUC de 0,685 (IC 95%: 0,556-0,814). Diferenças nos níveis de ácido isobutírico podem distinguir pacientes com TE de indivíduos saudáveis, com uma AUC de 0,655 (IC 95%: 0,525-0,786). Ao combinar os níveis de propionato, butirato e isobutirato, obteve-se uma AUC mais elevada de 0,751 (IC 95%: 0,634–0,867), com sensibilidade de 74,3% e especificidade de 72,9% (Fig. 2a). Para diferenciar entre pacientes com tremor essencial (TE) e doença de Parkinson (DP), a AUC para os níveis de ácido isovalérico foi de 0,700 (IC 95%: 0,579–0,822) e para os níveis de ácido isobutírico foi de 0,718 (IC 95%: 0,599–0,836). A combinação dos níveis de ácido isovalérico e ácido isobutírico apresentou uma AUC mais elevada de 0,743 (IC 95%: 0,629–0,857), sensibilidade de 74,3% e especificidade de 62,9% (Fig. 2b). Além disso, examinamos se os níveis de AGCC nas fezes de pacientes com doença de Parkinson diferiam dos controles. De acordo com a análise ROC, a AUC para identificar pacientes com DP com base nas diferenças nos níveis de ácido propiônico foi de 0,687 (IC 95%: 0,559-0,814), com sensibilidade de 68,6% e especificidade de 68,7%. As diferenças nos níveis de acetato podem distinguir pacientes com DP de controles saudáveis ​​com uma AUC de 0,674 (IC 95%: 0,542-0,805). Pacientes com DP podem ser diferenciados de indivíduos saudáveis ​​apenas pelos níveis de butirato, com uma AUC de 0,651 (IC 95%: 0,515-0,787). Ao combinar os níveis de propionato, acetato e butirato, obteve-se uma AUC de 0,682 (IC 95%: 0,553-0,811) (Fig. 2c).
a) Discriminação da Igreja Ortodoxa Russa contra ET e HC; b) Discriminação da Igreja Ortodoxa Russa contra ET e DP; c) Discriminação da Igreja Ortodoxa Russa contra DP e HC; ET: tremor essencial, doença de Parkinson, HC: grupo controle saudável, SCFA.
Em pacientes com tremor essencial (TE), o nível de ácido isobutírico fecal apresentou correlação negativa com o escore FTM (r = -0,349, P = 0,034), e o nível de ácido isovalérico fecal apresentou correlação negativa com o escore FTM (r = -0,421, P = 0,001) e com o escore TETRAS (r = -0,382, P = 0,020). Em pacientes com TE e doença de Parkinson (DP), os níveis de propionato fecal apresentaram correlação negativa com os escores SCOPA-AUT (r = −0,236, P = 0,043) (Figura 3 e Tabela Suplementar 3). Não houve correlação significativa entre a evolução da doença e os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) em nenhum dos grupos, TE (P ≥ 0,161) ou DP (P ≥ 0,246) (Tabela Suplementar 4). Em pacientes com DP, os níveis fecais de ácido caproico apresentaram correlação positiva com os escores MDS-UPDRS (r = 0,335, P = 0,042). Em todos os participantes, os níveis fecais de propionato (r = −0,230, P = 0,016) e acetato (r = −0,210, P = 0,029) apresentaram correlação negativa com os escores de Wexner (Fig. 3 e Tabela Suplementar 3).
Os níveis fecais de ácido isobutírico apresentaram correlação negativa com os escores da Escala de Avaliação de Sintomas Autonômicos da Doença de Parkinson (FTM), o ácido isovalérico apresentou correlação negativa com os escores da FTM e da Escala de Avaliação Clínica de Tremor de Fana-Tolosa-Marin (TETRAS), o ácido propiônico apresentou correlação negativa com os escores da Escala de Avaliação de Tremor Essencial (SCOPA-AUT), o ácido caproico apresentou correlação positiva com os escores da Escala de Avaliação de Sintomas Autonômicos da Doença de Parkinson (MDS-UPDRS) e o ácido propiônico apresentou correlação negativa com os escores da FTM e da TETRAS. A TETRAS e o ácido acético apresentaram correlação negativa com o escore de Wexner. As variáveis ​​analisadas foram: MDS-UPDRS (versão patrocinada pela Associação), Mini Exame do Estado Mental (MEEM), Escala de Avaliação de Depressão de Hamilton (HAMD-17, 17 itens), Escala de Avaliação de Ansiedade de Hamilton (HAMA), estágios de Hoehn e Yahr (HY), SCFA, SCOPA-AUT (Escala de Avaliação de Sintomas Autonômicos da Doença de Parkinson), FTM (Escala de Avaliação Clínica de Tremor de Fana-Tolosa-Marin) e TETRAS (Escala de Avaliação de Tremor Essencial do Grupo de Pesquisa TETRAS - TRG). Diferenças significativas são indicadas por *P < 0,05 e **P < 0,01.
Exploramos ainda a natureza discriminatória da microbiota intestinal utilizando a análise LEfSE e selecionamos o nível de abundância relativa de gênero para análises posteriores. Comparações foram feitas entre ET e HC e entre ET e PD. Em seguida, foi realizada uma análise de correlação de Spearman entre a abundância relativa da microbiota intestinal e os níveis de SCFA fecais nos dois grupos de comparação.
Faecalibacterium (correlacionado com ácido butírico, r = 0,408, P < 0,001), Lactobacillus (correlacionado com ácido butírico, r = 0,283, P = 0,016) e Streptobacterium (correlacionado com ácido propiônico, r = 0,327) estavam presentes na análise de ET e CA. , P = 0,005; correlacionado com ácido butírico, r = 0,374, P = 0,001; A abundância de *Faecalibacterium* (correlaciona-se com o ácido isobutírico, r = 0,329, P = 0,005), *Howardella* (correlaciona-se com o ácido propiônico, r = 0,242, P = 0,041), *Raoultella* (correlaciona-se com o propionato, r = 0,249, P = 0,035) e *Candidatus Arthromitus* (correlaciona-se com o ácido isobutírico, r = 0,302, P = 0,010) diminui em ET e apresenta correlação positiva com os níveis fecais de AGCC. No entanto, a abundância de *Stenotropomonas* aumentou em ET e apresentou correlação negativa com os níveis fecais de isobutirato (r = -0,250, P = 0,034). Após o ajuste de FDR, apenas a correlação entre *Faecalibacterium*, *Catenibacter* e AGCC permaneceu significativa (P ≤ 0,045) (Fig. 4 e Tabela Suplementar 5).
Análise de correlação entre tremor essencial (TE) e controles saudáveis ​​(CS). Após ajuste de FDR, a abundância de Faecalibacterium (associada positivamente ao butirato) e Streptobacterium (associada positivamente ao propionato, butirato e isobutirato) foi reduzida em pacientes com TE e associada positivamente aos níveis fecais de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC). b Análise de correlação entre TE e doença de Parkinson (DP). Após ajuste de FDR, nenhuma associação significativa foi encontrada. TE: tremor essencial; DP: doença de Parkinson; CS: controle saudável; AGCC. Diferenças significativas são indicadas por *P < 0,05 e **P < 0,01.
Ao analisar ET versus PD, observou-se um aumento de Clostridium trichophyton em ET, correlacionando-se com o ácido isovalérico fecal (r = -0,238, P = 0,041) e o ácido isobutírico (r = -0,257, P = 0,027). Após o ajuste de FDR, ambos permaneceram significativos (P ≥ 0,295) (Figura 4 e Tabela Suplementar 5).
Este estudo abrangente examina os níveis fecais de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e os correlaciona com alterações na microbiota intestinal e na gravidade dos sintomas em pacientes com tremor essencial (TE) em comparação com pacientes com urticária crônica (UC) e doença de Parkinson (DP). Constatamos que os níveis fecais de AGCC estavam reduzidos em pacientes com TE e associados à gravidade clínica e a alterações específicas na microbiota intestinal. Os níveis fecais cumulativos de AGCC diferenciam o TE da UC e da DP.
Em comparação com pacientes com câncer gástrico (CG), pacientes com trombocitemia essencial (TE) apresentam níveis fecais mais baixos de ácidos propiônico, butírico e isobutírico. A combinação desses ácidos diferenciou TE de controles saudáveis ​​(CS) com uma AUC de 0,751 (IC 95%: 0,634–0,867), sensibilidade de 74,3% e especificidade de 72,9%, indicando seu potencial como biomarcadores diagnósticos para o diagnóstico de TE. Análises adicionais mostraram que os níveis fecais de ácido propiônico apresentaram correlação negativa com o escore de Wexner e o escore SCOPA-AUT. Os níveis fecais de ácido isobutírico apresentaram correlação inversa com os escores FTM. Por outro lado, a redução nos níveis de butirato em pacientes com TE foi associada à diminuição da abundância de microbiota produtora de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), Faecalibacterium e Categorybacter. Além disso, a redução na abundância de Catenibacter em ET também foi associada à redução nos níveis fecais de ácido propiônico e isobutírico.
A maioria dos AGCCs produzidos no cólon é absorvida pelos colonócitos principalmente por meio de transportadores de monocarboxilatos dependentes de H+ ou sódio. Os ácidos graxos de cadeia curta absorvidos são utilizados como fonte de energia para os colonócitos, enquanto aqueles que não são metabolizados nos colonócitos são transportados para a circulação portal¹⁸. Os AGCCs podem influenciar a motilidade intestinal, melhorar a função da barreira intestinal e influenciar o metabolismo e a imunidade do hospedeiro¹⁹. Foi constatado anteriormente que as concentrações fecais de butirato, acetato e propionato estavam reduzidas em pacientes com DP em comparação com controles saudáveis¹⁷, o que está de acordo com nossos resultados. Nosso estudo encontrou uma diminuição nos AGCCs em pacientes com TE, mas pouco se sabe sobre o papel dos AGCCs na patologia da TE. O butirato e o propionato podem se ligar a GPCRs e influenciar a sinalização dependente de GPCR, como a sinalização de MAPK e NF-κB20. O conceito básico do eixo intestino-cérebro é que os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) secretados por microrganismos intestinais podem influenciar a sinalização do hospedeiro, afetando, assim, as funções intestinal e cerebral. Como o butirato e o propionato têm potentes efeitos inibitórios sobre a atividade da histona desacetilase (HDAC)²¹ e o butirato também pode atuar como ligante para fatores de transcrição, eles exercem amplos efeitos sobre o metabolismo, a diferenciação e a proliferação do hospedeiro, principalmente devido à sua influência na regulação gênica²². Com base em evidências sobre AGCC e doenças neurodegenerativas, o butirato é considerado um candidato terapêutico devido à sua capacidade de corrigir a atividade prejudicada da HDAC, que pode mediar a morte de neurônios dopaminérgicos na doença de Parkinson^23,24,25. Estudos em animais também demonstraram a capacidade do ácido butírico de prevenir a degeneração de neurônios dopaminérgicos e melhorar distúrbios do movimento em modelos de doença de Parkinson^26,27. O ácido propiônico demonstrou limitar as respostas inflamatórias e proteger a integridade da barreira hematoencefálica^28,29. Estudos demonstraram que o ácido propiônico promove a sobrevivência de neurônios dopaminérgicos em resposta à toxicidade da rotenona em modelos de DP 30 e que a administração oral de ácido propiônico reverte a perda de neurônios dopaminérgicos e os déficits motores em camundongos com DP 31. Pouco se sabe sobre a função do ácido isobutírico. No entanto, um estudo recente descobriu que a colonização de camundongos com B. ovale aumentou o conteúdo intestinal de AGCC (incluindo acetato, propionato, isobutirato e isovalerato) e a concentração intestinal de GABA, destacando que uma ligação foi estabelecida entre a microbiota intestinal e as concentrações intestinais de AGCC. 32. Na TE, as alterações patológicas anormais no cerebelo incluem alterações nos axônios e dendritos das células de Purkinje, deslocamento e perda de células de Purkinje, alterações nos axônios das células em cesto, anormalidades nas conexões das fibras ascendentes com a distribuição das células de Purkinje e alterações nos receptores de GABA no osso dentado. núcleos, o que leva a uma diminuição na produção GABAérgica do cerebelo3,4,33. Permanece incerto se os AGCC estão associados à neurodegeneração das células de Purkinje e à diminuição da produção de GABA cerebelar. Nossos resultados sugerem uma forte associação entre AGCC e TE, mas o desenho transversal do estudo não permite conclusões sobre a relação causal entre AGCC e o processo da doença de TE; são necessários mais estudos longitudinais de acompanhamento, incluindo medições seriadas de AGCC fecais, bem como estudos em animais que examinem os mecanismos.
Acredita-se que os AGCC (ácidos graxos de cadeia curta) estimulem a contratilidade da musculatura lisa do cólon34. A deficiência de AGCC agrava os sintomas da constipação, e a suplementação com AGCC pode melhorá-los35. Nossos resultados também indicam uma associação significativa entre a diminuição do conteúdo fecal de AGCC e o aumento da constipação e da disfunção autonômica em pacientes com tremor essencial. Um relato de caso demonstrou que o transplante de microbiota melhorou tanto o tremor essencial quanto a síndrome do intestino irritável no paciente 7, sugerindo ainda mais uma estreita relação entre a microbiota intestinal e o tremor essencial. Portanto, acreditamos que os AGCC/microbiota fecal podem influenciar a motilidade intestinal do hospedeiro e a função do sistema nervoso autônomo.
O estudo constatou que a diminuição dos níveis de AGCC fecais em pacientes com tremor essencial (TE) estava associada à diminuição da abundância de Faecalibacterium (associado ao butirato) e Streptobacterium (associado ao propionato, butirato e isobutirato). Após a correção de FDR, essa relação permaneceu significativa. Faecalibacterium e Streptobacterium são microrganismos produtores de AGCC. Sabe-se que Faecalibacterium é um microrganismo produtor de butirato36, enquanto os principais produtos da fermentação de Catenibacter são acetato, butirato e ácido lático37. Faecalibacterium foi detectado em 100% dos grupos TE e controle saudável (CS); a abundância relativa mediana no grupo TE foi de 2,06% e no grupo CS foi de 3,28% (LDA 3,870). A bactéria da categoria foi detectada em 21,6% (8/37) das amostras do grupo CS e em apenas 1 amostra do grupo TE (1/35). A diminuição e a indetectabilidade de estreptobactérias na ET também podem indicar uma correlação com a patogenicidade da doença. A abundância relativa mediana de espécies de Catenibacter no grupo HC foi de 0,07% (LDA 2,129). Além disso, as bactérias do ácido lático foram associadas a alterações no butirato fecal (P=0,016, P=0,096 após ajuste de FDR), e o Candidatus Arthromitus foi associado a alterações no isobutirato (P=0,016, P=0,072 após ajuste de FDR). Após a correção de FDR, apenas a tendência de correlação permanece, que não é estatisticamente significativa. Os lactobacilos também são conhecidos por serem produtores de AGCC (ácido acético, ácido propiônico, ácido isobutírico, ácido butírico)³⁸ e o Candidatus Arthromitus é um indutor específico da diferenciação de células T auxiliares 17 (Th17), com Th1/2 e Tregs associados ao equilíbrio imunológico/Th17³⁹. Um estudo recente sugere que níveis elevados de pseudoartrite fecal podem contribuir para a inflamação colônica, disfunção da barreira intestinal e inflamação sistêmica⁴⁰. Os níveis de Clostridium trichoides estavam aumentados em pacientes com tremor essencial (TE) em comparação com pacientes com doença de Parkinson (DP). A abundância de Clostridium trichoides apresentou correlação negativa com o ácido isovalérico e o ácido isobutírico. Após o ajuste de FDR, ambos permaneceram significativos (P≥0,295). Clostridium pilosum é uma bactéria conhecida por estar associada à inflamação e pode contribuir para a disfunção da barreira intestinal⁴¹. Nosso estudo anterior relatou alterações na microbiota intestinal de pacientes com TE⁸. Aqui, também relatamos alterações nos ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) em pacientes com TE e identificamos uma associação entre disbiose intestinal e alterações nos AGCC. Níveis reduzidos de AGCC estão intimamente associados à disbiose intestinal e à gravidade do tremor em pacientes com TE. Nossos resultados sugerem que o eixo intestino-cérebro pode desempenhar um papel importante na patogênese do TE, mas são necessários mais estudos em modelos animais.
Em comparação com pacientes com doença de Parkinson (DP), pacientes com trombocitemia essencial (TE) apresentam níveis mais baixos de ácidos isovalérico e isobutírico nas fezes. A combinação de ácido isovalérico e ácido isobutírico identificou TE em pacientes com DP com uma AUC de 0,743 (IC 95%: 0,629–0,857), sensibilidade de 74,3% e especificidade de 62,9%, sugerindo seu potencial como biomarcadores no diagnóstico diferencial de TE. Os níveis fecais de ácido isovalérico apresentaram correlação inversa com os escores FTM e TETRAS. Os níveis fecais de ácido isobutírico também apresentaram correlação inversa com os escores FTM. A diminuição dos níveis de ácido isobutírico foi associada à redução da abundância de catecobactérias. Pouco se sabe sobre as funções dos ácidos isovalérico e isobutírico. Um estudo anterior mostrou que a colonização de camundongos com B. ovale aumentou a quantidade de AGCC intestinais (incluindo acetato, propionato, isobutirato e isovalerato) e as concentrações intestinais de GABA, destacando a ligação intestinal entre a microbiota e as concentrações intestinais de AGCC/neurotransmissores32. Curiosamente, os níveis de ácido isobutírico observados foram semelhantes entre os grupos DP e HC, mas diferiram entre os grupos TE e DP (ou HC). O ácido isobutírico foi capaz de distinguir entre TE e DP com uma AUC de 0,718 (IC 95%: 0,599–0,836) e identificar TE e NC com uma AUC de 0,655 (IC 95%: 0,525–0,786). Além disso, os níveis de ácido isobutírico correlacionam-se com a gravidade do tremor, reforçando ainda mais sua associação com o TE. A questão de saber se o ácido isobutírico oral pode reduzir a gravidade do tremor em pacientes com TE merece estudos adicionais.
Assim, o conteúdo fecal de AGCC está reduzido em pacientes com TE e está associado à gravidade clínica da TE e a alterações específicas na microbiota intestinal. Propionato, butirato e isobutirato fecais podem ser biomarcadores diagnósticos para TE, enquanto isobutirato e isovalerato podem ser biomarcadores diagnósticos diferenciais para TE. Alterações no isobutirato fecal podem ser mais específicas para TE do que alterações em outros AGCC.
Nosso estudo apresenta algumas limitações. Primeiro, padrões alimentares e preferências alimentares podem influenciar a expressão da microbiota; são necessárias amostras maiores em diferentes populações, e estudos futuros devem incluir levantamentos dietéticos abrangentes e sistemáticos, como questionários de frequência alimentar. Segundo, o desenho transversal do estudo impede quaisquer conclusões sobre uma relação causal entre os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e o processo da doença de tremor essencial (TE). São necessários estudos de acompanhamento de longo prazo com medições seriadas de AGCC fecais. Terceiro, a capacidade diagnóstica e de diagnóstico diferencial dos níveis de AGCC fecais deve ser validada utilizando amostras independentes de pacientes com TE, controles saudáveis ​​(CS) e pacientes com doença de Parkinson (DP). Mais amostras de fezes independentes devem ser testadas no futuro. Por fim, os pacientes com DP em nossa coorte apresentaram duração da doença significativamente menor do que os pacientes com TE. O pareamento entre os grupos TE, DP e CS foi feito principalmente por idade, sexo e índice de massa corporal (IMC). Dada a diferença na evolução da doença entre o grupo TE e o grupo DP, também estudamos 33 pacientes com DP inicial e 16 pacientes com TE (duração da doença ≤ 3 anos) para comparação adicional. As diferenças entre os grupos em relação aos ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) foram geralmente consistentes com nossos dados primários. Além disso, não encontramos correlação entre a duração da doença e as alterações nos AGCC. No entanto, no futuro, seria melhor recrutar pacientes com doença de Parkinson (DP) e trombocitemia essencial (TE) em um estágio inicial, com menor duração da doença, para completar a validação em uma amostra maior.
O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Ruijin, afiliado à Escola de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai (RHEC2018-243). O consentimento livre e esclarecido por escrito foi obtido de todos os participantes.
Entre janeiro de 2019 e dezembro de 2022, 109 indivíduos (37 com tremor essencial [TE], 37 com doença de Parkinson [DP] e 35 controles saudáveis ​​[CS]) da Clínica do Centro de Distúrbios do Movimento do Hospital Ruijin, afiliado à Escola de Medicina da Universidade Jiao Tong de Xangai, foram incluídos neste estudo. Os critérios de inclusão foram: (1) idade entre 25 e 85 anos; (2) diagnóstico de TE de acordo com os critérios do Grupo de Trabalho da MDS⁴² e diagnóstico de DP de acordo com os critérios da MDS⁴³; (3) todos os pacientes não estavam em uso de medicamentos antiparkinsonianos antes da coleta das amostras; (4) o grupo com TE utilizava apenas betabloqueadores ou nenhum medicamento relacionado antes da coleta das amostras de fezes. Indivíduos CS pareados por idade, sexo e índice de massa corporal (IMC) também foram selecionados. Os critérios de exclusão foram: (1) vegetarianos, (2) má nutrição, (3) doenças crônicas do trato gastrointestinal (incluindo doença inflamatória intestinal, úlceras gástricas ou duodenais), (4) doenças crônicas graves (incluindo tumores malignos), insuficiência cardíaca, insuficiência renal, doenças hematológicas), (5) histórico de cirurgia gastrointestinal de grande porte, (6) consumo crônico ou regular de iogurte, (7) uso de probióticos ou antibióticos por 1 mês, (8) uso crônico de corticosteroides, inibidores da bomba de prótons, estatinas, metformina, imunossupressores ou medicamentos anticancerígenos e (9) comprometimento cognitivo grave que interfira nos ensaios clínicos.
Todos os participantes forneceram histórico médico, informações de peso e altura para o cálculo do IMC e foram submetidos a exame neurológico e avaliação clínica, incluindo a Escala de Ansiedade de Hamilton (HAMA) 44, a Escala de Depressão de Hamilton-17 (HAMD-17) 45, a gravidade da constipação utilizando a Escala de Constipação de Wexner 46 e a Escala de Fezes de Bristol 47, e o desempenho cognitivo utilizando o Mini Exame do Estado Mental (MEEM) 48. A Escala para Avaliação dos Sintomas Autonômicos da Doença de Parkinson (SCOPA-AUT) 49 examinou a disfunção autonômica em pacientes com tremor essencial (TE) e doença de Parkinson (DP). A Escala de Avaliação Clínica do Tremor de Fana-Tolos-Marin (FTM) e a Escala de Avaliação do Tremor Essencial (TETRAS) 50 do Grupo de Estudo do Tremor (TRG) 50 foram examinadas em pacientes com TE; a Escala de Avaliação da Doença de Kinson (MDS), patrocinada pela Associação Unida da Doença de Parkinson; Foram examinadas as versões 51 da UPDRS e 52 da escala de Hoehn e Yahr (HY).
Cada participante foi instruído a coletar uma amostra de fezes pela manhã, utilizando um recipiente para coleta de fezes. Os recipientes foram transferidos para gelo e armazenados a -80 °C antes do processamento. A análise de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) foi realizada de acordo com os procedimentos de rotina da Tiangene Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. Foram coletados 400 mg de amostras fecais frescas de cada participante e analisadas quanto à presença de AGCC após trituração e sonicação. Os AGCC selecionados nas fezes foram analisados ​​por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) e cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em tandem (CL-EM/EM).
O DNA foi extraído de amostras de 200 mg utilizando o kit QIAamp® Fast DNA Stool Mini (QIAGEN, Hilden, Alemanha), seguindo as instruções do fabricante. A composição microbiana foi determinada pelo sequenciamento do gene 16S rRNA no DNA isolado das fezes, através da amplificação da região V3-V4. O DNA foi analisado por eletroforese em gel de agarose a 1,2%. A amplificação por PCR do gene 16S rRNA foi realizada utilizando primers universais para bactérias (357 F e 806 R) e uma biblioteca de amplicons em duas etapas, construída na plataforma Novaseq.
As variáveis ​​contínuas são expressas como média ± desvio padrão, e as variáveis ​​categóricas são expressas como números e porcentagens. Utilizamos o teste de Levene para verificar a homogeneidade das variâncias. As comparações foram realizadas utilizando testes t bicaudais ou análise de variância (ANOVA) se as variáveis ​​apresentassem distribuição normal, e testes não paramétricos de Mann-Whitney U se as premissas de normalidade ou homocedasticidade fossem violadas. Utilizamos a área sob a curva ROC (AUC) para quantificar o desempenho diagnóstico do modelo e examinar a capacidade dos ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) em distinguir pacientes com tremor essencial (TE) daqueles com controles saudáveis ​​(CS) ou doença de Parkinson (DP). Para examinar a relação entre AGCC e gravidade clínica, utilizamos a análise de correlação de Spearman. A análise estatística foi realizada utilizando o software SPSS (versão 22.0; SPSS Inc., Chicago, IL) com nível de significância (incluindo valor de p e FDR-p) definido em 0,05 (bicaudal).
As sequências de 16S foram analisadas utilizando uma combinação dos softwares Trimmomatic (versão 0.35), Flash (versão 1.2.11), UPARSE (versão v8.1.1756), mothur (versão 1.33.3) e R (versão 3.6.3). Os dados brutos do gene 16S rRNA foram processados ​​utilizando o UPARSE para gerar unidades taxonômicas operacionais (OTUs) com 97% de identidade. As taxonomias foram especificadas utilizando o banco de dados Silva 128 como referência. O nível genérico dos dados de abundância relativa foi selecionado para análises posteriores. A análise de tamanho do efeito por análise discriminante linear (LDA LEfSE) foi utilizada para comparações entre os grupos (ET vs. HC, ET vs. PD) com um limiar α de 0,05 e um limiar de tamanho do efeito de 2,0. Os gêneros discriminantes identificados pela análise LEfSE foram posteriormente utilizados para a análise de correlação de Spearman dos ácidos graxos de cadeia curta (AGCC).
Para obter mais informações sobre o desenho do estudo, consulte o Resumo do Relatório de Pesquisa Natural associado a este artigo.
Os dados brutos de sequenciamento 16S estão armazenados no banco de dados BioProject do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) (SRP438900: PRJNA974928), URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/study/?acc=SRP438900&o.=acc_s%3Aa. Outros dados relevantes estão disponíveis ao autor correspondente mediante solicitação razoável, como colaborações científicas e intercâmbios acadêmicos relacionados a projetos de pesquisa completos. A transferência de dados para terceiros sem o nosso consentimento não é permitida.
Código aberto disponível apenas com uma combinação de Trimmomatic (versão 0.35), Flash (versão 1.2.11), UPARSE (versão v8.1.1756), mothur (versão 1.33.3) e R (versão 3.6.3), utilizando as configurações padrão ou a seção “Método”. Informações adicionais podem ser fornecidas ao autor correspondente mediante solicitação razoável.
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