Endereço atual: Colônia 50931, Alemanha, Cluster de Excelência em Pesquisa sobre Resposta ao Estresse Celular em Doenças Relacionadas ao Envelhecimento (CECAD).
A neurodegeneração associada a doenças mitocondriais é considerada irreversível devido à limitada plasticidade metabólica dos neurônios, mas o efeito da disfunção mitocondrial na autonomia do metabolismo neuronal no organismo ainda é pouco compreendido. Neste estudo, apresentamos o proteoma específico de neurônios de Purkinje com deficiência progressiva de fosforilação oxidativa (OXPHOS) causada pela interrupção da dinâmica de fusão mitocondrial. Observamos que a disfunção mitocondrial desencadeia uma profunda alteração no campo da proteômica, que culmina na ativação sequencial de programas metabólicos específicos antes da morte celular. De forma inesperada, determinamos a indução significativa da piruvato carboxilase (PCx) e de outras enzimas antienvelhecimento que suplementam os intermediários do ciclo do ácido cítrico (ciclo de Krebs). A inibição da PCx exacerbou o estresse oxidativo e a neurodegeneração, indicando que a aterosclerose exerce um efeito protetor em neurônios com deficiência de OXPHOS. A restauração da fusão mitocondrial em neurônios em estágio terminal de degeneração reverte completamente essas características metabólicas, prevenindo, assim, a morte celular. Nossos resultados identificam vias até então desconhecidas que conferem resiliência à disfunção mitocondrial e mostram que a neurodegeneração pode ser revertida mesmo nos estágios avançados da doença.
O papel central das mitocôndrias na manutenção do metabolismo energético neuronal é enfatizado pelos extensos sintomas neurológicos associados a doenças mitocondriais humanas. A maioria dessas doenças é causada por mutações genéticas que regulam a expressão gênica mitocondrial (1, 2) ou pela destruição de genes relacionados à dinâmica mitocondrial, que afetam indiretamente a estabilidade do DNA mitocondrial (mtDNA) (3, 4). Estudos em modelos animais demonstraram que, em resposta à disfunção mitocondrial em tecidos adjacentes, vias metabólicas conservativas (5-7) podem ser ativadas, o que fornece informações importantes para uma compreensão aprofundada da patogênese dessas doenças complexas. Em contraste marcante, nossa compreensão das alterações metabólicas de tipos celulares específicos causadas pela falha generalizada na produção de adenosina trifosfato (ATP) mitocondrial cerebral é fundamental (8), enfatizando a necessidade de identificar alvos terapêuticos que possam ser utilizados para prevenir ou evitar a neurodegeneração (9). A lacuna de informação reside no fato de que as células nervosas são amplamente consideradas como tendo flexibilidade metabólica muito limitada em comparação com os tipos celulares dos tecidos circundantes (10). Considerando que essas células desempenham um papel central na coordenação do fornecimento de metabólitos aos neurônios para promover a transmissão sináptica e responder a lesões e doenças, a capacidade de adaptar o metabolismo celular às condições desafiadoras do tecido cerebral é quase que exclusivamente restrita às células da glia (11-14). Além disso, a heterogeneidade celular inerente ao tecido cerebral dificulta consideravelmente o estudo das alterações metabólicas que ocorrem em subgrupos neuronais específicos. Consequentemente, pouco se sabe sobre as consequências celulares e metabólicas exatas da disfunção mitocondrial em neurônios.
Para compreender as consequências metabólicas da disfunção mitocondrial, isolamos neurônios de Purkinje (NPs) em diferentes estágios de neurodegeneração causados ​​pela destruição da proteína de fusão da membrana externa mitocondrial (Mfn2). Embora mutações em Mfn2 em humanos estejam associadas a uma forma de neuropatia motora e sensorial hereditária conhecida como Charcot-Marie-Tooth tipo 2A (15), a destruição condicional de Mfn2 em camundongos é um método bem reconhecido para induzir disfunção da fosforilação oxidativa (OXPHOS). Os vários subtipos neuronais (16-19) e o fenótipo neurodegenerativo resultante são acompanhados por sintomas neurológicos progressivos, como distúrbios do movimento (18, 19) ou ataxia cerebelar (16). Utilizando uma combinação de proteômica quantitativa sem marcadores (LFQ), metabolômica, imagem e métodos virológicos, demonstramos que a neurodegeneração progressiva induz fortemente a expressão da piruvato carboxilase (PCx) e de outros fatores envolvidos na arteriosclerose de neurônios piramidais (NPs) in vivo. Para verificar a relevância dessa descoberta, reduzimos especificamente a expressão de PCx em NPs deficientes em Mfn2 e observamos que essa intervenção agravou o estresse oxidativo e acelerou a neurodegeneração, comprovando que a azoospermia confere adaptabilidade metabólica à morte celular. A superexpressão de MFN2 pode resgatar completamente NPs com degeneração terminal, deficiência grave de fosforilação oxidativa (OXPHOS), consumo massivo de DNA mitocondrial e rede mitocondrial aparentemente comprometida, o que reforça a ideia de que essa forma de neurodegeneração pode se recuperar mesmo em estágios avançados da doença, antes da morte celular.
Para visualizar as mitocôndrias em neurônios piramidais (PNs) com deleção do gene Mfn2, utilizamos uma linhagem de camundongos que permite que mitocôndrias dependentes de Cre direcionem a proteína fluorescente amarela (YFP) (mtYFP) (20) para a expressão de Cre e verificamos a morfologia mitocondrial in vivo. Descobrimos que a destruição do gene Mfn2 em PNs leva à divisão gradual da rede mitocondrial (Figura S1A), e a alteração mais precoce foi observada às 3 semanas de idade. Em contraste, a degeneração substancial da camada celular dos PNs, evidenciada pela perda da imunomarcação de calbindina, só começou às 12 semanas de idade (Figura 1, A e B). A discrepância temporal entre as primeiras alterações na morfologia mitocondrial e o início visível da morte neuronal nos levou a investigar as alterações metabólicas desencadeadas pela disfunção mitocondrial antes da morte celular. Desenvolvemos uma estratégia baseada em triagem celular por ativação de fluorescência (FACS) para isolar neurônios piramidais (PNs) que expressam YFP (YFP+) (Figura 1C) e em camundongos controle (Mfn2+/loxP::mtYFP loxP-stop-loxP::L7-cre), doravante denominados CTRL (Figura S1B). A otimização da estratégia de gating baseada na intensidade relativa do sinal de YFP nos permite purificar o corpo YFP+ (YFPhigh) dos PNs de células não-PNs (YFPneg) (Figura S1B) ou fragmentos putativos de axônios/dendríticos fluorescentes (YFPlow; Figura S1D, esquerda), confirmados por microscopia confocal (Figura S1D, direita). Para verificar a identidade da população classificada, realizamos proteômica LFQ e, em seguida, análise de componentes principais, e descobrimos que há uma clara separação entre as células YFPhigh e YFPneg (Figura S1C). As células YFPhigh apresentaram um enriquecimento líquido de marcadores conhecidos de neurônios de projeção (PNs) (ou seja, Calb1, Pcp2, Grid2 e Itpr3) (21, 22), mas nenhum enriquecimento de proteínas comumente expressas em neurônios ou outros tipos celulares (Figura 1D). Uma comparação entre amostras de células YFPhigh classificadas, coletadas em experimentos independentes, mostrou um coeficiente de correlação > 0,9, demonstrando boa reprodutibilidade entre as réplicas biológicas (Figura S1E). Em resumo, esses dados validaram nosso plano para o isolamento agudo e específico de PNs viáveis. Como o sistema de expressão gênica L7-cre utilizado induz recombinação em mosaico na primeira semana após o parto (23), iniciamos a seleção de camundongos dos grupos CTRL e condicional (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) para coleta de neurônios. Após a conclusão da recombinação, os camundongos são denominados Mfn2cKO com 4 semanas de idade. Como ponto final, escolhemos 8 semanas de idade, quando a camada PN estava intacta, apesar da evidente fragmentação mitocondrial (Figura 1B e Figura S1A). No total, quantificamos 3013 proteínas, das quais cerca de 22% foram baseadas em anotações do MitoCarta 2.0, com base no proteoma mitocondrial (Figura 1E) (24). A análise de expressão gênica diferencial realizada na 8ª semana mostrou que apenas 10,5% de todas as proteínas apresentaram alterações significativas (Figura 1F e Figura S1F), das quais 195 proteínas foram subexpressas e 120 proteínas foram superexpressas (Figura 1F). Vale ressaltar que a “análise de vias inovadoras” deste conjunto de dados mostra que os genes diferencialmente expressos pertencem principalmente a um conjunto restrito de vias metabólicas específicas (Figura 1G). Curiosamente, embora a regulação negativa de vias relacionadas à fosforilação oxidativa (OXPHOS) e à sinalização de cálcio confirme a indução de disfunção mitocondrial em neurônios piramidais com deficiência de fusão, outras categorias que envolvem principalmente o metabolismo de aminoácidos apresentam regulação positiva significativa, o que está de acordo com o metabolismo que ocorre na reconexão mitocondrial dos neurônios piramidais.
(A) Fotografias representativas de microscopia confocal de seções cerebelares de camundongos CTRL e Mfn2cKO mostrando perda progressiva de neurônios de Purkinje (calbindina, cinza); os núcleos foram corados com DAPI. (B) Quantificação de (A) (análise de variância de uma via, ***P<0,001; n = 4 a 6 círculos de três camundongos). (C) Fluxograma experimental. (D) Mapa de calor da distribuição de marcadores específicos para neurônios de Purkinje (superior) e outros tipos celulares (meio). (E) Diagrama de Venn mostrando o número de proteínas mitocondriais identificadas nos neurônios de Purkinje classificados. (F) Gráfico de vulcão das proteínas diferencialmente expressas em neurônios Mfn2cKO com 8 semanas (valor de corte de significância de 1,3). (G) A análise da via da criatividade mostra as cinco vias mais importantes de regulação positiva (vermelho) e negativa (azul) nos neurônios de Purkinje Mfn2cKO classificados com 8 semanas. O nível médio de expressão de cada proteína detectada é mostrado. Mapa de calor em tons de cinza: valor P ajustado. ns, não significativo.
Os dados proteômicos mostraram que a expressão proteica dos complexos I, III e IV diminuiu gradualmente. Os complexos I, III e IV continham subunidades essenciais codificadas pelo mtDNA, enquanto o complexo II, que era codificado apenas pelo núcleo, permaneceu basicamente inalterado (Figura 2A e Figura S2A). De acordo com os resultados proteômicos, a imuno-histoquímica de cortes de tecido cerebelar mostrou que o nível da subunidade MTCO1 (subunidade 1 da citocromo C oxidase mitocondrial) do complexo IV no PN diminuiu gradualmente (Figura 2B). A subunidade Mtatp8 codificada pelo mtDNA foi significativamente reduzida (Figura S2A), enquanto o nível em estado estacionário da subunidade da ATP sintase codificada pelo núcleo permaneceu inalterado, o que é consistente com a formação do complexo F1, um subconjunto estável da ATP sintase, quando a expressão do mtDNA é estável. Interrupção (7). A avaliação do nível de mtDNA em neurônios piramidais (PNs) Mfn2cKO selecionados por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR) confirmou a diminuição gradual no número de cópias de mtDNA. Comparado ao grupo controle, aos 8 semanas de idade, apenas cerca de 20% do nível de mtDNA foi retido (Figura 2C). De acordo com esses resultados, a coloração por microscopia confocal de PNs Mfn2cKO foi usada para detectar DNA, mostrando o consumo de nucleotídeos mitocondriais dependente do tempo (Figura 2D). Observamos que apenas alguns candidatos envolvidos na degradação de proteínas mitocondriais e na resposta ao estresse apresentaram regulação positiva, incluindo Lonp1, Afg3l2 e Clpx, e fatores de montagem do complexo OXPHOS. Nenhuma alteração significativa nos níveis de proteínas envolvidas na apoptose foi detectada (Figura S2B). Da mesma forma, observamos que os canais mitocondriais e do retículo endoplasmático envolvidos no transporte de cálcio apresentaram apenas pequenas alterações (Figura S2C). Além disso, a avaliação de proteínas relacionadas à autofagia não revelou alterações significativas, o que está de acordo com a indução visível de autofagossomos observada in vivo por imuno-histoquímica e microscopia eletrônica (Figura S3). No entanto, a disfunção progressiva da fosforilação oxidativa (OXPHOS) em neurônios piramidais (PNs) é acompanhada por alterações ultraestruturais mitocondriais evidentes. Aglomerados mitocondriais podem ser observados nos corpos celulares e nas árvores dendríticas de PNs Mfn2cKO com 5 e 8 semanas de idade, e a estrutura da membrana interna sofreu alterações profundas (Figura S4, A e B). Em consonância com essas alterações ultraestruturais e com a diminuição significativa do mtDNA, a análise de fatias cerebelares agudas com éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM) mostrou que o potencial da membrana mitocondrial em PNs Mfn2cKO estava significativamente reduzido (Figura S4C).
(A) Análise da evolução temporal do nível de expressão do complexo OXPHOS. Considerar apenas proteínas com P<0,05 em 8 semanas (ANOVA de duas vias). Linha pontilhada: Sem ajuste em comparação com o controle (CTRL). (B) Esquerda: Exemplo de uma secção cerebelar marcada com anticorpo anti-MTCO1 (barra de escala, 20 μm). A área ocupada pelos corpos celulares das células de Purkinje está indicada em amarelo. Direita: Quantificação dos níveis de MTCO1 (análise de variância de uma via; n = 7 a 20 células analisadas de três camundongos). (C) Análise de qPCR do número de cópias de mtDNA no PN isolado (análise de variância de uma via; n = 3 a 7 camundongos). (D) Esquerda: Exemplo de uma fatia cerebelar marcada com um anticorpo anti-DNA (barra de escala, 20 μm). A área ocupada pelos corpos celulares das células de Purkinje está indicada em amarelo. Direita: Quantificação de lesões no mtDNA (análise de variância de uma via; n = 5 a 9 células de três camundongos). (E) Exemplo de uma seção cerebelar aguda mostrando células de Purkinje mitoYFP+ ​​(seta) em um registro de patch clamp de célula inteira. (F) Quantificação da curva IV. (G) Registros representativos da injeção de corrente despolarizante em células de Purkinje CTRL e Mfn2cKO. Traçado superior: O primeiro pulso que desencadeou o potencial de ação (PA). Traçado inferior: Frequência máxima do PA. (H) Quantificação de entradas espontâneas pós-sinápticas (sPSPs). O traçado de registro representativo e sua ampliação são mostrados em (I). Análise de variância de uma via analisou n = 5 a 20 células de três camundongos. Os dados são expressos como média ± erro padrão da média (EPM); *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. (J) Traçados representativos de PA espontâneos registrados usando o modo de patch clamp perfurado. Traçado superior: Frequência máxima do PA. Traçado inferior: ampliação de um único PA. (K) Quantifique a frequência média e máxima do potencial de ação de acordo com (J). Teste de Mann-Whitney; n = 5 células foram analisadas de quatro camundongos. Os dados são expressos como média ± erro padrão da média (EPM); não significativo.
Danos evidentes à fosforilação oxidativa (OXPHOS) foram detectados em neurônios piramidais (PN) de camundongos Mfn2cKO de 8 semanas de idade, indicando que a função fisiológica desses neurônios está gravemente comprometida. Portanto, analisamos as características elétricas passivas de neurônios com deficiência em OXPHOS em 4 a 5 semanas e 7 a 8 semanas de idade, realizando registros de patch-clamp em fatias cerebelares agudas (Figura 2E). Inesperadamente, o potencial de membrana em repouso médio e a resistência de entrada dos neurônios Mfn2cKO foram semelhantes aos do controle, embora houvesse diferenças sutis entre as células (Tabela 1). Da mesma forma, em 4 a 5 semanas de idade, não foram encontradas alterações significativas na relação corrente-tensão (curva IV) (Figura 2F). No entanto, nenhum neurônio Mfn2cKO de 7 a 8 semanas de idade sobreviveu ao regime IV (etapa de hiperpolarização), indicando que há uma clara sensibilidade ao potencial de hiperpolarização nesse estágio tardio. Em contraste, nos neurônios Mfn2cKO, as correntes despolarizantes que causam descargas repetitivas de potencial de ação (PA) são bem toleradas, indicando que seus padrões gerais de descarga não são significativamente diferentes daqueles dos neurônios controle de 8 semanas (Tabela 1 e Figura 2G). Da mesma forma, a frequência e a amplitude das correntes pós-sinápticas espontâneas (CPSs) foram comparáveis ​​às do grupo controle, e a frequência dos eventos aumentou de 4 para 5 semanas, para 7 para 8 semanas, com um aumento similar (Figura 2, H e I). O período de maturação sináptica nos neurônios piramidais (PNs) (25). Resultados semelhantes foram obtidos após a perfuração dos PNs. Essa configuração impede a possível compensação de defeitos de ATP celular, como poderia ocorrer na gravação de patch clamp de célula inteira. Em particular, o potencial de membrana em repouso e a frequência de disparo espontâneo dos neurônios Mfn2cKO não foram afetados (Figura 2, J e K). Em resumo, esses resultados indicam que os neurônios piramidais com disfunção evidente da fosforilação oxidativa conseguem lidar bem com padrões de descarga de alta frequência, sugerindo a existência de um mecanismo de compensação que lhes permite manter respostas eletrofisiológicas próximas do normal.
Os dados são expressos como média ± erro padrão da média (análise de variância de uma via, teste de comparações múltiplas de Holm-Sidak; *P<0,05). O número da unidade é indicado entre parênteses.
Nosso objetivo foi investigar se alguma categoria no conjunto de dados proteômicos (Figura 1G) inclui vias que podem neutralizar a deficiência grave de fosforilação oxidativa (OXPHOS), explicando assim por que os neurônios periféricos afetados podem manter uma eletrofisiologia quase normal (Figura 2, E a K). A análise proteômica mostrou que as enzimas envolvidas no catabolismo de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) estavam significativamente superexpressas (Figura 3A e Figura S5A), e o produto final acetil-CoA (CoA) ou succinil-CoA pode suplementar os tricarboxilatos no ciclo do ácido tricarboxílico (TCA). Descobrimos que o conteúdo de transaminase 1 de BCAA (BCAT1) e BCAT2 aumentou. Elas catalisam a primeira etapa do catabolismo de BCAA, gerando glutamato a partir de α-cetoglutarato (26). Todas as subunidades que compõem o complexo da desidrogenase de cetoácidos de cadeia ramificada (BCKD) estão superexpressas (o complexo catalisa a descarboxilação subsequente e irreversível do esqueleto de carbono do BCAA resultante) (Figura 3A e Figura S5A). No entanto, nenhuma alteração óbvia no próprio BCAA foi encontrada nos PNs selecionados, o que pode ser devido ao aumento da captação celular desses aminoácidos essenciais ou ao uso de outras fontes (glicose ou ácido lático) para complementar o ciclo do TCA (Figura S5B). Os PNs sem fosforilação oxidativa (OXPHOS) também apresentaram aumento na decomposição da glutamina e nas atividades de transaminação às 8 semanas de idade, o que pode ser refletido pela superexpressão das enzimas mitocondriais glutaminase (GLS) e glutamina piruvato transaminase 2 (GPT2) (Figura 3, A e C). Vale ressaltar que a regulação positiva de GLS é limitada à isoforma clivada da glutaminase C (GLS-GAC) (a mudança de Mfn2cKO/CTRL é de aproximadamente 4,5 vezes, P = 0,05), e sua regulação positiva específica em tecidos cancerosos pode sustentar a bioenergia mitocondrial. (27).
(A) O mapa de calor mostra a variação na concentração de proteína para a via especificada em 8 semanas. (B) Exemplo de uma fatia cerebelar marcada com anticorpo anti-PCx (barra de escala, 20 μm). A seta amarela aponta para o corpo celular de Purkinje. (C) Análise da expressão proteica ao longo do tempo, identificada como um importante candidato para aterosclerose (teste t múltiplo, *FDR <5%; n = 3-5 camundongos). (D) Acima: Diagrama esquemático mostrando as diferentes vias de entrada do carbono marcado contido no traçador [1-13C]piruvato (ou seja, via PDH ou via transarterial). Abaixo: O gráfico de violino mostra a porcentagem de carbono marcado individualmente (M1) convertido em ácido aspártico, ácido cítrico e ácido málico após a marcação de fatias cerebelares agudas com [1-13C]piruvato (teste t pareado; ** P <0,01). (E) Análise abrangente da evolução temporal da via indicada. Considere apenas proteínas com P<0,05 em 8 semanas. Linha tracejada: sem valor de ajuste (análise de variância de duas vias; * P <0,05; *** P <0,001). Os dados são expressos como média ± erro padrão da média (EPM).
Em nossa análise, o catabolismo de BCAA tornou-se uma das principais vias de regulação positiva. Esse fato sugere fortemente que o volume de ventilação que entra no ciclo do TCA pode ser alterado em PN com deficiência de OXPHOS. Isso pode representar uma importante forma de reprogramação metabólica neuronal, que pode ter um impacto direto na fisiologia e sobrevivência neuronal durante a manutenção de uma disfunção grave de OXPHOS. De acordo com essa hipótese, descobrimos que a principal enzima antiaterosclerótica PCx está regulada positivamente (Mfn2cKO/CTRL muda aproximadamente 1,5 vezes; Figura 3A), que catalisa a conversão de piruvato em oxaloacetato (28), cuja expressão é considerada restrita a astrócitos no tecido cerebral (29, 30). Em consonância com os resultados da proteômica, a microscopia confocal mostrou que a expressão de PCx estava especificamente e significativamente aumentada em neurônios piramidais deficientes em fosforilação oxidativa (OXPHOS), enquanto a reatividade de PCx estava principalmente restrita às células gliais de Bergmann adjacentes no controle (Figura 3B). Para testar funcionalmente a regulação positiva observada de PCx, tratamos fatias cerebelares agudas com o traçador [1-13C]piruvato. Quando o piruvato foi oxidado pela piruvato desidrogenase (PDH), seu marcador isotópico desapareceu, mas foi incorporado aos intermediários do ciclo do TCA quando o piruvato foi metabolizado por reações vasculares (Figura 3D). Em apoio aos nossos dados de proteômica, observamos um grande número de marcadores desse traçador no ácido aspártico das fatias de Mfn2cKO, enquanto o ácido cítrico e o ácido málico também apresentaram uma tendência moderada, embora não significativa (Figura 3D).
Nos neurônios dopaminérgicos de camundongos MitoPark com disfunção mitocondrial causada pela destruição específica do gene do fator de transcrição mitocondrial A (Tfam) pelos neurônios dopaminérgicos (Figura S6B), a expressão de PCx também foi significativamente aumentada (31), indicando que a ocorrência da arteriosclerose ácida acética é regulada durante a disfunção da fosforilação oxidativa neuronal (OXPHOS) no organismo. Vale ressaltar que foi constatado que enzimas específicas (32-34) que podem ser expressas em neurônios associados à arteriosclerose são significativamente superexpressas em neurônios piramidais (PNs) com deficiência em OXPHOS, como a propionil-CoA carboxilase (PCC-A), a malonil-CoA que converte propionil-CoA em succinil-CoA e a enzima málica mitocondrial 3 (ME3), cuja principal função é recuperar piruvato a partir de malato (Figura 3, A e C) (33, 35). Além disso, observamos um aumento significativo na enzima Pdk3, que fosforila e, portanto, inativa a PDH (36), enquanto nenhuma alteração foi detectada na enzima Pdp1, que ativa a PDH, ou no próprio complexo enzimático da PDH (Figura 3A). De forma consistente, em PNs Mern2cKO, a fosforilação da subunidade α1 (PDHE1α) do componente E1 da piruvato desidrogenase do complexo PDH em Ser293 (conhecido por inibir a atividade enzimática da PDH) foi aumentada (Figura S6C). O piruvato não possui acesso vascular.
Finalmente, descobrimos que a supervia de biossíntese de serina e glicina, o ciclo mitocondrial do folato (1C) relacionado e a biossíntese de prolina (Figura 1G e Figura S5C) são todos significativamente regulados positivamente, de acordo com relatos, durante o processo de ativação. Os tecidos circundantes são ativados com disfunção mitocondrial (5-7). A análise confocal, corroborando esses dados proteômicos, mostrou que, em PN com OXPHOS ausente, fatias cerebelares de camundongos de 8 semanas de idade foram submetidas a uma resposta imune significativa à serina hidroximetiltransferase 2 (SHMT2), uma enzima chave do ciclo mitocondrial do folato (Figura S5D). Em fatias cerebelares agudas incubadas com 13 CU-glicose, experimentos de rastreamento metabólico confirmaram ainda mais a regulação positiva da biossíntese de serina e prolina, indicando que o fluxo de isoformas de carbono em serina e prolina aumentou (Figura S5E). Como as reações promovidas por GLS e GPT2 são responsáveis ​​pela síntese de glutamato a partir de glutamina e pela transaminação entre glutamato e α-cetoglutarato, sua regulação positiva indica que os neurônios deficientes em fosforilação oxidativa (OXPHOS) apresentam uma demanda aumentada por glutamato. Isso pode ter como objetivo manter a biossíntese aumentada de prolina (Figura S5C). Em contraste com essas alterações, uma análise proteômica de astrócitos cerebelares de camundongos Mfn2cKO específicos para PN mostrou que essas vias (incluindo todas as antiperoxidases) não apresentaram alterações significativas na expressão, demonstrando, assim, que esse redirecionamento metabólico é seletivo para PN degradado (Fig. S6, D a G).
Em resumo, essas análises revelaram padrões significativamente diferentes de ativação temporal de vias metabólicas específicas em neurônios piramidais (PNs). Embora a função mitocondrial neuronal anormal possa levar à aterosclerose precoce e à remodelação do ciclo do ácido cítrico (Figura 3E e Figura S5C), e até mesmo a alterações previsíveis na expressão dos complexos I e IV, as alterações na síntese de novo de serina só se tornam aparentes nos estágios finais da disfunção da fosforilação oxidativa (OXPHOS) (Figura 3E e Figura S5C). Esses achados definem um processo sequencial no qual a resposta mitocondrial (ciclo do ácido cítrico) e citoplasmática (biossíntese de serina) induzida pelo estresse atua sinergicamente com o aumento da aterosclerose no ciclo do ácido cítrico para remodelar o metabolismo neuronal.
Os neurônios piramidais (PNs) deficientes em fosforilação oxidativa (OXPHOS) com 8 semanas de idade conseguem manter uma atividade de excitação de alta frequência e sofrer uma reconexão metabólica significativa para compensar a disfunção mitocondrial. Essa descoberta levanta a interessante possibilidade de que, mesmo nesse momento, essas células possam receber intervenção terapêutica para retardar ou prevenir a neurodegeneração tardia. Investigamos essa possibilidade por meio de duas intervenções independentes. No primeiro método, desenvolvemos um vetor de vírus adeno-associado (AAV) dependente de Cre para que a MFN2 possa ser expressa seletivamente em PNs deficientes em OXPHOS in vivo (Figura S7A). O AAV codificando MFN2 e o gene repórter fluorescente mCherry (Mfn2-AAV) foram verificados em culturas primárias de neurônios in vitro, o que resultou na expressão de MFN2 de maneira dependente de Cre e na recuperação da morfologia mitocondrial, prevenindo assim a neuromutação em neurônios Mfn2cKO (Figura S7, B, D e E). Em seguida, realizamos experimentos in vivo para administrar estereotaticamente AAV-Mfn2 de 8 semanas de idade ao córtex cerebelar de camundongos Mfn2cKO e de controle, e analisamos camundongos de 12 semanas de idade (Figura 4A). Os camundongos Mfn2cKO tratados morreram (Figura 1, A e B) (16). A transdução viral in vivo resultou na expressão seletiva de neurônios de projeção (PN) em alguns círculos cerebelares (Figura S7, G e H). A injeção do AAV de controle expressando apenas mCherry (Ctrl-AAV) não teve efeito significativo no grau de neurodegeneração em animais Mfn2cKO. Em contraste, a análise de Mfn2cKOs transduzidos com AAV-Mfn2 mostrou um efeito protetor significativo na camada de células PN (Figura 4, B e C). Em particular, a densidade neuronal parece ser quase indistinguível da dos animais de controle (Figura 4, B e C, e Figura S7, H e I). A expressão de MFN1, mas não de MFN2, é igualmente eficaz na prevenção da morte neuronal (Figura 4C e Figura S7, C e F), o que indica que a expressão ectópica de MFN1 pode suprir eficazmente a deficiência de MFN2. Análises adicionais em nível de neurônios piramidais (PN) individuais mostraram que o Mfn2-AAV recuperou em grande parte a ultraestrutura das mitocôndrias, normalizou os níveis de mtDNA e reverteu a alta expressão do marcador antiangiogênico PCx (Figura 4, C a E). A inspeção visual dos camundongos Mfn2cKO recuperados, em repouso, mostrou melhora na postura e nos sintomas motores (movimentos S1 a S3). Em conclusão, esses experimentos demonstram que a reintrodução tardia de MFN2 em PNs com deficiência grave em fosforilação oxidativa (OXPHOS) é suficiente para reverter o consumo de mtDNA e induzir aterosclerose, prevenindo, assim, a degeneração axonal e a morte neuronal in vivo.
(A) Esquema mostrando o cronograma experimental para injeção de AAV codificando MFN2 quando a via metabólica indicada é ativada. (B) Imagens representativas de microscopia confocal de fatias cerebelares de camundongos Mfn2cKO de 12 semanas de idade, transduzidas às 8 semanas e marcadas com anticorpo anti-calbindina. Direita: Escala das fibras axonais. A escala do zoom do axônio é de 450 e 75 μm. (C) Esquerda: Quantificação da densidade de células de Purkinje no circuito de transdução de AAV (AAV+) (análise de variância de uma via; n = 3 camundongos). Direita: Análise de focos de mtDNA em neurônios de Purkinje transduzidos na semana 12 (teste t não pareado; n = 6 células de três camundongos). * P < 0,05; ** P < 0,01. (D) Micrografias representativas de microscopia eletrônica de transmissão de neurônios de Purkinje de seções cerebelares de camundongos Mfn2cKO transduzidas com os vetores virais indicados. A máscara rosa ilustra a área ocupada pelos dendritos, e o quadrado pontilhado amarelo ilustra o zoom fornecido à direita; n representa o núcleo. Barra de escala, 1 μm. (E) mostra um exemplo de coloração de PCx em PN transduzido em 12 semanas. Barra de escala, 20 μm. OE, superexpressão; FC, variação relativa.
Por fim, investigamos a importância da sobrevivência celular induzida por peroxidase em neurônios piramidais (PNs) que sofreram disfunção da fosforilação oxidativa (OXPHOS). Geramos um AAV-shRNA (RNA de interferência curto) codificado por mCherry direcionado especificamente ao mRNA da PCx de camundongo (AAV-shPCx) e injetamos o vírus ou seu controle aleatório (AAV-scr) no cerebelo de camundongos Mfn2cKO. A injeção foi realizada na quarta semana de idade (Figura 5A) para obter um silenciamento efetivo da PCx durante o período em que a expressão da PCx aumentou (Figura 3C) e a camada de células PN ainda estava intacta (Figura 1A). Vale ressaltar que o silenciamento da PCx (Figura S8A) leva a uma aceleração significativa da morte de PNs, que se limita ao anel infectado (Figura 5, B e C). Para compreender o mecanismo dos efeitos metabólicos induzidos pela regulação positiva de PCx, estudamos o estado redox dos neurônios de projeção (PNs) após o silenciamento de PCx e a expressão simultânea do biossensor óptico Grx1-roGFP2 mediado por AAV (Figura S8, B a D) para avaliar a alteração relativa do potencial redox do peptídeo glutationa (38). Em seguida, realizamos microscopia de fluorescência de dois fótons (FLIM) em fatias cerebrais agudas de camundongos Mfn2cKO de 7 semanas de idade ou de seus irmãos de ninhada controle para detectar possíveis alterações no estado redox citoplasmático após a verificação das condições de FLIM (Figura S8, E a G). A análise mostrou um aumento significativo no estado de oxidação de um único PN Mfn2cKO sem expressão de PCx, o que difere dos neurônios controle ou dos PNs Mfn2cKO que expressam apenas shRNA controle (Figura 5, D e E). Quando a expressão de PCx foi reduzida, a porcentagem de PNs Mfn2cKO que apresentavam um estado altamente oxidado aumentou mais de três vezes (Figura 5E), indicando que a regulação positiva de PCx manteve a capacidade redox dos neurônios degenerados.
(A) Esquema mostrando o cronograma experimental para injeção de AAV codificando shPCx quando a via metabólica indicada é ativada. (B) Fotografias representativas de microscopia confocal de seções cerebelares de camundongos Mfn2cKO de 8 semanas de idade, transduzidos e marcados com anticorpo anti-calcineurina às 4 semanas. Barra de escala: 450 μm. (C) Quantificação da densidade de células de Purkinje em alças transduzidas com AAV (análise de variância de uma via; n = 3 a 4 camundongos). Os dados são expressos como média ± erro padrão da média (EPM); ***P < 0,001. (D) Imagem representativa de microscopia de fluorescência de fluorescência (FLIM) mostrando a sobrevida média de neurônios de Purkinje (PN) de 7 semanas de idade expressando o sensor redox de glutationa Grx1-roGFP2 sob as condições experimentais especificadas. Razão da tabela de consulta (LUT): intervalo de tempo de sobrevida (em picossegundos). Barra de escala: 25 μm. (E) O histograma mostra a distribuição dos valores de tempo de vida de Grx1-roGFP2 de (D) (n=158 a 368 células em dois camundongos em cada condição). O gráfico de pizza acima de cada histograma mostra o número de células com valores de tempo de vida significativamente maiores (vermelho, oxidadas) ou menores (azul, reduzidas), que excedem 1 desvio padrão do valor médio de tempo de vida em CTRL-AAV-scr. (F) O modelo proposto mostra o efeito protetor da regulação positiva de PCx neuronal.
Em suma, os dados que apresentamos aqui demonstram que a reexpressão de MFN2 pode resgatar completamente a neuropatia periférica avançada com deficiência grave de fosforilação oxidativa (OXPHOS), depleção severa de mtDNA e morfologia extremamente anormal semelhante à ista, proporcionando, assim, progresso contínuo mesmo em estágios avançados da doença. A neurodegeneração fornece evidências reversíveis do estágio anterior à morte celular. Esse grau de flexibilidade metabólica é ainda mais enfatizado pela capacidade dos neurônios de induzir aterosclerose (uma reprogramação do ciclo do TCA), que inibe a expressão de PCx em neuropatias periféricas com deficiência de OXPHOS e aumenta a morte celular, desempenhando, portanto, um papel protetor (Figura 5F).
Neste estudo, fornecemos evidências de que a resposta dos neurônios piramidais (PNs) à disfunção da fosforilação oxidativa (OXPHOS) é a convergência gradual para a aterosclerose do ciclo do ácido cítrico (ciclo de Krebs) por meio da via de ativação diferencial ativada por programas metabólicos. Confirmamos a análise proteômica com diversos métodos complementares e revelamos que, quando desafiados por disfunção mitocondrial grave, os neurônios apresentam uma forma de elasticidade metabólica até então desconhecida. Surpreendentemente, todo o processo de reconexão não necessariamente marca o estado metabólico terminal que acompanha a neurodegeneração de forma gradual e irreversível, mas nossos dados sugerem que ele pode constituir um mecanismo de compensação funcional para a manutenção do neurônio, mesmo em um estágio anterior à morte celular. Essa descoberta indica que os neurônios possuem um grau considerável de plasticidade metabólica no organismo. Esse fato comprova que a reintrodução posterior de MFN2 pode reverter a expressão de marcadores metabólicos chave e prevenir a degeneração dos PNs. Ao contrário, ela inibe a aterosclerose e acelera a transformação dos neurônios.
Uma das descobertas mais fascinantes em nossa pesquisa é que os neurônios piramidais (NPs) com deficiência em fosforilação oxidativa (OXPHOS) podem modificar o metabolismo do ciclo de Krebs (ciclo de Krebs) por meio da regulação positiva de enzimas que estimulam especificamente a arteriosclerose. O rearranjo metabólico é uma característica comum das células cancerígenas, algumas das quais dependem da glutamina para suplementar os intermediários do ciclo de Krebs e produzir equivalentes redutores, que impulsionam a cadeia respiratória e mantêm a produção de precursores da biossíntese de lipídios e nucleotídeos (39, 40). Um estudo recente mostrou que, em tecidos periféricos com disfunção da OXPHOS, a reconexão do metabolismo da glutamina/glutamato também é uma característica proeminente (5, 41), onde a direção da entrada da glutamina no ciclo de Krebs depende da gravidade da lesão da OXPHOS (41). No entanto, faltam evidências claras sobre qualquer similaridade da plasticidade metabólica neuronal no organismo e sua possível relevância no contexto da doença. Em um estudo in vitro recente, demonstrou-se que neurônios corticais primários mobilizam reservas de glutamato para a neurotransmissão, promovendo assim o metabolismo oxidativo e a aterosclerose em condições de estresse metabólico (42). Vale ressaltar que, sob a inibição farmacológica da enzima succinato desidrogenase do ciclo do TCA, acredita-se que a carboxilação do piruvato mantenha a síntese de oxaloacetato em neurônios granulares cerebelares cultivados (34). No entanto, a relevância fisiológica desses mecanismos para o tecido cerebral (onde se acredita que a aterosclerose esteja principalmente confinada aos astrócitos) ainda possui importante significado fisiológico (43). Nesse caso, nossos dados mostram que os neurônios piramidais danificados pela fosforilação oxidativa (OXPHOS) no organismo podem ser direcionados para a degradação de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) e para a carboxilação do piruvato, que são as duas principais fontes de suplementação de intermediários do ciclo do TCA. Embora a possível contribuição do catabolismo de BCAA para o metabolismo energético neuronal tenha sido proposta, além do papel do glutamato e do GABA na neurotransmissão (44), ainda não há evidências desses mecanismos in vivo. Portanto, é fácil especular que os neurônios piramidais disfuncionais possam compensar automaticamente o consumo de intermediários do ciclo de Krebs, impulsionado pelo processo de assimilação, aumentando a aterosclerose. Em particular, a regulação positiva da PCx pode ser necessária para manter uma demanda aumentada de ácido aspártico, o que é sugerido em células em proliferação com disfunção mitocondrial (45). No entanto, nossa análise metabolômica não revelou nenhuma alteração significativa no nível de ácido aspártico em estado estacionário nos neurônios piramidais Mfn2cKO (Figura S6A), o que presumivelmente reflete a diferente utilização metabólica do ácido aspártico entre células em proliferação e neurônios pós-mitóticos. Embora o mecanismo exato da regulação positiva da PCx em neurônios disfuncionais in vivo ainda precise ser caracterizado, demonstramos que essa resposta prematura desempenha um papel importante na manutenção do estado redox dos neurônios, o que foi demonstrado em experimentos de FLIM em fatias cerebelares. Em particular, impedir que os neurônios piramidais (PNs) regulem positivamente a PCx pode levar a um estado mais oxidado e acelerar a morte celular. A ativação da degradação de aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA) e a carboxilação do piruvato não são formas de caracterizar a disfunção mitocondrial em tecidos periféricos (7). Portanto, parecem ser uma característica prioritária de neurônios deficientes em fosforilação oxidativa (OXPHOS), mesmo que não seja a única característica importante para a neurodegeneração.
A doença cerebelar é um tipo heterogêneo de doença neurodegenerativa que geralmente se manifesta como ataxia e frequentemente danifica os neurônios piramidais (46). Essa população neuronal é particularmente vulnerável à disfunção mitocondrial, pois sua degeneração seletiva em camundongos é suficiente para reproduzir muitos dos sintomas motores que caracterizam a ataxia espinocerebelar humana (16, 47, 48). De acordo com relatos, um modelo de camundongo transgênico com um gene mutante está associado à ataxia espinocerebelar humana e apresenta disfunção mitocondrial (49, 50), enfatizando a importância de estudar as consequências da deficiência de fosforilação oxidativa (OXPHOS) na hipertensão pulmonar primária (HPP). Portanto, é particularmente adequado isolar e estudar efetivamente essa população neuronal única. No entanto, dado que os neurônios piramidais são muito sensíveis à pressão e representam uma pequena proporção da população celular cerebelar total, para muitos estudos baseados em ômicas, a separação seletiva deles como células inteiras ainda é um desafio. Embora seja quase impossível alcançar a ausência absoluta de contaminação por outros tipos celulares (especialmente tecidos adultos), combinamos uma etapa de dissociação eficaz com FACS para obter um número suficiente de neurônios viáveis ​​para análise proteômica subsequente, e obtivemos uma cobertura proteica bastante alta (cerca de 3000 proteínas) em comparação com o conjunto de dados existente do cerebelo inteiro (51). Ao preservar a viabilidade das células inteiras, o método que apresentamos aqui nos permite não apenas verificar as alterações nas vias metabólicas das mitocôndrias, mas também as alterações em suas contrapartes citoplasmáticas, o que complementa o uso de marcadores de membrana mitocondrial para enriquecer o tipo celular. O novo método para o número de mitocôndrias em tecidos complexos (52, 53) não se restringe ao estudo de células de Purkinje, mas pode ser facilmente aplicado a qualquer tipo celular para abordar alterações metabólicas em cérebros doentes, incluindo outros modelos de disfunção mitocondrial.
Finalmente, identificamos uma janela terapêutica durante esse processo de rearranjo metabólico que pode reverter completamente os principais sinais de estresse celular e prevenir a degeneração neuronal. Portanto, a compreensão das implicações funcionais da reorganização descrita aqui pode fornecer informações fundamentais sobre possíveis tratamentos para manter a viabilidade neuronal durante a disfunção mitocondrial. Pesquisas futuras, com o objetivo de dissecar as alterações no metabolismo energético em outros tipos de células cerebrais, são necessárias para revelar completamente a aplicabilidade desse princípio a outras doenças neurológicas.
Camundongos MitoPark foram descritos anteriormente (31). Camundongos C57BL/6N com genes Mfn2 flanqueados por loxP foram descritos anteriormente (18) e cruzados com camundongos L7-Cre (23). A progênie dupla heterozigótica resultante foi então cruzada com camundongos homozigotos Mfn2loxP/Mfn2loxP para gerar camundongos com deleção gênica específica de células de Purkinje para Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Em um subconjunto de cruzamentos, o alelo Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) foi introduzido por meio de cruzamentos adicionais (20). Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes europeias, nacionais e institucionais e aprovados pelo LandesamtfürNatur de Umwelt und Verbraucherschutz, Renânia do Norte-Vestfália, Alemanha. O trabalho com animais também segue as diretrizes da Federação Europeia de Associações de Ciências de Animais de Laboratório.
Após anestesiar a mulher prenhe por deslocamento cervical, o embrião de camundongo (E13) foi isolado. O córtex foi dissecado em solução salina balanceada de Hanks (HBSS) suplementada com 10 mM de Hepes e cultivado em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) contendo papaína (20 U/ml) e cisteína (1 μg/ml). O tecido foi incubado em DMEM e dissociado por digestão enzimática. Em seguida, foi homogeneizado mecanicamente em DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino. As células foram semeadas em lamínulas de vidro revestidas com polilisina na densidade de 2 × 10⁶ células por placa de cultura de 6 cm ou na densidade de 0,5 × 10⁵ células/cm² para análise de imagem. Após 4 horas, o meio foi substituído por meio Neurobasal sem soro contendo 1% de suplemento B27 e 0,5 mM de GlutaMax. Os neurônios foram então mantidos a 37 °C e 5% de CO2 durante todo o experimento e alimentados uma vez por semana. Para induzir a recombinação in vitro, 3 μl (placa de cultura de 24 poços) ou 0,5 μl (placa de 24 poços) do seguinte vetor viral AAV9 foi usado para tratar os neurônios no segundo dia in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, número de catálogo 105530-AAV9) e AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, número de catálogo 105545-AAV9).
O cDNA complementar de Mfn1 e Mfn2 de camundongo (obtido dos plasmídeos Addgene nº 23212 e nº 23213, respectivamente) é marcado com a sequência V5 (GKPIPNPLLGLDST) na extremidade C-terminal e fundido com mCherry em fase através da sequência T2A. Grx1-roGFP2 foi uma doação do Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Substituindo o cassete tdTomato por meio de métodos de clonagem convencionais, o cassete foi subclonado no vetor pAAV-CAG-FLEX-tdTomato (número de referência Addgene 28306) para gerar os vetores pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 e pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2. Uma estratégia semelhante foi utilizada para gerar o vetor de controle pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Para gerar o construto AAV-shPCx, é necessário um vetor AAV plasmídico (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), que contém a sequência de DNA que codifica o shRNA direcionado ao PCx de camundongo (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′) sob o controle do promotor U6, enquanto o mCherry é utilizado sob o controle do promotor CMV. A produção dos vetores AAV auxiliares foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Cell Biolabs). Em resumo, utilize um plasmídeo de transferência contendo mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ou Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) para transfecção transitória de células 293AAV, bem como codificando a proteína do capsídeo AAV1 e a proteína acessória. O plasmídeo de empacotamento foi obtido pelo método de fosfato de cálcio. O sobrenadante viral bruto foi obtido por ciclos de congelamento-descongelamento em banho de gelo seco/etanol e as células foram lisadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS). O vetor AAV foi purificado por ultracentrifugação em gradiente descontínuo de iodixanol (24 horas a 32.000 rpm e 4°C) e concentrado usando um filtro centrífugo Amicon ultra-15. O título do genoma de AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×10¹³ cópias do genoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×10¹² GC/ml), AAV1-CAG-FLEX foi medido por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) -MFN1-V5 (1,9×10¹³ GC/ml) e AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×10¹² GC/ml).
Os neurônios primários foram raspados em PBS 1x gelado, centrifugados e homogeneizados em tampão de lise contendo 0,5% de Triton X-100 / 0,5% de desoxicolato de sódio/PBS, além de inibidores de fosfatase e protease (Roche). A quantificação de proteínas foi realizada utilizando o ensaio de ácido bicinconínico (Thermo Fisher Scientific). As proteínas foram então separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (GE Healthcare). Para bloquear sítios não específicos, a membrana foi incubada com o anticorpo primário (ver Tabela S1 para detalhes) em leite a 5% em TBST (solução salina tamponada com Tris e Tween), seguida de lavagens e incubação com o anticorpo secundário em TBST. A incubação com o anticorpo primário foi realizada durante a noite a +4°C. Após a lavagem, o anticorpo secundário foi aplicado por 2 horas à temperatura ambiente. Posteriormente, a mesma quantidade de proteína carregada foi confirmada pela incubação da mesma membrana com um anticorpo anti-β-actina. Detecção por conversão em quimioluminescência e intensificação da quimioluminescência (GE Healthcare).
Os neurônios previamente semeados em lamínulas de vidro foram fixados com paraformaldeído a 4% (PFA) em PBS no tempo especificado, à temperatura ambiente, por 10 minutos. As lamínulas foram permeabilizadas com Triton X-100 a 0,1% em PBS por 5 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, com solução bloqueadora [albumina de soro bovino (BSA) a 3% em PBS]. No segundo dia, as lamínulas foram lavadas com solução bloqueadora e incubadas com o anticorpo secundário conjugado ao fluoróforo apropriado por 2 horas à temperatura ambiente; finalmente, as amostras foram lavadas abundantemente em PBS, coradas com 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) e, em seguida, fixadas na lâmina de microscópio com Aqua-Poly/Mount.
Camundongos (machos e fêmeas) foram anestesiados por injeção intraperitoneal de cetamina (130 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) e receberam administração subcutânea de carprofeno (5 mg/kg) como analgésico. Em seguida, foram colocados em um aparelho estereotáxico (Kopf) equipado com uma placa de aquecimento. O crânio foi exposto e, utilizando uma broca odontológica, foi feita afinamento da parte do córtex cerebelar correspondente ao osso mitral (a partir do lambda: cauda 1,8, lateral 1, correspondente aos lóbulos IV e V). Com uma agulha de seringa curva, foi criado cuidadosamente um pequeno orifício no crânio, evitando-se a lesão dos vasos sanguíneos subjacentes. Em seguida, o capilar de vidro fino é inserido lentamente no microorifício (de -1,3 a -1 na face ventral da dura-máter), e 200 a 300 nl de AAV são injetados no microinjetor (Narishige) com seringas manuais (Narishige) diversas vezes, sob baixa pressão, durante um período de 10 a 20 minutos. Após a infusão, o capilar é mantido no local por mais 10 minutos para permitir a completa disseminação do vírus. Após a retirada dos capilares, a pele é suturada cuidadosamente para minimizar a inflamação da ferida e permitir a recuperação do animal. Os animais foram tratados com analgésicos (caspofeno) por vários dias após a cirurgia, período durante o qual seu estado físico foi cuidadosamente monitorado, e então foram submetidos à eutanásia no momento determinado. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as diretrizes europeias, nacionais e institucionais e foram aprovados pelo Landesamtfür Natur de Umwelt und Verbraucherschutz, Renânia do Norte-Vestfália, Alemanha.
Os animais foram anestesiados com cetamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg), e o coração foi perfundido primeiro com PBS 0,1 M e depois com PFA 4% em PBS. O tecido foi dissecado e fixado em PFA 4%/PBS durante a noite a 4 °C. Uma faca vibratória (Leica Microsystems GmbH, Viena, Áustria) foi usada para preparar cortes sagitais (50 μm de espessura) do cérebro fixado em PBS. Salvo indicação em contrário, a coloração de cortes flutuantes foi realizada conforme descrito acima (13) à temperatura ambiente e sob agitação. Resumidamente, primeiro, as fatias obtidas foram permeabilizadas com Triton X-100 0,5%/PBS por 15 minutos à temperatura ambiente; para alguns epítopos (Pcx e Shmt2), as fatias foram aquecidas em tampão Tris-EDTA a 80 °C (pH 9) por 25 minutos em vez desta etapa. Em seguida, as secções foram incubadas com o anticorpo primário (ver Tabela S1) em tampão de bloqueio (3% BSA/PBS) a 4 °C durante a noite, sob agitação. No dia seguinte, as secções foram lavadas com tampão de bloqueio e incubadas com o anticorpo secundário conjugado com fluoróforo apropriado durante 2 horas à temperatura ambiente; finalmente, as secções foram lavadas abundantemente em PBS, contracoradas com DAPI e, em seguida, fixadas com AquaPolymount em lâmina de microscópio.
Um microscópio confocal de varredura a laser (TCS SP8-X ou TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) equipado com um laser de luz branca e um laser ultravioleta de diodo de 405 nm foi usado para obter imagens da amostra. Ao excitar o fluoróforo e coletar o sinal com detectores híbridos (HyDs), o software LAS-X foi usado para coletar imagens empilhadas, em conformidade com a amostragem de Nyquist em modo sequencial: para painéis não quantitativos, utiliza-se um detector para detectar sinais altamente dinâmicos (por exemplo, em células somáticas e dendritos) como o mtYFP. O HyD é usado para detectar o número de PNs no modo BrightR. Um gating de 0,3 a 6 ns é aplicado para reduzir o ruído de fundo.
Visualização em tempo real de células selecionadas. Após a seleção em meio Neurobasal-A contendo 1% de suplemento B27 e 0,5 mM de GlutaMax, as células foram imediatamente semeadas em lâminas de vidro revestidas com poli-L-lisina (μ-Slide8 Well, Ibidi, número de catálogo 80826) e mantidas a 37 °C e 5% de CO2 por 1 hora para permitir a sedimentação celular. A aquisição de imagens em tempo real foi realizada em um microscópio confocal de varredura a laser Leica SP8, equipado com laser branco, objetiva de imersão em óleo HyD 63× [abertura numérica (AN) 1,4] e platina aquecida.
O rato foi rapidamente anestesiado com dióxido de carbono e decapitado. O cérebro foi rapidamente removido do crânio e cortado em seções sagitais de 200 μm de espessura (para o experimento de marcação com 13C) ou 275 μm de espessura (para os experimentos de dois fótons), preenchidas com os seguintes materiais: o sorvete (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemanha) foi preenchido com as seguintes substâncias: fluido cerebrospinal artificial (ACSF) gelado, saturado com carbono (95% O2 e 5% CO2), com baixo teor de Ca2+, contendo NaCl 125 mM, KCl 2,5 mM, tampão fosfato de sódio 1,25 mM, NaHCO3 25 mM, glicose 25 mM, CaCl2 0,5 mM e MgCl2 3,5 mM (pressão osmótica de 310 a 330 mmol). Transfira as fatias de cérebro obtidas para uma câmara de pré-incubação contendo ACSF com maior concentração de Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampão fosfato de sódio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glicose, 1,0 mM CaCl2 e 2,0 mM MgCl2) pH 7,4 e 310 a 320 mmol).
Durante o processo de aquisição de imagens, as fatias foram transferidas para uma sala dedicada a esse fim, e o experimento foi realizado sob perfusão contínua de ACSF a uma temperatura constante de 32° a 33°C. Um microscópio confocal de varredura a laser multifotônico (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) equipado com uma objetiva Leica 25x (NA 0,95, imersão em água) e um laser de titânio-safira (Chameleon Vision II, Coherent) foi utilizado para a aquisição das imagens das fatias. Módulo FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM de Grx1-roGFP2. As alterações no estado redox citoplasmático dos neurônios piramidais (PNs) foram medidas por FLIM de dois fótons em cortes sagitais do cérebro, onde o biossensor Grx1-roGFP2 estava direcionado aos PNs. Na camada de PNs, o campo de aquisição foi selecionado a cerca de 50 a 80 μm abaixo da superfície do corte para garantir a presença de um PN viável (ou seja, a ausência de estrutura granular ou alterações morfológicas neuronais ao longo dos dendritos) e do sensor roGFP2 de dupla positividade e do AAV codificando shRNA PCx ou sua sequência controle (ambos coexpressando mCherry). Imagens de pilha única foram coletadas com zoom digital de 2x [comprimento de onda de excitação: 890 nm; 512 nm, 512 pixels]. Detecção: filtro interno HyD, grupo de filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) e média de imagens em 2 a 3 minutos são usados ​​para garantir que fótons suficientes sejam coletados (1000 fótons no total) para o ajuste da curva. A sensibilidade da sonda Grx1-roGFP2 e a verificação das condições de FLIM foram realizadas monitorando o valor de tempo de vida do roGFP2 ao adicionar 10 mM de H2O2 exógeno ao ACSF de perfusão (para maximizar a oxidação, resultando em aumento do tempo de vida) e, em seguida, adicionando 2 mM de ditiotreitol (minimiza o grau de redução, resultando em diminuição do tempo de vida) (Figura S8, D a G). Utilize o software FLIMfit 5.1.1 para analisar os resultados obtidos, ajustando a curva de decaimento exponencial simples de toda a imagem à IRF (função de resposta do instrumento) medida, sendo χ² aproximadamente igual a 1. Para calcular a vida útil de um único PN, a máscara ao redor do corpo do nervo foi desenhada manualmente e a vida útil média em cada máscara foi utilizada para a quantificação.
Análise do potencial mitocondrial. Após a incubação da secção aguda com 100 nM de TMRM adicionado diretamente ao ACSF perfundido durante 30 minutos, as alterações do potencial mitocondrial dos neurônios de Purkinje (PNs) foram medidas por microscopia de dois fótons. A imagem de TMRM foi realizada excitando a sonda a 920 nm e utilizando um corante interno HyD (isotiocianato de tetrametilrodamina: 585/40 nm) para coletar os sinais; utilizando o mesmo comprimento de onda de excitação, mas com um corante interno HyD diferente (FITC: 525/50 nm), para obter a imagem de mtYFP. Utilize o plug-in Image Calculator do ImageJ para avaliar o potencial mitocondrial ao nível de célula única. Resumidamente, a equação do plug-in: sinal = min (mtYFP, TMRM) é utilizada para identificar a região mitocondrial que apresenta o sinal de TMRM nas células de Purkinje Somali na imagem confocal de pilha única do canal correspondente. Em seguida, a área do pixel na máscara resultante é quantificada e, posteriormente, normalizada na imagem de pilha única com limiar correspondente do canal mtYFP para obter a fração mitocondrial que representa o potencial mitocondrial.
A imagem foi deconvoluída com o software Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Para as imagens digitalizadas dos azulejos, a montagem de um único azulejo foi feita utilizando o algoritmo de junção automática fornecido pelo software LAS-X. Após a calibração da imagem, o ImageJ e o Adobe Photoshop foram utilizados para processar ainda mais a imagem e ajustar uniformemente o brilho e o contraste. O Adobe Illustrator foi utilizado para a preparação gráfica.
Análise de focos de mtDNA. O número de lesões de mtDNA foi quantificado em cortes cerebelares marcados com anticorpos anti-DNA por microscopia confocal. Uma área alvo foi criada para o corpo celular e o núcleo de cada célula, e a respectiva área foi calculada utilizando o plug-in Multi Measure (software ImageJ). A área citoplasmática foi obtida subtraindo-se a área nuclear da área do corpo celular. Finalmente, o plug-in Analyze Particles (software ImageJ) foi utilizado para quantificar automaticamente os pontos de DNA citoplasmático indicativos de mtDNA na imagem limiarizada, e os resultados obtidos foram normalizados em relação à média de PN dos camundongos CTRL. Os resultados são expressos como o número médio de nucleosídeos por célula.
Análise da expressão proteica. Utilize o plug-in Image Calculator do ImageJ para avaliar a expressão proteica em células de Purkinje (PN) em nível unicelular. Resumidamente, na imagem confocal de camada única do canal correspondente, através da equação: sinal = min (mtYFP, anticorpo), identifica-se a região mitocondrial que apresenta imunorreatividade a um determinado anticorpo em Purkinje. Em seguida, a área do pixel na máscara resultante é quantificada e normalizada na imagem de pilha única do canal mtYFP correspondente, definida pelo limiar, para obter a fração mitocondrial da proteína exibida.
Análise da densidade de células de Purkinje. O plug-in Cell Counter do ImageJ foi utilizado para avaliar a densidade de células de Purkinje, dividindo-se o número de células de Purkinje contadas pelo comprimento do anel cerebelar ocupado por essas células.
Preparação e coleta de amostras. Os cérebros dos camundongos do grupo controle e Mfn2cKO foram fixados em PFA 2%/glutaraldeído 2,5% em tampão fosfato 0,1 M (PB) e, em seguida, seções coronais foram preparadas utilizando ciliados (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Áustria) (espessura de 50 a 60 μm). Posteriormente, as seções foram fixadas em tampão PB contendo tetraóxido de osmolaridade 1% e ferrocianeto de potássio 1,5% à temperatura ambiente por 1 hora. As seções foram lavadas três vezes com água destilada e, em seguida, coradas com etanol 70% contendo acetato de uranila 1% por 20 minutos. As seções foram então desidratadas em concentrações crescentes de álcool e incluídas em resina epóxi Durcupan ACM (resina de fundição Araldite M) (Electron Microscopy Sciences, número de catálogo 14040) entre lâminas de vidro revestidas com silicone e, finalmente, polimerizadas em estufa a 60 °C por 48 horas. A área do córtex cerebelar foi selecionada e cortes ultrafinos de 50 nm foram obtidos em um ultramicrótomo Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Viena, Áustria) e depositados em uma grade de cobre de 2×1 mm revestida com filme de poliestireno. Os cortes foram corados com uma solução de acetato de uranila a 4% em água por 10 minutos, lavados várias vezes com água, em seguida com citrato de chumbo de Reynolds em água por 10 minutos e, por fim, lavados várias vezes com água. As micrografias foram obtidas com um microscópio eletrônico de transmissão Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) utilizando uma câmera digital TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, EUA).
Em camundongos infectados com AAV, o cérebro foi dissecado e fatiado em seções sagitais de 1 mm de espessura, e o cerebelo foi examinado em microscópio de fluorescência para identificar o anel infectado por AAV (ou seja, expressando mCherry). Foram utilizados apenas experimentos nos quais a injeção de AAV resultou em uma altíssima eficiência de transdução da camada de células de Purkinje (ou seja, quase toda a camada) em pelo menos dois anéis cerebelares consecutivos. O anel transduzido por AAV foi microdissecado para pós-fixação noturna (4% de PFA e 2,5% de glutaraldeído em tampão cocoato 0,1 M) e processado posteriormente. Para inclusão em EPON, o tecido fixado foi lavado com tampão cocoato de sódio 0,1 M (Applichem) e incubado com 2% de OsO4 (Os, Science Services; Caco) em tampão cocoato de sódio 0,1 M (Applichem) por 4 horas, seguido de lavagem por 2 horas. O procedimento foi repetido 3 vezes com tampão cocamida 0,1 M. Em seguida, utilizou-se uma série crescente de etanol para incubar cada solução a 4 °C por 15 minutos, a fim de desidratar o tecido. O tecido foi transferido para óxido de propileno e incubado durante a noite em EPON (Sigma-Aldrich) a 4 °C. O tecido foi então colocado em EPON fresco à temperatura ambiente por 2 horas e, posteriormente, incluído em resina a 62 °C por 72 horas. Utilizou-se um ultramicrótomo (Leica Microsystems, UC6) e uma faca de diamante (Diatome, Biel, Suíça) para cortar seções ultrafinas de 70 nm, que foram coradas com acetato de uranila a 1,5% por 15 minutos a 37 °C e, em seguida, com solução de citrato de chumbo por 4 minutos. As micrografias eletrônicas foram obtidas utilizando um microscópio eletrônico de transmissão JEM-2100 Plus (JEOL) equipado com câmera OneView 4K de 16 bits (Gatan) e software DigitalMicrograph (Gatan). Para análise, foram adquiridas micrografias eletrônicas com zoom digital de 5000× ou 10000×.
Análise morfológica das mitocôndrias. Para todas as análises, os contornos das mitocôndrias individuais foram delineados manualmente em imagens digitais utilizando o software ImageJ. Diferentes parâmetros morfológicos foram analisados. A densidade mitocondrial foi expressa em porcentagem, obtida dividindo-se a área mitocondrial total de cada célula pela área do citoplasma (área do citoplasma = área da célula - área do núcleo celular) × 100. A circularidade das mitocôndrias foi calculada com a fórmula [4π∙(área/perímetro²)]. A morfologia das mitocôndrias foi analisada e dividida em duas categorias (“tubular” e “vesicular”) de acordo com seus formatos principais.
Análise do número e densidade de autofagossomos/lisossomos. Utilize o software ImageJ para delinear manualmente os contornos de cada autofagossomo/lisossomo na imagem digital. A área dos autofagossomos/lisossomos é expressa em porcentagem, calculada dividindo-se a área total da estrutura de cada célula pela área do citoplasma (área do citoplasma = área da célula - área do núcleo) × 100. A densidade de autofagossomos/lisossomos é calculada dividindo-se o número total de estruturas de autofagossomos/lisossomos por célula (em termos de área citoplasmática) (área do citoplasma = área da célula - área do núcleo).
Rotulagem para seccionamento agudo e preparação de amostras. Para experimentos que requerem marcação com glicose, transfira as fatias cerebrais agudas para uma câmara de pré-incubação contendo carbono saturado (95% O2 e 5% CO2), ACSF com alto teor de Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, tampão fosfato de sódio 1,25 mM, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glicose, 1,0 mM CaCl2 e 2,0 mM MgCl2, ajustado para pH 7,4 e 310 a 320 mOsm), na qual a glicose é substituída por 13C6-glicose (Eurisotop, número de catálogo CLM-1396). Para experimentos que requerem marcação com piruvato, transfira as fatias cerebrais agudas para ACSF com maior concentração de Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampão fosfato de sódio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glicose, 1,0 mM CaCl2 e 2,0 mM MgCl2, ajuste o pH para 7,4 e a osmolaridade para 310 a 320 mOsm) e adicione 1 mM de 1-[1-13C]piruvato (Eurisotop, número de catálogo CLM-1082). Incube as seções por 90 minutos a 37 °C. Ao final do experimento, as seções foram lavadas rapidamente com uma solução aquosa (pH 7,4) contendo 75 mM de carbonato de amônio e, em seguida, homogeneizadas em uma mistura de 40:40:20 (v:v:v) de acetonitrila (ACN):metanol:água. Após incubação em gelo por 30 minutos, as amostras foram centrifugadas a 21.000 g por 10 minutos a 4 °C, e o sobrenadante límpido foi seco em um concentrador SpeedVac. O pellet de metabólitos seco resultante foi armazenado a -80 °C até a análise.
Análise por cromatografia líquida-espectrometria de massa de aminoácidos marcados com 13C. Para a análise por cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC-MS), o precipitado de metabólitos foi ressuspendido em 75 μl de água para LC-MS (Honeywell). Após centrifugação a 21.000 g por 5 minutos a 4 °C, 20 μl do sobrenadante clarificado foram utilizados para a análise do fluxo de aminoácidos, enquanto o restante do extrato foi imediatamente utilizado para a análise de ânions (ver abaixo). A análise de aminoácidos foi realizada utilizando o protocolo de derivatização com cloreto de benzoíla descrito anteriormente (55, 56). Na primeira etapa, 10 μl de carbonato de sódio 100 mM (Sigma-Aldrich) foram adicionados a 20 μl do extrato de metabólitos e, em seguida, 10 μl de cloreto de benzoíla 2% (Sigma-Aldrich) foram adicionados ao ACN de grau LC. A amostra foi homogeneizada brevemente em vórtex e, em seguida, centrifugada a 21.000 g por 5 minutos a 20 °C. O sobrenadante clarificado foi transferido para um frasco de amostrador automático de 2 ml com um inserto de vidro cônico (volume de 200 μl). As amostras foram analisadas utilizando o sistema de cromatografia líquida de ultra-alta performance Acquity iClass (Waters) conectado ao espectrômetro de massas de alta resolução e precisão Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Para a análise, 2 μl da amostra derivatizada foram injetados em uma coluna de sílica T3 de alta resistência (100 × 1,0 mm) (Waters) contendo partículas de 1,8 μm. A vazão foi de 100 μl/min e o sistema tampão consistiu em tampão A (formiato de amônio 10 mM e ácido fórmico 0,15% em água) e tampão B (ACN). O gradiente é o seguinte: 0%B em 0 minutos; 0%B. 0 a 15% B em 0 a 0,1 minutos; 15 a 17% B em 0,1 a 0,5 minutos; B em 17 a 55% em 0,5 a 14 minutos; B em 55 a 70% em 14 a 14,5 minutos; em 14,5 a 70 a 100% B em 18 minutos; 100% B em 18 a 19 minutos; 100 a 0% B em 19 a 19,1 minutos; 0% B em 19,1 a 28 minutos (55, 56). O espectrômetro de massas QE-HF opera no modo de ionização positiva com uma faixa de massa m/z (relação massa/carga) de 50 a 750. A resolução aplicada é de 60.000, o alvo de íons com controle de ganho automático (AGC) obtido é de 3×10⁶ e o tempo máximo de ionização é de 100 milissegundos. A fonte de ionização por eletrospray aquecida (ESI) opera com uma tensão de pulverização de 3,5 kV, uma temperatura capilar de 250 °C, um fluxo de ar de bainha de 60 UA (unidades arbitrárias) e um fluxo de ar auxiliar de 20 UA. A lente S está ajustada para 60 UA.
Análise por cromatografia iônica acoplada à espectrometria de massas (MS) de ácidos orgânicos marcados com 13C. O precipitado metabólico restante (55 μL) foi analisado utilizando um sistema de cromatografia iônica Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) conectado a um espectrômetro de massas QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Resumidamente, 5 μL do extrato metabólico foram injetados em uma coluna Dionex IonPac AS11-HC acoplada a HPLC (2 mm × 250 mm, tamanho de partícula 4 μm, Thermo Fisher Scientific) no modo push-in com alça parcial e taxa de preenchimento de 1. Em seguida, uma coluna de guarda Dionex IonPac AG11-HC (2 mm × 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific) foi utilizada. A temperatura da coluna foi mantida a 30 °C e o amostrador automático foi ajustado para 6 °C. Um gradiente de hidróxido de potássio foi gerado através do gerador de eluente utilizando um cartucho de hidróxido de potássio com água deionizada. Separação de metabólitos a uma vazão de 380 μl/min, aplicando o seguinte gradiente: 0 a 3 minutos, KOH 10 mM; 3 a 12 minutos, KOH 10 a 50 mM; 12 a 19 minutos, KOH 50 a 100 mM; 19 a 21 minutos, KOH 100 mM; 21 a 21,5 minutos, KOH 100 a 10 mM. A coluna foi reequilibrada em KOH 10 mM por 8,5 minutos.
Os metabólitos eluídos são combinados com um fluxo suplementar de isopropanol de 150 μl/min após a coluna e, em seguida, direcionados para um espectrômetro de massas de alta resolução operando no modo de ionização negativa. O MS monitora a faixa de massa de m/z 50 a 750 com uma resolução de 60.000. O AGC é ajustado para 1 × 10⁶ e o tempo máximo de ionização é mantido em 100 ms. A fonte ESI aquecida foi operada com uma tensão de pulverização de 3,5 kV. As demais configurações da fonte de íons são as seguintes: temperatura do capilar de 275 °C; fluxo de gás de bainha de 60 UA; fluxo de gás auxiliar de 20 UA a 300 °C e lente S ajustada para 60 UA.
Análise de dados de metabólitos marcados com 13C. Utilize o software TraceFinder (versão 4.2, Thermo Fisher Scientific) para análise de dados da razão isotópica. A identidade de cada composto foi verificada por um composto de referência confiável e analisada independentemente. Para realizar a análise de enriquecimento isotópico, a área do cromatograma de íons extraídos (XIC) de cada isótopo de 13C (Mn) foi extraída de [M + H] + , onde n é o número de carbonos do composto alvo, usado para analisar aminoácidos ou [ MH] + , usado para analisar ânions. A precisão de massa do XIC é inferior a cinco partes por milhão e a precisão do tempo de retenção (TR) é de 0,05 minutos. A análise de enriquecimento é realizada calculando-se a razão de cada isótopo detectado em relação à soma de todos os isótopos do composto correspondente. Essas razões são apresentadas como valores percentuais para cada isótopo e os resultados são expressos como porcentagem molar de enriquecimento (PME), conforme descrito anteriormente (42).
O pellet de neurônios congelado foi homogeneizado em metanol a 80% (v/v) gelado, agitado em vórtex e incubado a -20°C por 30 minutos. A amostra foi agitada novamente em vórtex e incubada a +4°C por 30 minutos. Em seguida, foi centrifugada a 21.000 g por 5 minutos a 4°C e o sobrenadante resultante foi coletado e seco em um concentrador SpeedVac a 25°C para análises subsequentes. Conforme descrito anteriormente, a análise por LC-MS foi realizada nos aminoácidos das células selecionadas. Utilizando o software TraceFinder (versão 4.2, Thermo Fisher Scientific), a análise dos dados foi realizada com base na massa monoisotópica de cada composto. A normalização quantílica dos dados dos metabólitos foi realizada utilizando o pacote de software preprocessCore (57).
Preparação das fatias. O rato foi rapidamente anestesiado com dióxido de carbono e decapitado. O cérebro foi rapidamente removido do crânio e cortado em seções sagitais de 300 a 375 μm utilizando uma faca vibratória preenchida com gelo (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemanha). A gaseificação com carbono frio (95% O2 e 5% CO2) e a solução ACSF com baixo teor de Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampão fosfato de sódio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glicose, 1,0 mM CaCl2 e 6,0 mM MgCl2). O pH foi ajustado para 7,4 e a osmolaridade para 310 a 330 mOsm. Transfira as fatias de cérebro obtidas para uma câmara contendo ACSF com maior concentração de Ca2+ (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM tampão fosfato de sódio, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glicose, 4,0 mM CaCl2 e 3,5 mM MgCl2), pH 7,4 e 310 a 320 mOsm. Armazene as fatias por 20 a 30 minutos para que possam se recuperar antes da gravação.
Para todas as gravações, utilizou-se uma platina de microscópio equipada com uma câmara de gravação fixa e uma objetiva de imersão em água de 20x (Scientifica). As células de Purkinje presumidas foram identificadas por (i) tamanho corporal, (ii) localização anatômica no cerebelo e (iii) expressão do gene repórter fluorescente mtYFP. A micropipeta, com resistência de ponta de 5 a 11 megaohms, foi extraída por um capilar de vidro borossilicato (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Alemanha) e um sistema de micropipeta horizontal (P-1000, Sutter, Novato, CA). Todas as gravações foram realizadas com um amplificador de patch clamp ELC-03XS npi (npi electronic GmbH, Tam, Alemanha), controlado pelo software Signal (versão 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, Reino Unido). O experimento foi gravado a uma taxa de amostragem de 12,5 kHz. O sinal é filtrado com dois filtros Bessel passa-baixa com frequências de corte de 1,3 e 10 kHz, respectivamente. A capacitância da membrana e da pipeta é compensada pelo circuito de compensação utilizando o amplificador. Todos os experimentos foram realizados sob o controle de uma câmera Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Alemanha), controlada pelo software Hokawo (versão 2.8, Hamamatsu, Gerden, Alemanha).
Configuração e análise de rotina de células inteiras. Imediatamente antes do registro, preencha a pipeta com a solução interna contendo as seguintes substâncias: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM gluconato de potássio, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg), 0,5 mM guanosina trifosfato (GTP) (Na) e 10,0 mM fosfato de creatinina. O pH foi ajustado para 7,25 e a pressão osmótica para 290 mOsm (sacarose). Imediatamente após a aplicação de uma força de 0 pA para romper a membrana, o potencial de membrana em repouso foi medido. A resistência de entrada foi medida aplicando-se correntes hiperpolarizadas de -40, -30, -20 e -10 pA. Meça a magnitude da resposta de voltagem e utilize a lei de Ohm para calcular a resistência de entrada. A atividade espontânea foi registrada em um circuito de fixação de voltagem por 5 minutos, e as correntes pós-sinápticas espontâneas (sPSC) foram identificadas e medidas no software Igor Pro (versão 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, EUA) utilizando um script de reconhecimento semiautomático. A curva IV e a corrente em estado estacionário foram medidas fixando-se a bateria em diferentes potenciais (iniciando em -110 mV) e aumentando a voltagem em incrementos de 5 mV. A geração de potenciais de ação (PA) foi testada aplicando-se uma corrente despolarizante. A célula foi fixada em -70 mV enquanto um pulso de corrente despolarizante era aplicado. O incremento de cada unidade de registro foi ajustado separadamente (de 10 a 60 pA). A frequência máxima de PA foi calculada contando-se manualmente os picos de pulso que causaram a maior frequência de PA. O limiar de PA foi analisado utilizando-se a segunda derivada do pulso de despolarização que desencadeou o primeiro ou mais PAs.
Configuração e análise do patch-clamp perfurado. Realize o registro do patch-clamp perfurado utilizando protocolos padrão. Utilize uma pipeta livre de ATP e GTP que não contenha os seguintes ingredientes: 128 mM de gluconato de potássio, 10 mM de KCl, 10 mM de Hepes, 0,1 mM de EGTA e 2 mM de MgCl₂, e ajuste o pH para 7,2 (utilizando KOH). ATP e GTP são omitidos da solução intracelular para evitar a permeabilidade descontrolada da membrana celular. A pipeta de patch-clamp é preenchida com uma solução interna contendo anfotericina (aproximadamente 200 a 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) para obter um registro de patch-clamp perfurado. A anfotericina foi dissolvida em dimetilsulfóxido (concentração final: 0,1 a 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). A concentração de DMSO utilizada não teve efeito significativo sobre os neurônios estudados. Durante o processo de estimulação, a resistência do canal (Ra) foi monitorada continuamente, e o experimento foi iniciado após a estabilização da amplitude de Ra e do potencial de ação (PA) (20-40 minutos). A atividade espontânea foi medida em um circuito de fixação de voltagem e/ou corrente por 2 a 5 minutos. A análise dos dados foi realizada utilizando o Igor Pro (versão 7.05.2, WaveMetrics, EUA), Excel (versão 2010, Microsoft Corporation, Redmond, EUA) e GraphPad Prism (versão 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA). Para identificar os PAs espontâneos, foi utilizado o plug-in NeuroMatic v3.0c do IgorPro. Este plug-in identifica automaticamente os PAs utilizando um limiar predefinido, ajustado individualmente para cada registro. A partir do intervalo entre os picos, determina-se a frequência de pico, considerando a frequência de pico instantânea máxima e a frequência de pico média.
Isolamento de PNs. Adaptando-se ao protocolo previamente publicado, os PNs foram purificados do cerebelo de camundongos em um estágio específico (58). Resumidamente, o cerebelo foi dissecado e picado em meio de dissociação gelado [sem HBSS Ca2+ e Mg2+, suplementado com 20 mM de glicose, penicilina (50 U/ml) e estreptomicina (0,05 mg/ml)], e então digerido em papaína [HBSS, suplementado com 1-cisteína·HCl (1 mg/ml), papaína (16 U/ml) e desoxirribonuclease I (DNase I; 0,1 mg/ml)]. O tratamento foi realizado por 30 minutos a 30°C. Primeiro, lave os tecidos em meio HBSS contendo muco de ovo (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) e DNase (0,1 mg/ml) à temperatura ambiente para evitar a digestão enzimática e, em seguida, em meio HBSS contendo 20 mM de glicose. Triture suavemente em HBSS, penicilina (50 U/ml), estreptomicina (0,05 mg/ml) e DNase (0,1 mg/ml) para liberar as células individuais. A suspensão celular resultante foi filtrada através de um filtro de células de 70 μm e, em seguida, as células foram centrifugadas (1110 rpm, 5 minutos, 4 °C) e ressuspensas em meio de triagem [HBSS, suplementado com 20 mM de glicose, 20% de soro fetal bovino, penicilina (50 U/ml) e estreptomicina (0,05 mg/ml)]. A viabilidade celular foi avaliada com iodeto de propídio e a densidade celular ajustada para 1×10⁶ a 2×10⁶ células/ml. Antes da citometria de fluxo, a suspensão foi filtrada através de um filtro de células de 50 μm.
Citômetro de fluxo. A triagem celular foi realizada a 4°C utilizando o equipamento FACSAria III (BD Biosciences) e o software FACSDiva (BD Biosciences, versão 8.0.1). A suspensão celular foi triada utilizando um bocal de 100 μm sob uma pressão de 20 psi a uma taxa de ~2800 eventos/seg. Como os critérios de gating tradicionais (tamanho celular, discriminação bimodal e características de dispersão) não garantem o isolamento correto de neurônios piramidais (PN) de outros tipos celulares, a estratégia de gating foi definida com base na comparação direta da intensidade e autofluorescência da proteína fluorescente amarela (YFP) em camundongos mitoYFP+ ​​e no controle mitoYFP−. A YFP foi excitada pela irradiação da amostra com um laser de 488 nm, e o sinal foi detectado utilizando um filtro passa-banda de 530/30 nm. Em camundongos mitoYFP+, a intensidade relativa do gene repórter Rosa26-mitoYFP também foi utilizada para distinguir corpos neuronais e fragmentos axonais. O 7-AAD é excitado com um laser amarelo de 561 nm e detectado com um filtro passa-banda de 675/20 nm para excluir células mortas. Para separar os astrócitos simultaneamente, a suspensão celular foi corada com ACSA-2-APC e, em seguida, a amostra foi irradiada com um laser de 640 nm. Um filtro passa-banda de 660/20 nm foi usado para detectar o sinal.
As células coletadas foram centrifugadas (1110 rpm, 5 minutos, 4°C) e armazenadas a -80°C até o uso. Camundongos Mfn2cKO e seus filhotes foram classificados no mesmo dia para minimizar a variabilidade do procedimento. A apresentação e análise dos dados de FACS foram realizadas utilizando o software FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, EUA).
Como mencionado acima (59), a PCR em tempo real é usada para isolar o DNA dos neurônios selecionados para posterior quantificação do mtDNA. A linearidade e a sensibilidade do limiar foram inicialmente testadas realizando qPCR em diferentes números de células. Resumidamente, 300 PN foram coletados em um tampão de lise composto por 50 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 e proteinase K (200 ng/ml) e incubados a 55 °C por 120 minutos. As células foram então incubadas a 95 °C por 10 minutos para garantir a completa inativação da proteinase K. Usando uma sonda TaqMan (Thermo Fisher) específica para mt-Nd1, o mtDNA foi medido por PCR semiquantitativa no sistema de PCR em tempo real 7900HT (Thermo Fisher Scientific). genes Science, número de catálogo Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo AIVI3E8) e 18S (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo Hs99999901_s1).
Preparação da amostra de proteoma. A solução foi aquecida a 95 °C por 10 minutos e sonicada em tampão de lise [6 M cloreto de guanidina, 10 mM cloridrato de tris(2-carboxietil)fosfina, 10 mM cloroacetamida e 100 mM tris-HCl]. A lise foi realizada em um Bioruptor (Diagenode) por 10 minutos (pulso de 30 segundos / pausa de 30 segundos). A amostra foi diluída 1:10 em 20 mM tris-HCl (pH 8,0), misturada com 300 ng de tripsina Gold (Promega) e incubada durante a noite a 37 °C para digestão completa. No dia seguinte, a amostra foi centrifugada a 20.000 g por 20 minutos. O sobrenadante foi diluído com 0,1% de ácido fórmico e a solução foi dessalinizada com StageTips de fabricação própria. A amostra foi seca em um concentrador a vácuo SpeedVac (Eppendorf concentrator plus 5305) a 45 °C e, em seguida, o peptídeo foi ressuspenso em ácido fórmico a 0,1%. Todas as amostras foram preparadas simultaneamente pela mesma pessoa. Para analisar as amostras de astrócitos, 4 μg de peptídeos dessalinizados foram marcados com uma etiqueta de massa em tandem (TMT10plex, número de catálogo 90110, Thermo Fisher Scientific) com uma proporção de peptídeo para reagente TMT de 1:20. Para a marcação com TMT, 0,8 mg de reagente TMT foram ressuspensos em 70 μl de acetonitrila anidra (ACN) e o peptídeo seco foi reconstituído em 9 μl de TEAB 0,1 M (bicarbonato de trietilamônio), ao qual foram adicionados 7 μl de reagente TMT em ACN. A concentração foi de 43,75%. Após 60 minutos de incubação, a reação foi interrompida com 2 μl de hidroxilamina a 5%. Os peptídeos marcados foram coletados, secos, ressuspensos em 200 μl de ácido fórmico a 0,1%, divididos em duas partes e, em seguida, dessalinizados utilizando StageTips de fabricação própria. Utilizando um cromatógrafo líquido de ultra-alta eficiência UltiMate 3000 (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), uma das duas metades foi fracionada em uma coluna cromatográfica Acquity de 1 mm x 150 mm preenchida com partículas C18 de 130 Å e 1,7 μm (Waters, catálogo nº SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Separe os peptídeos a uma taxa de fluxo de 30 μl/min, separando-os de 1% a 50% do tampão B durante 85 minutos com um gradiente escalonado de 96 minutos, de 50% a 95% do tampão B durante 3 minutos e, em seguida, durante 8 minutos a 95% do tampão B; o tampão A é composto por 5% de ACN e 10 mM de bicarbonato de amônio (ABC), e o tampão B por 80% de ACN e 10 mM de ABC. Recolha as frações a cada 3 minutos e combine-as em dois grupos (1 + 17, 2 + 18, etc.) e seque-as em uma centrífuga a vácuo.
Análise por LC-MS/MS. Para a espectrometria de massa, os peptídeos (número r119.aq) foram separados em uma coluna analítica PicoFrit de 25 cm com diâmetro interno de 75 μm (lente objetiva nova, número de peça PF7508250) equipada com meio ReproSil-Pur 120 C18-AQ de 1,9 μm (Dr. Maisch, Mat), utilizando o sistema EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Alemanha). A coluna foi mantida a 50 °C. Os tampões A e B consistem em ácido fórmico a 0,1% em água e ácido fórmico a 0,1% em 80% de ACN, respectivamente. Os peptídeos foram separados em concentrações de 6% a 31% do tampão B durante 65 minutos e de 31% a 50% do tampão B durante 5 minutos, com um gradiente de 200 nl/min. Os peptídeos eluídos foram analisados ​​em um espectrômetro de massas Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). A medição de m/z do precursor peptídico foi realizada com resolução de 120.000 na faixa de 350 a 1500 m/z. Utilizando energia de colisão normalizada de 27%, o precursor mais forte, com estado de carga de 2 a 6, foi selecionado para clivagem por dissociação de alta energia em armadilha de íons (HCD). O tempo de ciclo foi definido em 1 s. O valor de m/z do fragmento peptídico foi medido na armadilha de íons utilizando o menor alvo AGC de 5×10⁴ e o tempo máximo de injeção de 86 ms. Após a fragmentação, o precursor foi colocado na lista de exclusão dinâmica por 45 s. Os peptídeos marcados com TMT foram separados em uma coluna Acclaim PepMap de 50 cm e 75 μm (Thermo Fisher Scientific, número de catálogo 164942), e os espectros de migração foram analisados ​​em um espectrômetro de massas Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) equipado com um sistema de íons de forma de onda assimétrica de alto campo (FAIMS) (Thermo Fisher Scientific), operando com duas voltagens de compensação de −50 e −70 V. O MS3, selecionado com base no precursor de sincronização, foi utilizado para a medição do sinal do íon repórter TMT. A separação dos peptídeos foi realizada em uma coluna EASY-nLC 1200, utilizando uma eluição com gradiente linear de 90%, com uma concentração de tampão de 6% a 31%; o tampão A continha 0,1% de ácido fórmico (FA) e o tampão B continha 0,1% de FA e 80% de acetonitrila (ACN). A coluna analítica foi operada a 50 °C. Utilize o FreeStyle (versão 1.6, Thermo Fisher Scientific) para dividir o arquivo original de acordo com a tensão de compensação do FAIMS.
Identificação e quantificação de proteínas. Utilizando o mecanismo de busca integrado Andromeda, os dados originais foram analisados ​​com o MaxQuant versão 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Além das sequências da recombinase Cre e da YFP obtidas de Aequorea victoria, os espectros de fragmentos peptídicos foram pesquisados ​​em busca da sequência canônica e da sequência de isoforma do proteoma de referência do camundongo (ID do proteoma UP000000589, baixado do UniProt em maio de 2017). A oxidação da metionina e a acetilação do N-terminal da proteína foram definidas como modificações variáveis; a metilação do carbamoílo da cisteína foi definida como modificação fixa. Os parâmetros de digestão foram definidos como “especificidade” e “tripsina/P”. O número mínimo de peptídeos e peptídeos razor utilizados para a identificação de proteínas foi 1; o número mínimo de peptídeos únicos foi 0. Sob as condições de correspondência do mapa de peptídeos, a taxa de identificação de proteínas foi de 0,01. A opção “Segundo Peptídeo” foi habilitada. Use a opção “correspondência entre execuções” para transferir identificações bem-sucedidas entre diferentes arquivos originais. Use a contagem mínima de razão LFQ 1 para quantificação sem rótulo (LFQ) (60). A intensidade LFQ é filtrada para pelo menos dois valores válidos em pelo menos um grupo de genótipo em cada ponto de tempo e é extrapolada de uma distribuição normal com largura de 0,3 e deslocamento para baixo de 1,8. Use a plataforma computacional Perseus (https://maxquant.net/perseus/) e o R (https://r-project.org/) para analisar os resultados LFQ. Um teste t moderado bidirecional do pacote de software limma foi usado para análise de expressão diferencial (61). A análise exploratória de dados é realizada usando ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally e pheatmap. Os dados de proteômica baseados em TMT foram analisados ​​usando o MaxQuant versão 1.6.10.43. Pesquise dados brutos de proteômica no banco de dados de proteômica humana da UniProt, baixado em setembro de 2018. A análise inclui o fator de correção de pureza isotópica fornecido pelo fabricante. Utilize o pacote limma no R para análise de expressão diferencial. Os dados originais, os resultados da busca no banco de dados, o fluxo de trabalho da análise de dados e os resultados estão armazenados na aliança ProteomeXchange, por meio do repositório parceiro PRIDE, com o identificador de conjunto de dados PXD019690.
As anotações funcionais enriquecem a análise. A ferramenta Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) foi utilizada para determinar a riqueza dos termos de anotação funcional do conjunto de dados após 8 semanas (Figura 1). Resumidamente, a lista quantitativa de proteínas obtida a partir da análise de dados de LC-MS/MS (espectrometria de massa em tandem) é utilizada com os seguintes critérios de filtragem: Mus musculus é selecionado como espécie e fundo, e a categoria que apresenta valor de P ajustado por Benjamini para enriquecimento igual ou inferior a 0,05 é considerada significativa. Neste gráfico, são apresentadas as cinco categorias com maior excesso em cada cluster, com base no valor de P ajustado. Utilizando o teste t múltiplo, com o programa de boosting linear em dois estágios de Benjamini, Krieger e Yekutieli (Q = 5%), a análise da expressão proteica ao longo do tempo é realizada nos candidatos importantes identificados em cada categoria, e cada linha é analisada separadamente. Não há necessidade de adotar um desvio padrão consistente.
Para comparar os resultados deste estudo com bases de dados publicadas e gerar um diagrama de Venn na Figura 1, combinámos a lista quantitativa de proteínas com as anotações do MitoCarta 2.0 (24). Utilize a ferramenta online Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) para gerar o diagrama.
Para informações detalhadas sobre os procedimentos estatísticos utilizados na análise proteômica, consulte a seção correspondente em Materiais e Métodos. Para todos os outros experimentos, informações detalhadas podem ser encontradas na legenda correspondente. Salvo indicação em contrário, todos os dados são expressos como média ± erro padrão da média (EPM), e todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 8.1.2.
Para acessar o material complementar deste artigo, visite http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
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Por E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
A análise proteômica de neurônios disfuncionais revelou que programas metabólicos são ativados para neutralizar a neurodegeneração.
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