Este artigo faz parte do tópico de pesquisa “Tecnologias avançadas de biorremediação e processos de reciclagem de compostos orgânicos sintéticos (COS)”. Veja todos os 14 artigos.
Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) de baixo peso molecular, como o naftaleno e naftalenos substituídos (metilnaftaleno, ácido naftoico, 1-naftil-N-metilcarbamato, etc.), são amplamente utilizados em diversas indústrias e são genotóxicos, mutagênicos e/ou carcinogênicos para organismos. Esses compostos orgânicos sintéticos (COSs) ou xenobióticos são considerados poluentes prioritários e representam uma séria ameaça ao meio ambiente global e à saúde pública. A intensidade das atividades humanas (por exemplo, gaseificação de carvão, refino de petróleo, emissões veiculares e aplicações agrícolas) determina a concentração, o destino e o transporte desses compostos ubíquos e persistentes. Além dos métodos físicos e químicos de tratamento/remoção, tecnologias verdes e ambientalmente amigáveis, como a biorremediação, que utilizam microrganismos capazes de degradar completamente os COPs ou convertê-los em subprodutos não tóxicos, surgiram como uma alternativa segura, economicamente viável e promissora. Diversas espécies bacterianas pertencentes aos filos Proteobacteria (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia e Neosphingobacterium), Firmicutes (Bacillus e Paenibacillus) e Actinobacteria (Rhodococcus e Arthrobacter) na microbiota do solo demonstraram a capacidade de degradar vários compostos orgânicos. Estudos metabólicos, genômica e análises metagenômicas nos ajudam a compreender a complexidade e a diversidade catabólica presentes nessas formas de vida simples, o que pode ser aplicado para uma biodegradação eficiente. A longa existência de PAHs resultou no surgimento de novos fenótipos de degradação por meio da transferência horizontal de genes utilizando elementos genéticos como plasmídeos, transposons, bacteriófagos, ilhas genômicas e elementos conjugativos integrativos. A biologia de sistemas e a engenharia genética de isolados específicos ou comunidades modelo (consórcios) podem viabilizar a biorremediação abrangente, rápida e eficiente desses PAHs por meio de efeitos sinérgicos. Nesta revisão, focamos nas diferentes vias metabólicas e sua diversidade, na composição e diversidade genética, e nas respostas/adaptações celulares de bactérias degradadoras de naftaleno e naftaleno substituído. Isso fornecerá informações ecológicas para aplicação em campo e otimização de cepas para biorremediação eficiente.
O rápido desenvolvimento das indústrias (petroquímica, agricultura, farmacêutica, corantes têxteis, cosméticos, etc.) contribuiu para a prosperidade econômica global e a melhoria dos padrões de vida. Esse desenvolvimento exponencial resultou na produção de um grande número de compostos orgânicos sintéticos (COS), utilizados na fabricação de diversos produtos. Esses compostos estranhos ou COS incluem hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs), pesticidas, herbicidas, plastificantes, corantes, produtos farmacêuticos, organofosforados, retardantes de chama, solventes orgânicos voláteis, etc. Eles são emitidos para a atmosfera, ecossistemas aquáticos e terrestres, onde têm impactos multidimensionais, causando efeitos prejudiciais em diversas bioformas por meio da alteração de propriedades físico-químicas e da estrutura da comunidade (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Muitos poluentes aromáticos têm impactos fortes e destrutivos em muitos ecossistemas intactos/pontos críticos de biodiversidade (por exemplo, recifes de coral, calotas polares do Ártico/Antártico, lagos de alta montanha, sedimentos de águas profundas, etc.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Estudos geomicrobiológicos recentes demonstraram que a deposição de matéria orgânica sintética (por exemplo, poluentes aromáticos) e seus derivados nas superfícies de estruturas artificiais (ambiente construído) (por exemplo, sítios de patrimônio cultural e monumentos feitos de granito, pedra, madeira e metal) acelera sua degradação (Gadd 2017; Liu et al. 2018). As atividades humanas podem intensificar e agravar a degradação biológica de monumentos e edifícios por meio da poluição do ar e das mudanças climáticas (Liu et al. 2020). Esses contaminantes orgânicos reagem com o vapor de água na atmosfera e se depositam na estrutura, causando degradação física e química do material. A biodegradação é amplamente reconhecida como alterações indesejáveis ​​na aparência e nas propriedades dos materiais, causadas por organismos vivos, que afetam sua preservação (Pochon e Jaton, 1967). A ação microbiana (metabolismo) desses compostos pode reduzir a integridade estrutural, a eficácia da conservação e o valor cultural (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). Por outro lado, em alguns casos, a adaptação e a resposta microbiana a essas estruturas têm se mostrado benéficas, pois formam biofilmes e outras crostas protetoras que reduzem a taxa de deterioração/decomposição (Martino, 2016). Portanto, o desenvolvimento de estratégias eficazes de conservação sustentável a longo prazo para monumentos de pedra, metal e madeira requer uma compreensão profunda dos principais processos envolvidos nesse processo. Comparadas aos processos naturais (processos geológicos, incêndios florestais, erupções vulcânicas, reações de plantas e bactérias), as atividades humanas resultam na liberação de grandes volumes de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) e outros compostos orgânicos de carbono (CO) nos ecossistemas. Muitos PAHs usados ​​na agricultura (inseticidas e pesticidas como DDT, atrazina, carbaril, pentaclorofenol, etc.), na indústria (petróleo bruto, lodo/resíduos de petróleo, plásticos derivados de petróleo, PCBs, plastificantes, detergentes, desinfetantes, fumigantes, fragrâncias e conservantes), em produtos de higiene pessoal (protetores solares, desinfetantes, repelentes de insetos e almíscares policíclicos) e em munições (explosivos como 2,4,6-TNT) são potenciais xenobióticos que podem impactar a saúde do planeta (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna e Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Essa lista pode ser expandida para incluir compostos derivados de petróleo (óleos combustíveis, lubrificantes, asfaltenos), bioplásticos de alto peso molecular e líquidos iônicos (Amde et al., 2015). A Tabela 1 lista vários poluentes aromáticos e suas aplicações em diversas indústrias. Nos últimos anos, as emissões antropogênicas de compostos orgânicos voláteis, bem como de dióxido de carbono e outros gases de efeito estufa, começaram a aumentar (Dvorak et al., 2017). No entanto, os impactos antropogênicos superam significativamente os naturais. Além disso, constatamos que diversos compostos orgânicos voláteis persistem em muitos ambientes e foram identificados como poluentes emergentes com efeitos adversos sobre os biomas (Figura 1). Agências ambientais, como a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (USEPA), incluíram muitos desses poluentes em sua lista de prioridades devido às suas propriedades citotóxicas, genotóxicas, mutagênicas e carcinogênicas. Portanto, são necessárias regulamentações rigorosas para o descarte e estratégias eficazes para o tratamento/remoção de resíduos de ecossistemas contaminados. Diversos métodos de tratamento físico e químico, como pirólise, tratamento térmico oxidativo, aeração, aterro sanitário, incineração, etc., são ineficazes, dispendiosos e geram subprodutos corrosivos, tóxicos e de difícil tratamento. Com a crescente conscientização ambiental global, microrganismos capazes de degradar esses poluentes e seus derivados (como halogenados, nitro, alquil e/ou metil) estão atraindo cada vez mais atenção (Fennell et al., 2004; Haritash e Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). O uso desses microrganismos candidatos autóctones, isoladamente ou em culturas mistas (colônias), para a remoção de poluentes aromáticos apresenta vantagens em termos de segurança ambiental, custo, eficiência, eficácia e sustentabilidade. Pesquisadores também estão explorando a integração de processos microbianos com métodos redox eletroquímicos, ou seja, sistemas bioeletroquímicos (BES), como uma tecnologia promissora para o tratamento/remoção de poluentes (Huang et al., 2011). A tecnologia BES tem atraído crescente atenção devido à sua alta eficiência, baixo custo, segurança ambiental, operação em temperatura ambiente, materiais biocompatíveis e capacidade de recuperar subprodutos valiosos (como eletricidade, combustível e produtos químicos) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). O advento do sequenciamento genômico de alto rendimento e das ferramentas/métodos ômicos proporcionou uma riqueza de novas informações sobre a regulação genética, proteômica e fluxômica das reações de diversos microrganismos degradadores. A combinação dessas ferramentas com a biologia de sistemas aprimorou ainda mais nossa compreensão da seleção e do ajuste fino de vias catabólicas-alvo em microrganismos (ou seja, o design metabólico) para alcançar uma biodegradação eficiente e eficaz. Para projetar estratégias de biorremediação eficazes utilizando microrganismos candidatos adequados, precisamos compreender o potencial bioquímico, a diversidade metabólica, a composição genética e a ecologia (autoecologia/sinecologia) dos microrganismos.
Figura 1. Fontes e vias de dispersão de PAHs de baixo peso molecular em diversos ambientes e fatores que afetam a biota. As linhas tracejadas representam interações entre os elementos do ecossistema.
Nesta revisão, procuramos resumir os dados sobre a degradação de PAHs simples, como o naftaleno e naftalenos substituídos, por diversos isolados bacterianos, abrangendo vias metabólicas e sua diversidade, enzimas envolvidas na degradação, composição/conteúdo e diversidade gênica, respostas celulares e vários aspectos da biorremediação. A compreensão dos níveis bioquímicos e moleculares auxiliará na identificação de cepas hospedeiras adequadas e em sua posterior engenharia genética para a biorremediação eficaz desses poluentes prioritários. Isso contribuirá para o desenvolvimento de estratégias para o estabelecimento de consórcios bacterianos específicos para cada local, visando uma biorremediação eficaz.
A presença de um grande número de compostos aromáticos tóxicos e perigosos (que satisfazem a regra de Hückel 4n + 2π elétrons, n = 1, 2, 3, …) representa uma séria ameaça a diversos meios ambientais, como ar, solo, sedimentos e águas superficiais e subterrâneas (Puglisi et al., 2007). Esses compostos possuem anéis benzênicos simples (monocíclicos) ou múltiplos anéis benzênicos (policíclicos) dispostos de forma linear, angular ou em aglomerados, e exibem estabilidade no meio ambiente devido à alta energia de ressonância negativa e inércia, o que pode ser explicado por sua hidrofobicidade e estado reduzido. Quando o anel aromático é substituído por grupos metil (-CH3), carboxila (-COOH), hidroxila (-OH) ou sulfonato (-HSO3), ele se torna mais estável, apresenta maior afinidade por macromoléculas e é bioacumulativo em sistemas biológicos (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Alguns hidrocarbonetos aromáticos policíclicos de baixo peso molecular (HAPPM), como o naftaleno e seus derivados [metilnaftaleno, ácido naftoico, naftalenossulfonato e 1-naftil N-metilcarbamato (carbaril)], foram incluídos na lista de poluentes orgânicos prioritários da Agência de Proteção Ambiental dos EUA como genotóxicos, mutagênicos e/ou carcinogênicos (Cerniglia, 1984). A liberação dessa classe de NM-PAHs no meio ambiente pode resultar na bioacumulação desses compostos em todos os níveis da cadeia alimentar, afetando assim a saúde dos ecossistemas (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
As fontes e vias de chegada dos PAHs à biota ocorrem principalmente por meio da migração e das interações entre diferentes componentes do ecossistema, como solo, água subterrânea, água superficial, culturas agrícolas e atmosfera (Arey e Atkinson, 2003). A Figura 1 mostra as interações e a distribuição de diferentes PAHs de baixo peso molecular em ecossistemas e suas vias de chegada à biota/exposição humana. Os PAHs são depositados em superfícies como resultado da poluição do ar e por meio da migração (deriva) de emissões veiculares, gases de exaustão industrial (gaseificação de carvão, combustão e produção de coque) e sua deposição. Atividades industriais como a fabricação de têxteis sintéticos, corantes e tintas; preservação de madeira; processamento de borracha; atividades de fabricação de cimento; produção de pesticidas; e aplicações agrícolas são as principais fontes de PAHs em sistemas terrestres e aquáticos (Bamforth e Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Estudos demonstraram que solos em áreas suburbanas e urbanas, próximos a rodovias e em grandes cidades são mais suscetíveis a hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) devido às emissões de usinas de energia, aquecimento residencial, cargas de tráfego aéreo e rodoviário e atividades de construção (Suman et al., 2016). (2008) mostraram que os HAPs no solo próximo a estradas em Nova Orleans, Louisiana, EUA, chegaram a 7189 μg/kg, enquanto em espaços abertos, foram de apenas 2404 μg/kg. Da mesma forma, níveis de HAPs de até 300 μg/kg foram relatados em áreas próximas a locais de gaseificação de carvão em diversas cidades dos EUA (Kanaly e Harayama, 2000; Bamforth e Singleton, 2005). Solos de diversas cidades indianas, como Delhi (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbai (Kulkarni e Venkataraman, 2000) e Visakhapatnam (Kulkarni et al., 2014), apresentam altas concentrações de PAHs. Compostos aromáticos são facilmente adsorvidos em partículas do solo, matéria orgânica e minerais argilosos, tornando-se importantes sumidouros de carbono em ecossistemas (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). As principais fontes de PAHs em ecossistemas aquáticos são a precipitação (chuva/seca e vapor d'água), o escoamento urbano, o descarte de efluentes, a recarga de aquíferos, etc. (Srogi, 2007). Estima-se que cerca de 80% dos PAHs em ecossistemas marinhos sejam derivados de precipitação, sedimentação e descarte de resíduos (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Concentrações mais elevadas de PAHs em águas superficiais ou lixiviados de aterros sanitários acabam por infiltrar-se nas águas subterrâneas, representando uma grande ameaça à saúde pública, visto que mais de 70% da população do Sul e Sudeste Asiático consome água subterrânea (Duttagupta et al., 2019). Um estudo recente de Duttagupta et al. (2020) com análises de rios (32) e águas subterrâneas (235) de Bengala Ocidental, Índia, constatou que cerca de 53% dos residentes urbanos e 44% dos residentes rurais (totalizando 20 milhões de habitantes) podem estar expostos ao naftaleno (4,9–10,6 μg/L) e seus derivados. Padrões diferenciados de uso da terra e o aumento da extração de água subterrânea são considerados os principais fatores que controlam o transporte vertical (advecção) de PAHs de baixo peso molecular no subsolo. O escoamento agrícola, os efluentes municipais e industriais e os resíduos sólidos/lixo são afetados pela presença de PAHs em bacias hidrográficas e sedimentos subterrâneos. A precipitação atmosférica agrava ainda mais a poluição por PAHs. Altas concentrações de PAHs e seus derivados alquilados (51 no total) foram relatadas em rios/bacias hidrográficas em todo o mundo, como os rios Fraser, Louan, Denso, Missouri, Anacostia, Ebro e Delaware (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). Nos sedimentos da bacia do rio Ganges, o naftaleno e o fenantreno foram considerados os mais significativos (detectados em 70% das amostras) (Duttagupta et al., 2019). Além disso, estudos demonstraram que a cloração da água potável pode levar à formação de PAHs oxigenados e clorados mais tóxicos (Manoli e Samara, 1999). Os PAHs se acumulam em cereais, frutas e vegetais como resultado da absorção pelas plantas a partir de solos, águas subterrâneas e precipitação contaminados (Fismes et al., 2002). Muitos organismos aquáticos, como peixes, mexilhões, amêijoas e camarões, são contaminados com PAHs pelo consumo de alimentos e água do mar contaminados, bem como por meio de tecidos e pele (Mackay e Fraser, 2000). Métodos de cozimento/processamento, como grelhar, assar, defumar, fritar, secar, assar no forno e cozinhar em carvão, também podem levar a quantidades significativas de PAHs nos alimentos. Isso depende em grande parte da escolha do material para defumar, do teor de hidrocarbonetos fenólicos/aromáticos, do método de cozimento, do tipo de aquecedor, do teor de umidade, do suprimento de oxigênio e da temperatura de combustão (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) também foram detectados no leite em concentrações variáveis ​​(0,75–2,1 mg/L) (Girelli et al., 2014). O acúmulo desses HAPs nos alimentos também depende das propriedades físico-químicas dos alimentos, enquanto seus efeitos tóxicos estão relacionados às funções fisiológicas, à atividade metabólica, à absorção, à distribuição e à distribuição corporal (Mechini et al., 2011).
A toxicidade e os efeitos nocivos dos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) são conhecidos há muito tempo (Cherniglia, 1984). Hidrocarbonetos aromáticos policíclicos de baixo peso molecular (HAPs-BPM) (dois a três anéis) podem se ligar covalentemente a várias macromoléculas, como DNA, RNA e proteínas, e são carcinogênicos (Santarelli et al., 2008). Devido à sua natureza hidrofóbica, eles são separados por membranas lipídicas. Em humanos, as monooxigenases do citocromo P450 oxidam os HAPs a epóxidos, alguns dos quais são altamente reativos (por exemplo, epóxido de baediol) e podem levar à transformação de células normais em malignas (Marston et al., 2001). Além disso, os produtos de transformação dos HAPs, como quinonas, fenóis, epóxidos, dióis, etc., são mais tóxicos do que os compostos originais. Alguns PAHs e seus intermediários metabólicos podem afetar hormônios e diversas enzimas no metabolismo, prejudicando o crescimento, o sistema nervoso central, os sistemas reprodutivo e imunológico (Swetha e Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). A exposição de curto prazo a PAHs de baixo peso molecular tem sido associada à disfunção pulmonar e trombose em asmáticos, além de aumentar o risco de câncer de pele, pulmão, bexiga e trato gastrointestinal (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Estudos em animais também demonstraram que a exposição a PAHs pode ter efeitos adversos na função reprodutiva e no desenvolvimento, podendo causar catarata, danos renais e hepáticos e icterícia. Diversos produtos de biotransformação de PAHs, como dióis, epóxidos, quinonas e radicais livres (cátions), demonstraram formar adutos de DNA. Foi demonstrado que os adutos estáveis ​​alteram a maquinaria de replicação do DNA, enquanto os adutos instáveis ​​podem despurinar o DNA (principalmente em adenina e, às vezes, em guanina); ambos podem gerar erros que levam a mutações (Schweigert et al. 2001). Além disso, as quinonas (benzo/pan) podem gerar espécies reativas de oxigênio (ROS), causando danos fatais ao DNA e a outras macromoléculas, afetando assim a função/viabilidade dos tecidos (Ewa e Danuta 2017). A exposição crônica a baixas concentrações de pireno, bifenil e naftaleno foi relatada como causadora de câncer em animais de experimentação (Diggs et al. 2012). Devido à sua toxicidade letal, a limpeza/remoção desses PAHs de locais afetados/contaminados é uma prioridade.
Diversos métodos físicos e químicos têm sido utilizados para remover PAHs de locais/ambientes contaminados. Processos como incineração, decloração, oxidação UV, fixação e extração por solventes apresentam muitas desvantagens, incluindo a formação de subprodutos tóxicos, complexidade do processo, questões de segurança e regulamentação, baixa eficiência e alto custo. No entanto, a biodegradação microbiana (também chamada de biorremediação) é uma abordagem alternativa promissora que envolve o uso de microrganismos na forma de culturas puras ou colônias. Comparado aos métodos físicos e químicos, esse processo é ecologicamente correto, não invasivo, econômico e sustentável. A biorremediação pode ser realizada no local afetado (in situ) ou em um local especialmente preparado (ex situ) e, portanto, é considerada um método de remediação mais sustentável do que os métodos físicos e químicos tradicionais (Juhasz e Naidu, 2000; Andreoni e Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
A compreensão das etapas metabólicas microbianas envolvidas na degradação de poluentes aromáticos tem enormes implicações científicas e econômicas para a sustentabilidade ecológica e ambiental. Estima-se que 2,1 × 10¹⁸ gramas de carbono (C) estejam armazenadas em sedimentos e compostos orgânicos (ou seja, petróleo, gás natural e carvão, ou seja, combustíveis fósseis) em todo o mundo, contribuindo significativamente para o ciclo global do carbono. No entanto, a rápida industrialização, a extração de combustíveis fósseis e as atividades humanas estão esgotando esses reservatórios de carbono da litosfera, liberando cerca de 5,5 × 10¹⁵ g de carbono orgânico (como poluentes) na atmosfera anualmente (Gonzalez-Gaya et al., 2019). A maior parte desse carbono orgânico entra nos ecossistemas terrestres e marinhos por meio de sedimentação, transporte e escoamento superficial. Além disso, novos poluentes sintéticos derivados de combustíveis fósseis, como plásticos, plastificantes e estabilizadores de plástico (ftalatos e seus isômeros), poluem seriamente os ecossistemas marinhos, terrestres e aquáticos e sua biota, exacerbando assim os riscos climáticos globais. Diversos tipos de microplásticos, nanoplásticos, fragmentos de plástico e seus produtos monoméricos tóxicos derivados do tereftalato de polietileno (PET) acumularam-se no Oceano Pacífico, entre a América do Norte e o Sudeste Asiático, formando a “Grande Mancha de Lixo do Pacífico”, prejudicando a vida marinha (Newell et al., 2020). Estudos científicos comprovam que não é possível remover esses poluentes/resíduos por métodos físicos ou químicos. Nesse contexto, os microrganismos mais úteis são aqueles capazes de metabolizar oxidativamente os poluentes em dióxido de carbono, energia química e outros subprodutos não tóxicos que, eventualmente, entram em outros processos de ciclagem de nutrientes (H, O, N, S, P, Fe, etc.). Assim, compreender a ecofisiologia microbiana da mineralização de poluentes aromáticos e seu controle ambiental é crucial para avaliar o ciclo microbiano do carbono, o balanço líquido de carbono e os riscos climáticos futuros. Diante da necessidade urgente de remover esses compostos do meio ambiente, diversas ecoindústrias focadas em tecnologias limpas têm surgido. Alternativamente, a valorização de resíduos industriais/resíduos químicos acumulados em ecossistemas (ou seja, a abordagem "resíduo em riqueza") é considerada um dos pilares da economia circular e dos objetivos de desenvolvimento sustentável (Close et al., 2012). Portanto, a compreensão dos aspectos metabólicos, enzimáticos e genéticos desses potenciais candidatos à degradação é de extrema importância para a remoção e biorremediação eficazes de tais poluentes aromáticos.
Dentre os diversos poluentes aromáticos, damos especial atenção aos PAHs de baixo peso molecular, como o naftaleno e os naftalenos substituídos. Esses compostos são componentes importantes de combustíveis derivados de petróleo, corantes têxteis, produtos de consumo, pesticidas (naftalina e repelentes de insetos), plastificantes e taninos, sendo, portanto, amplamente distribuídos em muitos ecossistemas (Preuss et al., 2003). Relatórios recentes destacam o acúmulo de concentrações de naftaleno em sedimentos de aquíferos, águas subterrâneas e solos subsuperficiais, zonas vadosas e leitos de rios, sugerindo sua bioacumulação no meio ambiente (Duttagupta et al., 2019, 2020). A Tabela 2 resume as propriedades físico-químicas, aplicações e efeitos na saúde do naftaleno e seus derivados. Em comparação com outros PAHs de alto peso molecular, o naftaleno e seus derivados são menos hidrofóbicos, mais solúveis em água e amplamente distribuídos nos ecossistemas, sendo frequentemente utilizados como substratos modelo para o estudo do metabolismo, da genética e da diversidade metabólica dos PAHs. Um grande número de microrganismos é capaz de metabolizar o naftaleno e seus derivados, e informações abrangentes estão disponíveis sobre suas vias metabólicas, enzimas e características regulatórias (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Além disso, o naftaleno e seus derivados são designados como compostos protótipos para a avaliação da poluição ambiental devido à sua alta abundância e biodisponibilidade. A Agência de Proteção Ambiental dos EUA estima que os níveis médios de naftaleno são de 5,19 μg por metro cúbico na fumaça do cigarro, principalmente devido à combustão incompleta, e de 7,8 a 46 μg na fumaça secundária, enquanto a exposição ao creosoto e ao naftaleno é de 100 a 10.000 vezes maior (Preuss et al., 2003). O naftaleno, em particular, apresenta toxicidade respiratória e carcinogenicidade específicas para cada espécie, região e sexo. Com base em estudos com animais, a Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (IARC) classificou o naftaleno como um “possível carcinógeno humano” (Grupo 2B)¹. A exposição a naftalenos substituídos, principalmente por inalação ou administração parenteral (oral), causa lesão no tecido pulmonar e aumenta a incidência de tumores pulmonares em ratos e camundongos (Programa Nacional de Toxicologia 2). Os efeitos agudos incluem náuseas, vômitos, dor abdominal, diarreia, cefaleia, confusão, sudorese profusa, febre, taquicardia, etc. Por outro lado, o inseticida carbamato de amplo espectro carbaryl (1-naftil N-metilcarbamato) tem sido relatado como tóxico para invertebrados aquáticos, anfíbios, abelhas e humanos, e demonstrou inibir a acetilcolinesterase, causando paralisia (Smulders et al., 2003; Bulen e Distel, 2011). Portanto, a compreensão dos mecanismos de degradação microbiana, regulação genética e reações enzimáticas e celulares é crucial para o desenvolvimento de estratégias de biorremediação em ambientes contaminados.
Tabela 2. Informações detalhadas sobre as propriedades físico-químicas, usos, métodos de identificação e doenças associadas ao naftaleno e seus derivados.
Em nichos poluídos, poluentes aromáticos hidrofóbicos e lipofílicos podem causar uma variedade de efeitos celulares no microbioma ambiental (comunidade), como alterações na fluidez da membrana, permeabilidade da membrana, inchaço da bicamada lipídica, interrupção da transferência de energia (cadeia de transporte de elétrons/força próton-motriz) e atividade de proteínas associadas à membrana (Sikkema et al., 1995). Além disso, alguns intermediários solúveis, como catecóis e quinonas, geram espécies reativas de oxigênio (ROS) e formam adutos com DNA e proteínas (Penning et al., 1999). Assim, a abundância desses compostos em ecossistemas exerce pressão seletiva sobre as comunidades microbianas para que se tornem degradadoras eficientes em vários níveis fisiológicos, incluindo absorção/transporte, transformação intracelular, assimilação/utilização e compartimentalização.
Uma busca no Ribosomal Database Project-II (RDP-II) revelou que um total de 926 espécies bacterianas foram isoladas de meios de cultura ou culturas de enriquecimento contaminadas com naftaleno ou seus derivados. O grupo Proteobacteria apresentou o maior número de representantes (n = 755), seguido por Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) e bactérias não classificadas (8) (Figura 2). Representantes de γ-Proteobacteria (Pseudomonadales e Xanthomonadales) dominaram todos os grupos Gram-negativos com alto teor de G+C (54%), enquanto Clostridiales e Bacillales (30%) foram grupos Gram-positivos com baixo teor de G+C. Foi relatado que as Pseudomonas (o maior número, 338 espécies) são capazes de degradar naftaleno e seus derivados metilados em diversos ecossistemas poluídos (alcatrão de carvão, petróleo, óleo bruto, lodo, derramamentos de óleo, águas residuais, resíduos orgânicos e aterros sanitários), bem como em ecossistemas intactos (solo, rios, sedimentos e águas subterrâneas) (Figura 2). Além disso, estudos de enriquecimento e análises metagenômicas de algumas dessas regiões revelaram que espécies não cultivadas de Legionella e Clostridium podem ter capacidade degradativa, indicando a necessidade de cultivar essas bactérias para estudar novas vias metabólicas e a diversidade metabólica.
Figura 2. Diversidade taxonômica e distribuição ecológica de representantes bacterianos em ambientes contaminados com naftaleno e derivados de naftaleno.
Dentre os diversos microrganismos degradadores de hidrocarbonetos aromáticos, a maioria é capaz de degradar o naftaleno como única fonte de carbono e energia. A sequência de eventos envolvidos no metabolismo do naftaleno foi descrita para Pseudomonas sp. (cepas: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 e CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 e outras cepas (ND6 e AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis e Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; O metabolismo é iniciado por uma dioxigenase multicomponente [naftaleno dioxigenase (NDO), uma dioxigenase hidroxilante de anel] que catalisa a oxidação de um dos anéis aromáticos do naftaleno usando oxigênio molecular como o outro substrato, convertendo o naftaleno em cis-naftalenodiol (Figura 3). O cis-diidrodiol é convertido em O 1,2-diidroxinaftaleno é degradado por uma desidrogenase. Uma dioxigenase que cliva o anel, a 1,2-diidroxinaftaleno dioxigenase (12DHNDO), converte o 1,2-diidroxinaftaleno em ácido 2-hidroxicromeno-2-carboxílico. A isomerização enzimática cis-trans produz trans-o-hidroxibenzilidenopiruvato, que é clivado pela hidratase aldolase em salicilaldeído e piruvato. O ácido orgânico piruvato foi o primeiro composto C3 derivado do esqueleto de carbono do naftaleno e direcionado para a via central do carbono. Além disso, a salicilaldeído desidrogenase dependente de NAD+ converte o salicilaldeído em ácido salicílico. O metabolismo nesta etapa é chamado de "via superior" da degradação do naftaleno. Esta via é muito comum na maioria das bactérias degradadoras de naftaleno. No entanto, existem algumas exceções; Por exemplo, no Bacillus hamburgii 2 termofílico, a degradação do naftaleno é iniciada pela naftaleno 2,3-dioxigenase para formar 2,3-diidroxinaftaleno (Annweiler et al., 2000).
Figura 3. Vias de degradação de naftaleno, metilnaftaleno, ácido naftoico e carbaril. Os números circulados representam as enzimas responsáveis ​​pela conversão sequencial do naftaleno e seus derivados em produtos subsequentes. 1 — naftaleno dioxigenase (NDO); 2, cis-diidrodiol desidrogenase; 3, 1,2-diidroxinaftaleno dioxigenase; 4, 2-hidroxicromeno-2-ácido carboxílico isomerase; 5, trans-O-hidroxibenzilidenopiruvato hidratase aldolase; 6, salicilaldeído desidrogenase; 7, salicilato 1-hidroxilase; 8, catecol 2,3-dioxigenase (C23DO); 9, 2-hidroximuconato semialdeído desidrogenase; 10, 2-oxopent-4-enoato hidratase; 11, 4-hidroxi-2-oxopentanoato aldolase; 12, acetaldeído desidrogenase; 13, catecol-1,2-dioxigenase (C12DO); 14, muconato cicloisomerase; 15, muconolactona delta-isomerase; 16, β-cetoadipatenolactona hidrolase; 17, β-cetoadipato succinil-CoA transferase; 18, β-cetoadipato-CoA tiolase; 19, succinil-CoA: acetil-CoA succiniltransferase; 20, salicilato 5-hidroxilase; 21 – gentisato 1,2-dioxigenase (GDO); 22, maleilpiruvato isomerase; 23, fumarilpiruvato hidrolase; 24, metilnaftaleno hidroxilase (NDO); 25, hidroximetilnaftaleno desidrogenase; 26, naftaldeído desidrogenase; 27, 3-formilsalicílico ácido oxidase; 28, hidroxi-isofitalato descarboxilase; 29, carbaryl hidrolase (CH); 30, 1-naftol-2-hidroxilase.
Dependendo do organismo e de sua constituição genética, o ácido salicílico resultante é metabolizado posteriormente pela via do catecol, utilizando a salicilato 1-hidroxilase (S1H), ou pela via do gentisato, utilizando a salicilato 5-hidroxilase (S5H) (Figura 3). Como o ácido salicílico é o principal intermediário no metabolismo do naftaleno (via superior), as etapas do ácido salicílico até o intermediário do ciclo de Krebs são frequentemente denominadas via inferior, e os genes são organizados em um único operon. É comum observar que os genes do operon da via superior (nah) e do operon da via inferior (sal) são regulados por fatores regulatórios comuns; por exemplo, NahR e o ácido salicílico atuam como indutores, permitindo que ambos os operons metabolizem completamente o naftaleno (Phale et al., 2019, 2020).
Além disso, o catecol é clivado ciclicamente em semialdeído 2-hidroximuconato pela via meta, catalisado pela catecol 2,3-dioxigenase (C23DO) (Yen et al., 1988), e posteriormente hidrolisado pela hidrolase de semialdeído 2-hidroximuconato para formar ácido 2-hidroxipent-2,4-dienoico. O 2-hidroxipent-2,4-dienoato é então convertido em piruvato e acetaldeído por uma hidratase (hidratase de 2-oxopent-4-enoato) e uma aldolase (aldolase de 4-hidroxi-2-oxopentanoato), entrando em seguida na via do carbono central (Figura 3). Alternativamente, o catecol é clivado ciclicamente em cis,cis-muconato pela via orto, catalisado pela catecol 1,2-oxigenase (C12DO). A muconato cicloisomerase, a muconolactona isomerase e a β-cetoadipato-nolactona hidrolase convertem o cis,cis-muconato em 3-oxoadipato, que entra na via central do carbono através do succinil-CoA e do acetil-CoA (Nozaki et al., 1968) (Figura 3).
Na via do gentisato (2,5-diidroxibenzoato), o anel aromático é clivado pela gentisato 1,2-dioxigenase (GDO) para formar maleilpiruvato. Este produto pode ser hidrolisado diretamente a piruvato e malato, ou pode ser isomerizado para formar fumarilpiruvato, que pode então ser hidrolisado a piruvato e fumarato (Larkin e Day, 1986). A escolha da via alternativa foi observada tanto em bactérias Gram-negativas quanto em Gram-positivas, nos níveis bioquímico e genético (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). As bactérias Gram-negativas (Pseudomonas) preferem utilizar o ácido salicílico, que é um indutor do metabolismo do naftaleno, descarboxilando-o a catecol pela salicilato 1-hidroxilase (Gibson e Subramanian, 1984). Por outro lado, em bactérias Gram-positivas (Rhodococcus), a salicilato 5-hidroxilase converte o ácido salicílico em ácido gentísico, enquanto o ácido salicílico não tem efeito indutivo na transcrição de genes de naftaleno (Grund et al., 1992) (Figura 3).
Foi relatado que espécies como Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas e espécies de Mycobacterium podem degradar monometilnaftaleno ou dimetilnaftaleno (Dean-Raymond e Bartha, 1975; Cane e Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Entre elas, a via de degradação de 1-metilnaftaleno e 2-metilnaftaleno de Pseudomonas sp. CSV86 foi claramente estudada nos níveis bioquímico e enzimático (Mahajan et al., 1994). O 1-metilnaftaleno é metabolizado por duas vias. Primeiro, o anel aromático é hidroxilado (o anel não substituído do metilnaftaleno) para formar cis-1,2-di-hidroxi-1,2-di-hidro-8-metilnaftaleno, que é posteriormente oxidado a salicilato de metila e metilcatecol, e então entra na via central do carbono após a clivagem do anel (Figura 3). Essa via é chamada de “via da fonte de carbono”. Na segunda “via de desintoxicação”, o grupo metil pode ser hidroxilado pela NDO para formar 1-hidroximetilnaftaleno, que é posteriormente oxidado a ácido 1-naftoico e excretado no meio de cultura como um produto final. Estudos demonstraram que a cepa CSV86 é incapaz de crescer utilizando ácido 1- e 2-naftoico como única fonte de carbono e energia, confirmando sua via de desintoxicação (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). No 2-metilnaftaleno, o grupo metil sofre hidroxilação pela hidroxilase, formando 2-hidroximetilnaftaleno. Além disso, o anel não substituído do naftaleno sofre hidroxilação, formando um diidrodiol, que é oxidado a 4-hidroximetilcatecol em uma série de reações catalisadas por enzimas e entra na via central do carbono através da via de clivagem meta-anel. De forma semelhante, foi relatado que S. paucimobilis 2322 utiliza NDO para hidroxilar o 2-metilnaftaleno, que é posteriormente oxidado para formar salicilato de metila e metilcatecol (Dutta et al., 1998).
Os ácidos naftoicos (substituídos/não substituídos) são subprodutos da desintoxicação/biotransformação formados durante a degradação do metilnaftaleno, fenantreno e antraceno, sendo liberados no meio de cultura esgotado. Foi relatado que a bactéria isolada do solo Stenotrophomonas maltophilia CSV89 é capaz de metabolizar o ácido 1-naftoico como fonte de carbono (Phale et al., 1995). O metabolismo inicia-se com a di-hidroxilação do anel aromático para formar 1,2-di-hidroxi-8-carboxinaftaleno. O diol resultante é oxidado a catecol via 2-hidroxi-3-carboxibenzilidenopiruvato, ácido 3-formilsalicílico, ácido 2-hidroxi-isoftálico e ácido salicílico, entrando na via central do carbono através da clivagem do anel meta (Figura 3).
O carbaril é um pesticida naftil carbamato. Desde a Revolução Verde na Índia, na década de 1970, o uso de fertilizantes e pesticidas químicos levou a um aumento nas emissões de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) provenientes de fontes agrícolas difusas (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Estima-se que 55% (85.722.000 hectares) do total de terras cultiváveis ​​na Índia sejam tratadas com pesticidas químicos. Nos últimos cinco anos (2015-2020), o setor agrícola indiano utilizou, em média, de 55.000 a 60.000 toneladas de pesticidas anualmente (Departamento de Cooperativas e Bem-Estar dos Agricultores, Ministério da Agricultura, Governo da Índia, agosto de 2020). Nas planícies gangéticas do norte e do centro (os estados com maior população e densidade populacional), o uso de pesticidas nas lavouras é generalizado, com predominância de inseticidas. O carbaril (1-naftil-N-metilcarbamato) é um inseticida carbamato de amplo espectro, com toxicidade moderada a alta, utilizado na agricultura indiana em uma taxa média de 100 a 110 toneladas. É comumente comercializado sob o nome Sevin e usado para controlar insetos (pulgões, formigas-de-fogo, pulgas, ácaros, aranhas e muitas outras pragas externas) que afetam diversas culturas (milho, soja, algodão, frutas e hortaliças). Alguns microrganismos, como Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus e Arthrobacter, também podem ser usados ​​para controlar outras pragas. Foi relatado que a RC100 pode degradar o carbaril (Larkin e Day, 1986; Chapalamadugu e Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha e Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). A via de degradação do carbaril foi extensivamente estudada nos níveis bioquímico, enzimático e genético em isolados de solo de Pseudomonas sp. Cepas C4, C5 e C6 (Swetha e Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (Fig. 3). A via metabólica inicia-se com a hidrólise da ligação éster pela carbaril hidrolase (CH) para formar 1-naftol, metilamina e dióxido de carbono. O 1-naftol é então convertido em 1,2-diidroxinaftaleno pela 1-naftol hidroxilase (1-NH), que é posteriormente metabolizado pela via do carbono central através do salicilato e do gentisato. Algumas bactérias degradadoras de carbaryl metabolizam-no em ácido salicílico por meio da clivagem do anel orto do catecol (Larkin e Day, 1986; Chapalamadugu e Chaudhry, 1991). Notavelmente, as bactérias degradadoras de naftaleno metabolizam principalmente o ácido salicílico via catecol, enquanto as bactérias degradadoras de carbaryl preferem metabolizar o ácido salicílico pela via do gentisato.
Os derivados de ácido naftalenossulfônico/ácido dissulfônico e ácido naftilaminasulfônico podem ser usados ​​como intermediários na produção de corantes azoicos, agentes umectantes, dispersantes, etc. Embora esses compostos apresentem baixa toxicidade para humanos, avaliações de citotoxicidade demonstraram que são letais para peixes, dáfnias e algas (Greim et al., 1994). Representantes do gênero Pseudomonas (cepas A3, C22) iniciam o metabolismo por dupla hidroxilação do anel aromático contendo o grupo ácido sulfônico, formando um diidrodiol, que é posteriormente convertido em 1,2-diidroxinaftaleno por clivagem espontânea do grupo sulfito (Brilon et al., 1981). O 1,2-diidroxinaftaleno resultante é catabolizado pela via clássica do naftaleno, ou seja, a via do catecol ou do gentisato (Figura 4). Foi demonstrado que o ácido aminonaftalenossulfônico e o ácido hidroxinaftalenossulfônico podem ser completamente degradados por consórcios bacterianos mistos com vias catabólicas complementares (Nortemann et al., 1986). Foi demonstrado que um membro do consórcio dessulfura o ácido aminonaftalenossulfônico ou o ácido hidroxinaftalenossulfônico por 1,2-dioxigenação, enquanto o aminosalicilato ou o hidroxisalicilato é liberado no meio de cultura como um metabólito final e é subsequentemente absorvido por outros membros do consórcio. O ácido naftalenodissulfônico é relativamente polar, mas pouco biodegradável e, portanto, pode ser metabolizado por diferentes vias. A primeira dessulfuração ocorre durante a di-hidroxilação regiosseletiva do anel aromático e do grupo ácido sulfônico; A segunda dessulfurização ocorre durante a hidroxilação do ácido 5-sulfosalicílico pela salicilato 5-hidroxilase para formar ácido gentísico, que entra na via central do carbono (Brilon et al., 1981) (Figura 4). As enzimas responsáveis ​​pela degradação do naftaleno também são responsáveis ​​pelo metabolismo do sulfonato de naftaleno (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
Figura 4. Vias metabólicas para a degradação do naftaleno sulfonato. Os números dentro dos círculos representam as enzimas responsáveis ​​pelo metabolismo do naftil sulfonato, semelhantes/idênticas às enzimas descritas na Figura 3.
Os PAHs de baixo peso molecular (LMW-PAHs) são redutíveis, hidrofóbicos e pouco solúveis, e, portanto, não suscetíveis à degradação natural. No entanto, microrganismos aeróbicos são capazes de oxidá-los pela absorção de oxigênio molecular (O₂). Essas enzimas pertencem principalmente à classe das oxidorredutases e podem realizar diversas reações, como hidroxilação do anel aromático (mono- ou di-hidroxilação), desidrogenação e clivagem do anel aromático. Os produtos obtidos dessas reações encontram-se em um estado de oxidação mais elevado e são metabolizados mais facilmente pela via central do carbono (Phale et al., 2020). As enzimas da via de degradação são consideradas induzíveis. A atividade dessas enzimas é muito baixa ou desprezível quando as células são cultivadas em fontes de carbono simples, como glicose ou ácidos orgânicos. A Tabela 3 resume as diversas enzimas (oxigenases, hidrolases, desidrogenases, oxidases, etc.) envolvidas no metabolismo do naftaleno e seus derivados.
Tabela 3. Características bioquímicas das enzimas responsáveis ​​pela degradação do naftaleno e seus derivados.
Estudos com radioisótopos (18O2) demonstraram que a incorporação de O2 molecular em anéis aromáticos por oxigenases é a etapa mais importante na ativação da biodegradação subsequente de um composto (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). A incorporação de um átomo de oxigênio (O) do oxigênio molecular (O2) no substrato é iniciada por monooxigenases endógenas ou exógenas (também chamadas de hidroxilases). Outro átomo de oxigênio é reduzido a água. Monooxigenases exógenas reduzem a flavina com NADH ou NADPH, enquanto que em monooxigenases endógenas a flavina é reduzida pelo substrato. A posição da hidroxilação resulta em diversidade na formação do produto. Por exemplo, a salicilato 1-hidroxilase hidroxila o ácido salicílico na posição C1, formando catecol. Por outro lado, a salicilato 5-hidroxilase multicomponente (contendo subunidades de redutase, ferredoxina e oxigenase) hidroxila o ácido salicílico na posição C5, formando ácido gentísico (Yamamoto et al., 1965).
As dioxigenases incorporam dois átomos de O2 no substrato. Dependendo dos produtos formados, elas são divididas em dioxigenases hidroxilantes de anel e dioxigenases clivadoras de anel. As dioxigenases hidroxilantes de anel convertem substratos aromáticos em cis-diidrodióis (por exemplo, naftaleno) e são amplamente distribuídas entre as bactérias. Até o momento, foi demonstrado que organismos que contêm dioxigenases hidroxilantes de anel são capazes de crescer em diversas fontes de carbono aromáticas, e essas enzimas são classificadas como NDO (naftaleno), dioxigenase de tolueno (TDO, tolueno) e dioxigenase de bifenil (BPDO, bifenil). Tanto a NDO quanto a BPDO podem catalisar a dupla oxidação e a hidroxilação da cadeia lateral de vários hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (tolueno, nitrotolueno, xileno, etilbenzeno, naftaleno, bifenil, fluoreno, indol, metilnaftaleno, naftalenossulfonato, fenantreno, antraceno, acetofenona, etc.) (Boyd e Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). A NDO é um sistema multicomponente constituído por uma oxidorredutase, uma ferredoxina e um componente oxigenase contendo o sítio ativo (Gibson e Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). A unidade catalítica da NDO consiste em uma grande subunidade α e uma pequena subunidade β dispostas em uma configuração α3β3. A NDO pertence a uma grande família de oxigenases e sua subunidade α contém um sítio Rieske [2Fe-2S] e um ferro mononuclear não-heme, que determina a especificidade do substrato da NDO (Parales et al., 1998). Tipicamente, em um ciclo catalítico, dois elétrons da redução do nucleotídeo de piridina são transferidos para o íon Fe(II) no sítio ativo através de uma redutase, uma ferredoxina e um sítio Rieske. Os equivalentes redutores ativam o oxigênio molecular, que é um pré-requisito para a di-hidroxilação do substrato (Ferraro et al., 2005). Até o momento, apenas algumas NDOs foram purificadas e caracterizadas em detalhes a partir de diferentes cepas, e o controle genético das vias envolvidas na degradação do naftaleno foi estudado detalhadamente (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). As dioxigenases que clivam o anel (enzimas que clivam o anel endo ou orto e enzimas que clivam o anel exodiol ou meta) atuam sobre compostos aromáticos hidroxilados. Por exemplo, a dioxigenase que cliva o anel orto é a catecol-1,2-dioxigenase, enquanto a dioxigenase que cliva o anel meta é a catecol-2,3-dioxigenase (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Além das diversas oxigenases, existem também várias desidrogenases responsáveis ​​pela desidrogenação de diidrodióis aromáticos, álcoois e aldeídos, utilizando NAD+/NADP+ como aceptores de elétrons, sendo algumas das enzimas importantes envolvidas no metabolismo (Gibson e Subramanian, 1984; Shaw e Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Enzimas como as hidrolases (esterases, amidases) são uma segunda classe importante de enzimas que utilizam água para clivar ligações covalentes e exibem ampla especificidade de substrato. A carbaryl hidrolase e outras hidrolases são consideradas componentes do periplasma (transmembrana) em membros de bactérias Gram-negativas (Kamini et al., 2018). A carbaryl possui ligações amida e éster; portanto, pode ser hidrolisada tanto por esterase quanto por amidase para formar 1-naftol. Foi relatado que a carbaryl na cepa AC10023 de Rhizobium rhizobium e na cepa RC100 de Arthrobacter funciona como uma esterase e uma amidase, respectivamente. Na cepa RC100 de Arthrobacter, a carbaryl também funciona como uma amidase. Foi demonstrado que a RC100 hidrolisa quatro inseticidas da classe N-metilcarbamato, como carbaril, metomil, ácido mefenâmico e XMC (Hayaatsu et al., 2001). Foi relatado que a CH em Pseudomonas sp. C5pp pode atuar sobre carbaril (100% de atividade) e acetato de 1-naftila (36% de atividade), mas não sobre 1-naftilacetamida, indicando que se trata de uma esterase (Trivedi et al., 2016).
Estudos bioquímicos, padrões de regulação enzimática e análises genéticas demonstraram que os genes da degradação do naftaleno consistem em duas unidades regulatórias induzíveis ou “operons”: nah (a “via a montante”, que converte o naftaleno em ácido salicílico) e sal (a “via a jusante”, que converte o ácido salicílico na via central do carbono via catecol). O ácido salicílico e seus análogos podem atuar como indutores (Shamsuzzaman e Barnsley, 1974). Na presença de glicose ou ácidos orgânicos, o operon é reprimido. A Figura 5 mostra a organização genética completa da degradação do naftaleno (na forma de operon). Diversas variantes/formas nomeadas do gene nah (ndo/pah/dox) foram descritas e apresentaram alta homologia de sequência (90%) entre todas as espécies de Pseudomonas (Abbasian et al., 2016). Os genes da via a montante do naftaleno foram geralmente organizados em uma ordem de consenso, como mostrado na Figura 5A. Outro gene, nahQ, também foi relatado como envolvido no metabolismo do naftaleno e geralmente está localizado entre nahC e nahE, mas sua função exata ainda precisa ser elucidada. Da mesma forma, o gene nahY, responsável pela quimiotaxia sensível ao naftaleno, foi encontrado na extremidade distal do operon nah em alguns membros. Em Ralstonia sp., o gene U2, que codifica a glutationa S-transferase (gsh), foi encontrado entre nahAa e nahAb, mas não afetou as características de utilização do naftaleno (Zylstra et al., 1997).
Figura 5. Organização genética e diversidade observadas durante a degradação do naftaleno entre espécies bacterianas; (A) Via superior do naftaleno, metabolismo do naftaleno em ácido salicílico; (B) Via inferior do naftaleno, ácido salicílico via catecol para a via central do carbono; (C) ácido salicílico via gentisato para a via central do carbono.
A “via inferior” (operon sal) tipicamente consiste em nahGTHINLMOKJ e converte salicilato em piruvato e acetaldeído através da via de clivagem do anel metacarboxílico do catecol. O gene nahG (que codifica a salicilato hidroxilase) foi encontrado conservado na extremidade proximal do operon (Fig. 5B). Comparado com outras cepas degradadoras de naftaleno, em P. putida CSV86 os operons nah e sal estão em tandem e são muito semelhantes (cerca de 7,5 kb). Em algumas bactérias Gram-negativas, como Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 e P. putida AK5, o naftaleno é metabolizado como um metabólito central de carbono através da via do gentisato (na forma do operon sgp/nag). O cassete de genes é tipicamente representado na forma nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, onde nagR (que codifica um regulador do tipo LysR) está localizado na extremidade superior (Figura 5C).
O carbaril entra no ciclo central do carbono através do metabolismo de 1-naftol, 1,2-diidroxinaftaleno, ácido salicílico e ácido gentísico (Figura 3). Com base em estudos genéticos e metabólicos, foi proposto dividir essa via em “a montante” (conversão de carbaril em ácido salicílico), “intermediária” (conversão de ácido salicílico em ácido gentísico) e “a jusante” (conversão de ácido gentísico em intermediários da via central do carbono) (Singh et al., 2013). A análise genômica de C5pp (supercontig A, 76,3 kb) revelou que o gene mcbACBDEF está envolvido na conversão de carbaril em ácido salicílico, seguido por mcbIJKL na conversão de ácido salicílico em ácido gentísico e mcbOQP na conversão de ácido gentísico em intermediários de carbono central (fumarato e piruvato, Trivedi et al., 2016) (Figura 6).
Foi relatado que enzimas envolvidas na degradação de hidrocarbonetos aromáticos (incluindo naftaleno e ácido salicílico) podem ser induzidas pelos compostos correspondentes e inibidas por fontes simples de carbono, como glicose ou ácidos orgânicos (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Entre as diversas vias metabólicas do naftaleno e seus derivados, as características regulatórias do naftaleno e do carbaril foram estudadas até certo ponto. Para o naftaleno, os genes nas vias a montante e a jusante são regulados por NahR, um regulador positivo trans-ativo do tipo LysR. Ele é necessário para a indução do gene nah pelo ácido salicílico e sua subsequente expressão em alto nível (Yen e Gunsalus, 1982). Além disso, estudos demonstraram que o fator de integração do hospedeiro (IHF) e o XylR (regulador transcricional dependente de sigma 54) também são cruciais para a ativação transcricional de genes no metabolismo do naftaleno (Ramos et al., 1997). Estudos mostraram que enzimas da via de abertura do anel meta do catecol, especificamente a catecol 2,3-dioxigenase, são induzidas na presença de naftaleno e/ou ácido salicílico (Basu et al., 2006). Estudos mostraram que enzimas da via de abertura do anel orto do catecol, especificamente a catecol 1,2-dioxigenase, são induzidas na presença de ácido benzoico e cis,cis-muconato (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
Na cepa C5pp, cinco genes, mcbG, mcbH, mcbN, mcbR e mcbS, codificam reguladores pertencentes à família de reguladores transcricionais LysR/TetR, responsáveis ​​pelo controle da degradação de carbaril. O gene homólogo mcbG apresentou maior similaridade com o regulador do tipo LysR PhnS (58% de identidade de aminoácidos) envolvido no metabolismo do fenantreno em Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). O gene mcbH está envolvido na via intermediária (conversão de ácido salicílico em ácido gentísico) e pertence à família de reguladores transcricionais LysR NagR/DntR/NahR em Pseudomonas e Burkholderia. Membros dessa família reconhecem o ácido salicílico como uma molécula efetora específica para a indução de genes de degradação. Por outro lado, três genes, mcbN, mcbR e mcbS, pertencentes aos reguladores transcricionais do tipo LysR e TetR, foram identificados na via metabólica a jusante (metabólitos da via central do carbono do gentisato).
Em procariontes, os processos de transferência horizontal de genes (aquisição, troca ou transferência) via plasmídeos, transposons, profagos, ilhas genômicas e elementos conjugativos integrativos (ICEs) são as principais causas de plasticidade nos genomas bacterianos, levando ao ganho ou à perda de funções/características específicas. Isso permite que as bactérias se adaptem rapidamente a diferentes condições ambientais, proporcionando potenciais vantagens metabólicas adaptativas ao hospedeiro, como a degradação de compostos aromáticos. As alterações metabólicas são frequentemente alcançadas por meio do ajuste fino dos operons de degradação, seus mecanismos regulatórios e especificidades enzimáticas, o que facilita a degradação de uma gama mais ampla de compostos aromáticos (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Os cassetes gênicos para a degradação do naftaleno foram encontrados em uma variedade de elementos móveis, como plasmídeos (conjugativos e não conjugativos), transposons, genomas, ICEs e combinações de diferentes espécies bacterianas (Figura 5). Em Pseudomonas G7, os operons nah e sal do plasmídeo NAH7 são transcritos na mesma orientação e fazem parte de um transposon defeituoso que requer a transposase Tn4653 para mobilização (Sota et al., 2006). Na cepa NCIB9816-4 de Pseudomonas, o gene foi encontrado no plasmídeo conjugativo pDTG1 como dois operons (separados por aproximadamente 15 kb) que foram transcritos em direções opostas (Dennis e Zylstra, 2004). Na cepa AK5 de Pseudomonas putida, o plasmídeo não conjugativo pAK5 codifica a enzima responsável pela degradação do naftaleno pela via do gentisato (Izmalkova et al., 2013). Na cepa PMD-1 de Pseudomonas, o operon nah está localizado no cromossomo, enquanto o operon sal está localizado no plasmídeo conjugativo pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Entretanto, em Pseudomonas stutzeri AN10, todos os genes de degradação de naftaleno (operons nah e sal) estão localizados no cromossomo e são presumivelmente recrutados por meio de eventos de transposição, recombinação e rearranjo (Bosch et al., 2000). Em Pseudomonas sp. CSV86, os operons nah e sal estão localizados no genoma na forma de ICE (ICECSV86). A estrutura é protegida por tRNAGly seguido por repetições diretas que indicam sítios de recombinação/ligação (attR e attL) e uma integrase semelhante à de fago localizada em ambas as extremidades do tRNAGly, sendo, portanto, estruturalmente similar ao elemento ICEclc (ICEclcB13 em Pseudomonas knackmusii para degradação de clorocatecol). Foi relatado que genes em ICE podem ser transferidos por conjugação com uma frequência de transferência extremamente baixa (10-8), transferindo assim propriedades de degradação para o receptor (Basu e Phale, 2008; Phale et al., 2019).
A maioria dos genes responsáveis ​​pela degradação do carbaril está localizada em plasmídeos. A bactéria Arthrobacter sp. RC100 contém três plasmídeos (pRC1, pRC2 e pRC300), dos quais dois plasmídeos conjugativos, pRC1 e pRC2, codificam as enzimas que convertem o carbaril em gentisato. Por outro lado, as enzimas envolvidas na conversão do gentisato em metabólitos centrais de carbono estão localizadas no cromossomo (Hayaatsu et al., 1999). Bactérias do gênero Rhizobium, como a cepa AC100, utilizada para a conversão de carbaril em 1-naftol, contêm o plasmídeo pAC200, que carrega o gene cehA, que codifica a enzima CH, como parte do transposon Tnceh, circundado por sequências semelhantes a elementos de inserção (istA e istB) (Hashimoto et al., 2002). Na cepa CF06 de Sphingomonas, acredita-se que o gene de degradação de carbaril esteja presente em cinco plasmídeos: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 e pCF05. A homologia de DNA desses plasmídeos é alta, indicando a ocorrência de um evento de duplicação gênica (Feng et al., 1997). Em um simbionte degradador de carbaril composto por duas espécies de Pseudomonas, a cepa 50581 contém um plasmídeo conjugativo pCD1 (50 kb) que codifica o gene da hidrolase de carbaril mcd, enquanto o plasmídeo conjugativo na cepa 50552 codifica uma enzima degradadora de 1-naftol (Chapalamadugu e Chaudhry, 1991). Na cepa WM111 de Achromobacter, o gene da hidrolase de furadano mcd está localizado em um plasmídeo de 100 kb (pPDL11). Foi demonstrado que este gene está presente em diferentes plasmídeos (100, 105, 115 ou 124 kb) em diferentes bactérias de diferentes regiões geográficas (Parekh et al., 1995). Em Pseudomonas sp. C5pp, todos os genes responsáveis ​​pela degradação de carbaril estão localizados em um genoma com 76,3 kb de sequência (Trivedi et al., 2016). A análise do genoma (6,15 Mb) revelou a presença de 42 elementos genéticos móveis (EGM) e 36 elementos genéticos intrínsecos (EGI), dos quais 17 EGM estavam localizados no supercontig A (76,3 kb) com um conteúdo médio de G+C assimétrico (54–60 mol%), sugerindo possíveis eventos de transferência horizontal de genes (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 exibe um arranjo semelhante de genes de degradação de carbaril, mas esses genes estão localizados em um plasmídeo (Zhu et al., 2019).
Além da eficiência metabólica nos níveis bioquímico e genômico, os microrganismos também exibem outras propriedades ou respostas, como quimiotaxia, propriedades de modificação da superfície celular, compartimentalização, utilização preferencial, produção de biossurfactantes, etc., que os ajudam a metabolizar poluentes aromáticos em ambientes contaminados de forma mais eficiente (Figura 7).
Figura 7. Diferentes estratégias de resposta celular de bactérias ideais para a degradação de hidrocarbonetos aromáticos, visando a biodegradação eficiente de compostos poluentes externos.
Respostas quimiotáticas são consideradas fatores que aumentam a degradação de poluentes orgânicos em ecossistemas heterogeneamente poluídos. (2002) demonstraram que a quimiotaxia de Pseudomonas sp. G7 para o naftaleno aumentou a taxa de degradação do naftaleno em sistemas aquáticos. A cepa selvagem G7 degradou o naftaleno muito mais rapidamente do que uma cepa mutante deficiente em quimiotaxia. A proteína NahY (538 aminoácidos com topologia de membrana) foi encontrada cotranscrita com os genes da via de metaclivagem no plasmídeo NAH7 e, assim como os transdutores de quimiotaxia, essa proteína parece funcionar como um quimiorreceptor para a degradação do naftaleno (Grimm e Harwood 1997). Outro estudo de Hansel et al. (2009) mostrou que a proteína é quimiotática, mas sua taxa de degradação é alta. Em 2011, pesquisadores demonstraram uma resposta quimiotática da Pseudomonas (P. putida) ao naftaleno gasoso, na qual a difusão na fase gasosa resultou em um fluxo constante de naftaleno para as células, o que controlou a resposta quimiotática destas. Os pesquisadores exploraram esse comportamento quimiotático para desenvolver microrganismos que aumentassem a taxa de degradação. Estudos mostraram que as vias quimiossensoriais também regulam outras funções celulares, como divisão celular, regulação do ciclo celular e formação de biofilme, auxiliando assim no controle da taxa de degradação. No entanto, o aproveitamento dessa propriedade (quimiotaxia) para uma degradação eficiente é dificultado por diversos obstáculos. Os principais são: (a) diferentes receptores paralogos reconhecem os mesmos compostos/ligantes; (b) existência de receptores alternativos, ou seja, tropismo energético; (c) diferenças significativas na sequência dos domínios sensoriais da mesma família de receptores. e (d) falta de informações sobre as principais proteínas sensoriais bacterianas (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Às vezes, a biodegradação de hidrocarbonetos aromáticos produz múltiplos metabólitos/intermediários, que podem ser quimiotáticos para um grupo de bactérias, mas repulsivos para outros, complicando ainda mais o processo. Para identificar as interações de ligantes (hidrocarbonetos aromáticos) com receptores químicos, construímos proteínas sensoriais híbridas (PcaY, McfR e NahY) pela fusão dos domínios sensoriais e de sinalização de Pseudomonas putida e Escherichia coli, que têm como alvo os receptores para ácidos aromáticos, intermediários do ciclo do ácido cítrico e naftaleno, respectivamente (Luu et al., 2019).
Sob a influência do naftaleno e de outros hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs), a estrutura da membrana bacteriana e a integridade dos microrganismos sofrem alterações significativas. Estudos demonstraram que o naftaleno interfere na interação da cadeia acil por meio de interações hidrofóbicas, aumentando, assim, o inchaço e a fluidez da membrana (Sikkema et al., 1995). Para contrabalançar esse efeito prejudicial, as bactérias regulam a fluidez da membrana alterando a proporção e a composição de ácidos graxos entre ácidos graxos de cadeia ramificada iso/anteiso e isomerizando ácidos graxos cis-insaturados nos isômeros trans correspondentes (Heipieper e de Bont, 1994). Em Pseudomonas stutzeri cultivada em meio tratado com naftaleno, a proporção de ácidos graxos saturados para insaturados aumentou de 1,1 para 2,1, enquanto em Pseudomonas JS150 essa proporção aumentou de 7,5 para 12,0 (Mrozik et al., 2004). Quando cultivadas em naftaleno, as células de Achromobacter KAs 3–5 exibiram agregação celular ao redor dos cristais de naftaleno e uma diminuição na carga da superfície celular (de -22,5 para -2,5 mV), acompanhada por condensação citoplasmática e vacuolização, indicando alterações na estrutura e nas propriedades da superfície celular (Mohapatra et al., 2019). Embora as alterações celulares/de superfície estejam diretamente associadas a uma melhor absorção de poluentes aromáticos, as estratégias de bioengenharia relevantes não foram completamente otimizadas. A manipulação da forma celular raramente tem sido utilizada para otimizar processos biológicos (Volke e Nikel, 2018). A deleção de genes que afetam a divisão celular causa alterações na morfologia celular. Em Bacillus subtilis, a proteína do septo celular SepF demonstrou estar envolvida na formação do septo e é necessária para as etapas subsequentes da divisão celular, mas não é um gene essencial. A deleção de genes que codificam hidrolases de glicanos peptídicos em Bacillus subtilis resultou em alongamento celular, aumento da taxa de crescimento específica e melhoria da capacidade de produção de enzimas (Cui et al., 2018).
A compartimentalização da via de degradação do carbaril foi proposta para alcançar a degradação eficiente das cepas C5pp e C7 de Pseudomonas (Kamini et al., 2018). Propõe-se que o carbaril seja transportado para o espaço periplásmico através do septo da membrana externa e/ou por porinas difusíveis. A CH é uma enzima periplásmica que catalisa a hidrólise do carbaril em 1-naftol, que é mais estável, mais hidrofóbico e mais tóxico. A CH está localizada no periplasma e possui baixa afinidade pelo carbaril, controlando assim a formação de 1-naftol, prevenindo seu acúmulo nas células e reduzindo sua toxicidade (Kamini et al., 2018). O 1-naftol resultante é transportado para o citoplasma através da membrana interna por partição e/ou difusão, e então é hidroxilado a 1,2-diidroxinaftaleno pela enzima de alta afinidade 1NH para posterior metabolismo na via central do carbono.
Embora os microrganismos possuam as capacidades genéticas e metabólicas para degradar fontes de carbono xenobióticas, a estrutura hierárquica de sua utilização (ou seja, o uso preferencial de fontes de carbono simples em detrimento das complexas) representa um grande obstáculo à biodegradação. A presença e a utilização de fontes de carbono simples regulam negativamente os genes que codificam enzimas responsáveis ​​pela degradação de fontes de carbono complexas/não preferenciais, como os PAHs. Um exemplo bem documentado é o da glicose, que é utilizada de forma mais eficiente do que a lactose quando glicose e lactose são fornecidas em conjunto à Escherichia coli (Jacob e Monod, 1965). Há relatos de que a Pseudomonas degrada uma variedade de PAHs e compostos xenobióticos como fontes de carbono. A hierarquia de utilização de fontes de carbono na Pseudomonas é: ácidos orgânicos > glicose > compostos aromáticos (Hylemon e Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). No entanto, existe uma exceção. Curiosamente, a Pseudomonas sp. A CSV86 exibe uma estrutura hierárquica única que utiliza preferencialmente hidrocarbonetos aromáticos (ácido benzoico, naftaleno, etc.) em vez de glicose e co-metaboliza hidrocarbonetos aromáticos com ácidos orgânicos (Basu et al., 2006). Nessa bactéria, os genes para degradação e transporte de hidrocarbonetos aromáticos não são regulados negativamente mesmo na presença de uma segunda fonte de carbono, como glicose ou ácidos orgânicos. Quando cultivada em meio contendo glicose e hidrocarbonetos aromáticos, observou-se que os genes para transporte e metabolismo da glicose foram regulados negativamente, os hidrocarbonetos aromáticos foram utilizados na primeira fase logarítmica e a glicose foi utilizada na segunda fase logarítmica (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Por outro lado, a presença de ácidos orgânicos não afetou a expressão do metabolismo de hidrocarbonetos aromáticos, portanto, espera-se que essa bactéria seja uma cepa candidata para estudos de biodegradação (Phale et al., 2020).
É bem conhecido que a biotransformação de hidrocarbonetos pode causar estresse oxidativo e aumento da expressão de enzimas antioxidantes em microrganismos. A biodegradação ineficiente do naftaleno, tanto em células na fase estacionária quanto na presença de compostos tóxicos, leva à formação de espécies reativas de oxigênio (ROS) (Kang et al. 2006). Como as enzimas degradadoras de naftaleno contêm clusters ferro-enxofre, sob estresse oxidativo, o ferro no heme e nas proteínas ferro-enxofre será oxidado, levando à inativação proteica. A ferredoxina-NADP+ redutase (Fpr), juntamente com a superóxido dismutase (SOD), medeia a reação redox reversível entre NADP+/NADPH e duas moléculas de ferredoxina ou flavodoxina, eliminando assim as ROS e restaurando o centro ferro-enxofre sob estresse oxidativo (Li et al. 2006). Foi relatado que tanto Fpr quanto SodA (SOD) em Pseudomonas podem ser induzidos por estresse oxidativo, e o aumento das atividades de SOD e catalase foi observado em quatro cepas de Pseudomonas (O1, W1, As1 e G1) durante o crescimento em condições com adição de naftaleno (Kang et al., 2006). Estudos mostraram que a adição de antioxidantes, como ácido ascórbico ou ferro ferroso (Fe2+), pode aumentar a taxa de crescimento em naftaleno. Quando Rhodococcus erythropolis cresceu em meio com naftaleno, houve aumento na transcrição de genes do citocromo P450 relacionados ao estresse oxidativo, incluindo sodA (superóxido dismutase Fe/Mn), sodC (superóxido dismutase Cu/Zn) e recA (Sazykin et al., 2019). A análise proteômica quantitativa comparativa de células de Pseudomonas cultivadas em naftaleno mostrou que a regulação positiva de várias proteínas associadas à resposta ao estresse oxidativo é uma estratégia de enfrentamento do estresse (Herbst et al., 2013).
Foi relatado que microrganismos produzem biossurfactantes sob a ação de fontes de carbono hidrofóbicas. Esses surfactantes são compostos tensoativos anfipáticos que podem formar agregados em interfaces óleo-água ou ar-água. Isso promove a pseudossolubilização e facilita a adsorção de hidrocarbonetos aromáticos, resultando em biodegradação eficiente (Rahman et al., 2002). Devido a essas propriedades, os biossurfactantes são amplamente utilizados em diversas indústrias. A adição de surfactantes químicos ou biossurfactantes a culturas bacterianas pode aumentar a eficiência e a taxa de degradação de hidrocarbonetos. Dentre os biossurfactantes, os ramnolipídios produzidos por Pseudomonas aeruginosa têm sido extensivamente estudados e caracterizados (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Adicionalmente, outros tipos de biossurfactantes incluem lipopeptídeos (mucinas de Pseudomonas fluorescens), emulsificante 378 (de Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg e Ron, 1999), lipídios dissacarídeos de trealose de Rhodococcus (Ramdahl, 1985), liquenina de Bacillus (Saraswathy e Hallberg, 2002) e surfactante de Bacillus subtilis (Siegmund e Wagner, 1991) e Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Esses surfactantes potentes demonstraram reduzir a tensão superficial de 72 dinas/cm para menos de 30 dinas/cm, permitindo uma melhor absorção de hidrocarbonetos. Foi relatado que Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia e outras espécies bacterianas podem produzir vários biossurfactantes à base de ramnolipídeos e glicolipídeos quando cultivadas em meios de naftaleno e metilnaftaleno (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89 pode produzir o biossurfactante extracelular Biosur-Pm quando cultivada em compostos aromáticos como o ácido naftoico (Phale et al., 1995). A cinética da formação de Biosur-Pm mostrou que sua síntese é um processo dependente do crescimento e do pH. Verificou-se que a quantidade de Biosur-Pm produzida por células em pH neutro foi maior do que em pH 8,5. As células cultivadas em pH 8,5 eram mais hidrofóbicas e apresentavam maior afinidade por compostos aromáticos e alifáticos do que as células cultivadas em pH 7,0. Em Rhodococcus spp. N6, alta relação carbono/nitrogênio (C:N) e limitação de ferro são condições ótimas para a produção de biossurfactantes extracelulares (Mutalik et al., 2008). Tentativas têm sido feitas para melhorar a biossíntese de biossurfactantes (surfactinas) por meio da otimização de cepas e fermentação. No entanto, o título de surfactante no meio de cultura é baixo (1,0 g/L), o que representa um desafio para a produção em larga escala (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Portanto, métodos de engenharia genética têm sido utilizados para melhorar sua biossíntese. Contudo, sua modificação por engenharia é difícil devido ao grande tamanho do operon (∼25 kb) e à complexa regulação biossintética do sistema de quorum sensing (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Diversas modificações de engenharia genética foram realizadas em bactérias do gênero Bacillus, principalmente com o objetivo de aumentar a produção de surfactina por meio da substituição do promotor (operon srfA), superexpressão da proteína de exportação de surfactina YerP e dos fatores regulatórios ComX e PhrC (Jiao et al., 2017). No entanto, esses métodos de engenharia genética alcançaram apenas uma ou algumas modificações genéticas e ainda não foram utilizados em produção comercial. Portanto, são necessários estudos adicionais sobre métodos de otimização baseados em conhecimento.
Os estudos de biodegradação de PAHs são conduzidos principalmente em condições laboratoriais padrão. No entanto, em locais ou ambientes contaminados, muitos fatores abióticos e bióticos (temperatura, pH, oxigênio, disponibilidade de nutrientes, biodisponibilidade do substrato, outros xenobióticos, inibição por produtos finais, etc.) demonstraram alterar e influenciar a capacidade degradativa dos microrganismos.
A temperatura tem um efeito significativo na biodegradação de PAHs. Com o aumento da temperatura, a concentração de oxigênio dissolvido diminui, o que afeta o metabolismo de microrganismos aeróbicos, uma vez que estes necessitam de oxigênio molecular como um dos substratos para as oxigenases que realizam reações de hidroxilação ou quebra do anel. É frequentemente observado que a temperatura elevada converte os PAHs originais em compostos mais tóxicos, inibindo assim a biodegradação (Muller et al., 1998).
Observou-se que muitos locais contaminados por HAPs apresentam valores de pH extremos, como locais contaminados por drenagem ácida de minas (pH 1–4) e locais de gaseificação de gás natural/carvão contaminados com lixiviado alcalino (pH 8–12). Essas condições podem afetar seriamente o processo de biodegradação. Portanto, antes de utilizar microrganismos para biorremediação, recomenda-se ajustar o pH adicionando produtos químicos adequados (com potencial de oxidação-redução moderado a muito baixo), como sulfato de amônio ou nitrato de amônio para solos alcalinos, ou calagem com carbonato de cálcio ou carbonato de magnésio para locais ácidos (Bowlen et al. 1995; Gupta e Sar 2020).
O fornecimento de oxigênio à área afetada é o fator limitante da taxa de biodegradação de PAHs. Devido às condições redox do ambiente, os processos de biorremediação in situ geralmente requerem a introdução de oxigênio a partir de fontes externas (aração, borbulhamento de ar e adição de produtos químicos) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) demonstraram que a adição de peróxido de magnésio (um composto liberador de oxigênio) a um aquífero contaminado poderia biorremediar eficazmente compostos BTEX. Outro estudo investigou a degradação in situ de fenol e BTEX em um aquífero contaminado por meio da injeção de nitrato de sódio e da construção de poços de extração para alcançar uma biorremediação eficaz (Bewley e Webb, 2001).