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O complexo de coleta de luz do centro de reação 1 (RC-LH1) é o componente fotossintético central das bactérias fototróficas púrpuras. Apresentamos duas estruturas do complexo RC-LH1 de Rhodopseudomonas palustris obtidas por microscopia crioeletrônica. A estrutura do complexo RC-LH114-W, com resolução de 2,65 Å, consiste em 14 alças da subunidade LH1 circundando o RC, interrompidas pela proteína W. Já o complexo sem a proteína W apresenta a composição completa do RC circundada por 16 alças da subunidade LH1 fechadas. A comparação dessas estruturas fornece informações sobre a dinâmica da quinona no complexo RC-LH1, incluindo mudanças conformacionais previamente desconhecidas durante a ligação da quinona ao sítio QB do RC, bem como a localização de sítios auxiliares de ligação da quinona, que auxiliam na sua transferência para o RC. A estrutura singular da proteína W impede o fechamento da alça LH1, criando assim um canal que acelera a troca quinona/quinolona.
A energia fornecida pela fotossíntese pode sustentar quase toda a vida na Terra e tem grande potencial para a biotecnologia solar. Ao mesmo tempo que promovem a fotossíntese global, as bactérias fototróficas púrpuras também exibem diversos modos de energia e capacidades metabólicas. Elas podem evitar a fotossíntese e crescer como bactérias heterotróficas no escuro, podem fixar nitrogênio e dióxido de carbono, produzir hidrogênio e degradar compostos aromáticos (1-3). Para fornecer energia para esses processos, a luz deve ser convertida em energia química de forma rápida e eficiente. Esse processo começa quando o complexo antena de captação de luz absorve a luz e transfere a energia captada para o centro de reação (CR), iniciando assim a separação de cargas (4-7). A unidade básica da fotossíntese em bactérias fototróficas púrpuras é composta por um CR do tipo 2, circundado pelo complexo de captação de luz 1 (LH1), formando o complexo central CR-LH1. O LH1 é formado por uma matriz de heterodímeros αβ curvos, cada um dos quais liga duas moléculas de clorofila bacteriana (BChl) a e um ou dois carotenoides (8-12). A antena LH1 mais simples consiste em 16 ou 17 heterodímeros αβ que circundam o RC (9-13) em um laço fechado, mas em outros complexos centrais, peptídeos transmembranares interrompem a continuidade do LH1 circundante, promovendo assim a difusão de quinol/quinona entre o RC e o complexo citocromo bc1 (11, 13-15). A planta fototrófica púrpura Rhodopseudomonas (Rps.) é um organismo modelo que permite compreender a transferência de energia e elétrons que sustenta a fotossíntese. A primeira estrutura cristalina de Rps. palustris. O modelo do complexo RC-LH1 é o RC, circundado por 15 laços heterodiméricos LH1, que são interrompidos por uma proteína desconhecida chamada “Proteína W” (14). A Proteína W foi posteriormente identificada como RPA4402, uma proteína não caracterizada de 10,5 kDa com três hélices transmembranares (TMH) previstas (16). Propomos renomear o gene rpa4402, que codifica a proteína W, para pufW, a fim de sermos consistentes com a nomenclatura usada para os genes que codificam as subunidades RC-L, M (pufL, pufM) e LH1α, β (pufA, pufB). Curiosamente, a proteína W está presente em apenas cerca de 10% dos complexos RC-LH1, revelando que Rps. palustris produz dois complexos RC-LH1 diferentes. Neste trabalho, relatamos as estruturas de alta resolução obtidas por criomicroscopia eletrônica (criomicroscopia eletrônica) de dois complexos centrais: um com a proteína W e 14 heterodímeros αβ, e o outro sem a proteína W e com um laço LH1 fechado contendo 16 heterodímeros. Nossa estrutura representa um avanço significativo na compreensão do complexo RC-LH1 de Rps. palustris, pois analisamos a população homogênea de cada variante e obtivemos resolução suficiente para identificar claramente cada peptídeo, pigmentos ligados, lipídios e quinonas relacionados. A comparação dessas estruturas mostra que as três proteínas TMH-W, que não foram encontradas em nenhum outro complexo RC-LH1 até o momento, geram um canal de quinona para acelerar a troca quinona/quinolona. Vários sítios de ligação de lipídios e quinonas conservados foram identificados, e revelamos uma nova mudança conformacional após a combinação de quinona e RC, que pode ser adequada para o centro de reação (CR) do fotossistema II (PSII) de organismos fototróficos oxigenados. Nossas descobertas fornecem novos insights sobre a cinética de ligação e troca de quinona/quinolona no complexo central RC-LH1 de bactérias fototróficas púrpuras.
Para facilitar um estudo detalhado dos dois complexos encontrados em Rps. palustris, isolamos cada RC-LH1 por métodos bioquímicos. O complexo deficiente em proteína W (doravante denominado ΔpufW) foi purificado da cepa sem o gene pufW (16), e apenas um complexo RC-LH1 pode ser produzido. O complexo contendo a proteína W é produzido por uma cepa. A proteína W dessa cepa é modificada com uma etiqueta His 10x em sua extremidade C-terminal, de modo que o complexo contendo a proteína W possa ser efetivamente combinado com a maioria das cepas sem a proteína W por imobilização de metal. O complexo é efetivamente separado (16) por Cromatografia de Afinidade IMAC (IMAC).
Como mostrado na Figura 1, ambos os complexos contêm um centro de reação (CR) de três subunidades (RC-L, RC-M e RC-H) circundado por uma antena LH1. A estrutura de 2,80 Å do complexo sem a proteína W mostra 16 heterodímeros αβ, formando um laço LH1 fechado que circunda completamente o CR, doravante denominado complexo RC-LH116. A estrutura de 2,65 Å do complexo contendo a proteína W apresenta um LH1 de 14 heterodímeros interrompido pela proteína W, doravante denominado RC-LH114-W.
(A e B) Representação da superfície do composto. (C e D) Pigmentos ligados expressos em bastonetes. (E e F) Os complexos observados na superfície citoplasmática têm os peptídeos e as subunidades LH1 representados em esquemas e são numerados no sentido horário a partir do espaço proteína-W [consistente com a numeração do complexo Rba sphaeroides (13)]. Para LH1-α, a cor da subunidade proteica é amarela; para LH1-β, a cor da subunidade proteica é azul; para proteína-W, a proteína é vermelha; para RC-H, é ciano; para RC-L, é laranja; para RC-M, magenta. Os cofatores são representados por bastonetes: verde representa as moléculas de BChl e BPh a, roxo representa os carotenoides e amarelo representa as moléculas de UQ10. (G e H) Vista ampliada do espaço proteína-W na região equivalente do complexo RC-LH114-W (G) e do complexo RC-LH116 (H). Os cofatores são exibidos na forma de preenchimento de espaço, a quinona quelada é exibida em azul. A lacuna proteína-W é destacada por uma linha tracejada azul em (G), e os pequenos orifícios onde a quinona/quinolol difunde no anel LH116 são destacados por uma linha tracejada preta em (H).
A Figura 1 (A e B) mostra o RC circundado por arranjos abertos ou fechados de heterodímeros LH1αβ, cada um dos quais liga duas BChl e um carotenóide (Figura 1, C e D). Estudos anteriores mostraram que Rps é o complexo LH1. Na via biossintética da xantina da espirulina, essas espécies contêm populações mistas de carotenóides (17). No entanto, a espiropirroxantina é o carotenóide dominante e sua densidade é satisfatória. Portanto, optamos por modelar a espiroxantina em todos os sítios de ligação do LH1. Os polipeptídeos alfa e beta são TMHs únicos com regiões externas de membrana curtas (Figura 1, A, B, E e F). Embora a densidade de 17 resíduos no C-terminal não tenha sido observada, o polipeptídeo alfa foi clivado de Met1 a Ala46 em ambos os complexos. O polipeptídeo β foi reduzido de Gly4 para Tyr52 em RC-LH116 e de Ser5 para Tyr52 em RC-LH114-W. Não foi observada densidade de 3 ou 4 resíduos N-terminais ou 13 resíduos C-terminais (Figura S1). A análise por espectrometria de massa do complexo RC-LH1 misto, preparado a partir da cepa selvagem, mostrou que a região ausente resultou da clivagem heteróloga desses peptídeos (Figuras S1 e S2). A formilação N-terminal de α-Met1 também foi observada (f). A análise mostrou que o peptídeo α consiste nos resíduos fMet1 a Asp42/Ala46/Ala47/Ala50 e o peptídeo β consiste nos resíduos Ser2 a Ala53, o que está em boa concordância com o mapa de densidade obtido por microscopia eletrônica em baixa temperatura.
A coordenação de α-His29 e β-His36 faz com que as BChls fiquem face a face; cada heterodímero αβ se associa aos seus vizinhos para formar um laço aberto (RC-LH114-W) ou um laço fechado (RC-LH116) ao redor do RC. O arranjo de pigmentos acoplados por excítons (Figura 1, C e D). Comparado com a banda de 877 nm de RC-LH114-W, o deslocamento para o vermelho da absorção em 880 nm de RC-LH116 é de 3 nm (Figura 2A). No entanto, o espectro de dicroísmo circular é quase o mesmo (Figura 2B), indicando que, embora haja uma clara diferença entre os laços abertos e fechados, o ambiente local das BChls é muito semelhante. O deslocamento para o vermelho da absorção pode ser resultado da redução da movimentação térmica e do aumento da estabilidade no laço fechado (18, 19), da mudança no acoplamento de pigmentos causada pelo laço fechado (20, 21) ou de uma combinação desses dois efeitos (11).
(A) Espectro de absorção ultravioleta/visível/infravermelho próximo, cujos picos estão marcados com seus respectivos pigmentos e normalizados ao pico de BPh em 775 nm. (B) Espectro de dicroísmo circular normalizado à absorbância de BChl em 805 nm. (C e D) Espectros ΔA selecionados dos espectros de absorção com resolução temporal do complexo RC-LH114-W (C) e do complexo RC-LH116 (D). Para melhor comparabilidade, todos os espectros foram normalizados para ΔA de −A em 0,2 ps. (E) Taxa de oxidação do citocromo c2 após irradiação na presença de várias concentrações de UQ2 (ver Figura S8 para dados brutos). (F) Em células cultivadas sob luz de baixa, média ou alta intensidade (10, 30 ou 300 μM m⁻² s⁻¹, respectivamente), a proteína W e as subunidades RC-L no complexo purificado e a razão entre as membranas separadas. Determine o nível de proteína por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e imunoensaio (consulte a Figura S9 para os dados brutos). Determine a proporção em relação ao complexo RC-LH114-W purificado. A proporção estequiométrica de RC-L para proteína-W do complexo é de 1:1.
As BChls na posição 1 do laço αβ14 deformado do RC-LH114-W (Figura 1, A, C e E) estão 6,8 Å mais próximas do doador primário (P) do RC do que as BChls equivalentes no RC-LH116 (Figura 1, B, D e F, e Figura S3); entretanto, a cinética de absorção transiente dos dois complexos mostra que, para RC-LH114-W e RC-LH116, as constantes de tempo de transferência de energia de excitação de LH1 para RC são de 40 ± 4 e 44 ± 3 ps (Figura 2, C e D, Figura S4 e Tabela S2). Também não há diferença significativa na transferência eletrônica dentro do RC (Figura S5 e texto suplementar relacionado). Suspeitamos que a estreita correspondência do tempo de transferência de energia entre LH1 e RC-P se deva à distância, ângulo e energia potencial semelhantes da maioria das BChls nos dois laços de LH1. Parece que explorar o padrão de energia LH1 para atingir a distância mínima não é mais rápido do que a transferência direta de energia de sítios subótimos para o RC. O laço LH1 de circuito aberto em RC-LH114-W também pode sofrer movimento térmico insignificante em condições de baixa temperatura para análise estrutural, e há uma conformação de anel αβ14 mais longa à temperatura ambiente a partir da distância de pigmentação das βBChls na posição RC 1.
O complexo RC-LH116 contém 32 BChls e 16 carotenoides, e seu arranjo geral é o mesmo obtido de Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) cepa 970 (PDB ID 7C9R) (12) e algas verdes (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Após o alinhamento, foram observadas apenas pequenas variações nas posições dos heterodímeros αβ, especialmente 1-5, 15 e 16 (Figura S6). A presença da proteína-W tem um impacto significativo na estrutura de LH1. Seus três TMHs são conectados por alças curtas, com o N-terminal no lado luminal do complexo e o C-terminal no lado citoplasmático (Figuras 1A e 3, A a D). A proteína W é predominantemente hidrofóbica (Figura 3B), e os domínios transmembranares 2 e 3 interagem com LH1αβ-14 para formar uma superfície transmembranar (Figura 3, B e E a G). A interface é composta principalmente por resíduos de Phe, Leu e Val na região transmembranar. Esses resíduos interagem com aminoácidos hidrofóbicos e pigmentos αβ-14. Alguns resíduos polares também contribuem para a interação, incluindo a ligação de hidrogênio entre W-Thr68 e β-Trp42 na superfície da cavidade do complexo (Figura 3, F e G). Na superfície do citoplasma, Gln34 está adjacente ao grupo cetona dos carotenoides αβ-14. Além disso, a molécula de n-dodecil β-d-maltosídeo (β-DDM) foi resolvida, e sua cauda hidrofóbica se estendeu até a interface entre a proteína W e αβ-14, podendo a cauda lipídica estar localizada no corpo da molécula. Também observamos que as regiões de resolução C-terminal da proteína W e da RCH são muito próximas, mas não dentro do escopo de formação de interações específicas (Figura 1, A e E). No entanto, podem existir interações nos aminoácidos C-terminais não resolvidos dessas duas proteínas, o que pode fornecer um mecanismo para o recrutamento da proteína W durante a montagem do complexo RC-LH114-W.
(A) A proteína W, que está voltada para a interface com LH1αβ14 em forma de desenho animado, possui uma cadeia lateral em forma de bastão (vermelha), exibida em uma parte do diagrama de potencial eletrostático (superfície cinza transparente com nível de contorno de 0,13). (B) A proteína W é representada por uma superfície colorida hidrofóbica. Áreas polares e carregadas são exibidas em ciano, áreas hidrofóbicas em branco e áreas fortemente hidrofóbicas em laranja. (C e D) A proteína W é representada em desenho animado, sua orientação é a mesma que em (A) (C) e rotacionada em 180° (D). De acordo com a posição na sequência, os resíduos distinguíveis adotam um esquema de cores do arco-íris, onde o N-terminal é azul e o C-terminal é vermelho. (E) A proteína W na mesma vista que em (A), e os resíduos na interface proteína W:LH1 são representados por bastões com marcas anexadas. (F) A proteína W está rotacionada 90° em relação a (E) e LH1αβ14 na representação em desenho animado, e em relação aos resíduos da interface na representação em barra. Os resíduos salientes do polipeptídeo beta estão identificados. O cofator é mostrado como uma barra com a mesma cor da Figura 1, o β-DDM decomposto é mostrado em cinza e o oxigênio em vermelho. (G) A vista em (F) está rotacionada 180°, com os resíduos proeminentes do polipeptídeo alfa identificados.
A proteína W substitui um heterodímero αβ (o 15º na Figura 1F), impedindo assim o fechamento do laço e inclinando os três primeiros heterodímeros αβ. Observou-se que o ângulo de inclinação máximo do primeiro heterodímero αβ-1 em relação à normal do filme era de 25° a 29° (Figura 1, A e E), formado pela inclinação de 2° a 8° de αβ-1 no RC A de alto contraste-LH116 (Figura 1, B e F). O segundo e o terceiro heterodímeros estão inclinados a 12° a 22° e 5° a 10°, respectivamente. Devido ao impedimento estérico do RC, a inclinação de αβ-1 não inclui o segundo par de αβ (que corresponde ao 16º αβ na Figura 1F), formando assim uma lacuna nítida no anel LH1 (Figura 1, A e E). Devido à ausência de dois heterodímeros αβ, acompanhada pela perda de quatro BChl e dois carotenoides, nenhum dos carotenoides se liga à subunidade αβ-1 torcida, resultando em um anel LH114-W contendo 13 carotenoides vegetarianos e 28 BChls. As estimativas de resolução local dos dois complexos nas regiões αβ1 a 7 são menores do que as do restante do laço LH1, o que pode refletir a plasticidade inerente da subunidade LH1 adjacente ao sítio RC QB (Figura 4).
As imagens de RC-LH114-W (A e B) e RC-LH116 (C e D) são mostradas a partir da mesma vista superior/vista lateral (A e B) (A e C) e superfície da cavidade da Fig. 1 (B e D). As legendas coloridas são mostradas à direita.
O único outro complexo central característico com uma proporção estequiométrica de 1:14 é o dímero RC-LH1-PufX de Rhodococcus sphaeroides (Rba.) (13). No entanto, a proteína W e PufX não apresentam homologia óbvia e têm um impacto significativo em suas respectivas estruturas LH1. PufX é um único TMH com um domínio citoplasmático N-terminal que interage com o lado citoplasmático da subunidade RC-H (13) em uma posição correspondente a Rps. palustris LH116αβ-16. PufX cria um canal para a troca quinona/quinolona entre RC-LH1 e o complexo citocromo bcl e está presente em todos os complexos centrais de Rba. sphaeroides (13). Embora a interface monômero-monômero esteja em Rba. O dímero RC-LH1-PufX de *S. sphaeroides* está localizado na posição de ligação da proteína W em RC-LH114-W, e a lacuna induzida por PufX e proteína W está em uma posição equivalente (Figura S7A). A lacuna em RC-LH114-W também está alinhada com o hipotético canal de quinona (8) de LH1 de *Pseudomonas rosea*, que é formado por peptídeos não relacionados à proteína W ou PufX (Figura S7B). Além disso, o canal de quinona em LH1 de *Blc. emerald green*, formado pela exclusão de uma subunidade γ (7), está localizado em uma posição semelhante (Figura S7C). Embora mediados por proteínas diferentes, o aparecimento desses canais de quinona/quinolol em uma posição comum no complexo RC-LH1 parece ser um exemplo de evolução convergente, indicando que a lacuna criada pela proteína W pode atuar como um canal de quinona.
A lacuna na alça LH114-W permite a formação de uma região de membrana contínua entre o espaço interno do complexo RC-LH114-W e a membrana em geral (Figura 1G), em vez de conectar os dois domínios por meio de um poro proteico, como ocorre em proteínas. O complexo RC-LH116 é semelhante a um complexo Tch fechado em forma de agulha (22) (Figura 1H). Como a difusão da quinona através da membrana é mais rápida do que a difusão através do estreito canal proteico, a alça LH114-W aberta pode permitir uma renovação do RC mais rápida do que a alça LH116 fechada, e a difusão da quinona para o RC pode ser mais restrita. Para testar se a proteína W afeta a conversão de quinonas através do RC, realizamos um ensaio de oxidação do citocromo em uma determinada concentração de ubiquinona 2 (UQ2) (um análogo da UQ10 natural com uma cauda de isopreno mais curta) (Figura 2E). Embora a presença de quinona quelada dificulte a determinação precisa da constante de Michaelis aparente (RC-LH114-W e RC-LH116 são adequados para 0,2±0,1μM e 0,5±0,2μM, respectivamente), a taxa máxima de RC-LH114-W (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) é 28±5% maior que a de RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Inicialmente, estimamos que a proteína W esteja presente em cerca de 10% do complexo central (16); aqui, as taxas de ocupação das células em crescimento com baixa, média e alta luminosidade são de 15±0,6%, 11±1% e 0,9±0,5%, respectivamente (Figura 2F). A comparação quantitativa por espectrometria de massa mostrou que a adição da etiqueta de histidina não reduziu a abundância relativa da proteína W em comparação com as cepas selvagens (P = 0,59), portanto, esses níveis não são um artefato da proteína W modificada (Figura S10). No entanto, essa baixa ocupação da proteína W no complexo RC-LH1 pode permitir que alguns RCs se alternem a uma taxa acelerada, mitigando assim a troca mais lenta de quinona/quinolona no complexo RC-LH116. Observamos que a alta taxa de ocupação em alta luminosidade é inconsistente com os dados recentes de transcriptômica, que indicam que a expressão do gene pufW aumenta sob forte luminosidade (Figura S11) (23). A diferença entre a transcrição de pufW e a incorporação da proteína W no complexo RC-LH1 é confusa e pode refletir a regulação complexa da proteína.
Em RC-LH114-W, 6 moléculas de cardiolipina (CDL), 7 de fosfatidilcolina (POPC), 1 de fosfatidilglicerol (POPG) e 29 de β-DDM são alocadas e modeladas, sendo 6 de CDL, 24 de POPC, 2 de POPG e 12 de β-DDM em RC-LH116 (Figura 5, A e B). Nessas duas estruturas, a CDL está localizada quase que exclusivamente no lado citoplasmático do complexo, enquanto POPC, POPG e β-DDM estão predominantemente localizados no lado luminal. Duas moléculas de lipídio e detergente foram isoladas na região αβ-1 a αβ-6 do complexo RC-LH114-W (Figura 5A), e cinco foram isoladas na região equivalente de RC-LH116 (Figura 5B). Mais lipídios foram encontrados no outro lado do complexo, principalmente CDL, acumulados entre RC e αβ-7 a αβ-13 (Figura 5, A e B). Outros lipídios e detergentes com estrutura resolvida estão localizados fora do anel LH1, e cadeias acil bem resolvidas se estendem entre as subunidades LH1, designadas provisoriamente como β-DDM em RC-LH114-W e definidas como β-DDM em RC A, uma mistura de β-DDM e POPC-LH116. As posições semelhantes dos lipídios quelantes e detergentes em nossa estrutura indicam que eles são sítios de ligação fisiologicamente relevantes (Figura S12A). As posições de moléculas equivalentes em Tch também apresentam boa consistência. Gentle e Trv. A cepa 970 RC-LH1s (Figura S12, B a E) (9, 12) e os resíduos de ligação de hidrogênio do grupo de cabeça lipídica mostraram conservação bastante boa no alinhamento de sequência (Figura S13), indicando que o CDL conservado que se liga ao RC (24), esses sítios podem ser conservados no complexo RC-LH1.
(A e B) Os peptídeos RC-LH114-W (A) e RC-LH116 (B) são representados por desenhos esquemáticos, e os pigmentos são representados por bastões, utilizando o esquema de cores da Figura 1. Os lipídios são mostrados em vermelho e os detergentes em cinza. A UQ ligada aos sítios RC QA e QB é amarela, enquanto a UQ isolada é azul. (C e D) As mesmas vistas de (A) e (B), com os lipídios omitidos. (E a ​​G) Vista ampliada de Q1(E), Q2(F) e Q3(G) do RC-LH116, com as cadeias laterais que se influenciam mutuamente. As ligações de hidrogênio são mostradas como linhas tracejadas pretas.
Em RC-LH116, tanto RC QA quanto QB UQ, que participam da transferência de elétrons no processo de separação de cargas, estão decompostos em seus sítios de ligação. Entretanto, em RC-LH114-W, a quinona QB não foi resolvida e será discutida em detalhes adiante. Além das quinonas QA e QB, duas moléculas de UQ queladas (localizadas entre os anéis RC e LH1) são alocadas na estrutura de RC-LH114-W de acordo com seus grupos de cabeça bem resolvidos (localizados em Q1 e Q2, respectivamente). (Figura 5C). Duas unidades de isopreno são atribuídas a Q1, e o mapa de densidade resolve as 10 caudas de isopreno completas de Q2. Na estrutura de RC-LH116, três moléculas de UQ10 queladas (Q1 a Q3, Figura 5D) foram resolvidas, e todas as moléculas apresentam densidade clara ao longo da cauda (Figura 5, D a G). Nas duas estruturas, as posições dos grupos de cabeça quinona de Q1 e Q2 apresentam excelente consistência (Figura S12F) e interagem apenas com o RC. Q1 está localizado na entrada da lacuna W do RC-LH114-W (Figura 1G e 5, C, D e E), e Q2 está localizado próximo ao sítio de ligação de QB (Figura 5, C, D e F). Os resíduos conservados L-Trp143 e L-Trp269 estão muito próximos de Q1 e Q2 e proporcionam potenciais interações de empilhamento π (Figura 5, E e F, e Figura S12). L-Gln88, a 3,0 Å do oxigênio distal de Q1, forma uma forte ligação de hidrogênio (Figura 5E); esse resíduo é conservado em todos os RCs, exceto no mais distante (Figura S13). A L-Ser91 é substituída conservativamente por Thr na maioria dos outros RCs (Figura S13), está a 3,8 Angstroms do oxigênio metil de Q1 e pode fornecer ligações de hidrogênio fracas (Figura 5E). Q3 não parece ter uma interação específica, mas está localizado na região hidrofóbica entre a subunidade RC-M e a subunidade LH1-α 5 a 6 (Figura 5, D e G). Q1, Q2 e Q3 ou quinonas queladas próximas também foram resolvidas em Tch. Gentle, Trv. Strain 970 e Blc. A estrutura da íris (9, 10, 12) aponta para um sítio de ligação de quinona auxiliar conservado no complexo RC-LH1 (Figura S12G). Os cinco UQs decompostos em RC-LH116 estão em boa concordância com o valor de 5,8±0,7 de cada complexo determinado por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), enquanto os três UQs decompostos em RC-LH114-W são inferiores ao valor medido de 6,2±0,3 (Fig. S14), o que indica a presença de moléculas de UQ não resolvidas na estrutura.
Os polipeptídeos L ​​e M pseudo-simétricos contêm cinco TMHs cada e formam um heterodímero que combina um dímero de BChl, dois monômeros de BChl, dois monômeros de bacteriófago (BPh), um ferro não-heme e uma ou duas moléculas de UQ10. Através da presença de ligações de hidrogênio no grupo cetona terminal e seu acúmulo conhecido em Rps, os carotenoides são incorporados na subunidade M, que é denominada cis-3,4-desidroorrodopina. Espécie (25). O domínio da membrana externa do RC-H é ancorado à membrana por um único TMH. A estrutura geral do RC é semelhante à do RC de três subunidades de espécies relacionadas (como Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Os macrociclos de BChl e BPh, a estrutura principal carotenóide e o ferro não-heme se sobrepõem dentro da faixa de resolução dessas estruturas, assim como o grupo de cabeça UQ10 no sítio QA e a quinona QB em RC-LH116 (Figura S15).
A disponibilidade de duas estruturas RC com diferentes taxas de ocupação do sítio QB oferece uma nova oportunidade para examinar as mudanças conformacionais consistentes que acompanham a ligação da quinona QB. No complexo RC-LH116, a quinona QB está localizada na posição “proximal” totalmente ligada (26), mas a separação do RC-LH114-W não possui quinona QB. Não há quinona QB no RC-LH114-W, o que é surpreendente, pois o complexo é ativo, mais do que o complexo RC-LH116 com quinona QB estruturalmente resolvida. Embora os dois anéis LH1 quelem cerca de seis quinonas, cinco são estruturalmente resolvidas no anel fechado RC-LH116, enquanto apenas três são estruturalmente resolvidas no anel aberto RC-LH114-W. Esse aumento na desordem estrutural pode refletir a substituição mais rápida dos sítios QB do RC-LH114-W, a cinética mais rápida da quinona no complexo e a maior probabilidade de atravessar a alça LH1. Sugerimos que a ausência de UQ no sítio QB do RC-LH114-W pode ser resultado de um complexo mais complexo e mais ativo, e que o sítio QB do RC-LH114-W foi imediatamente congelado na renovação da UQ. O estágio específico (o acesso ao sítio QB foi fechado) reflete a conformação dessa atividade.
Sem QB, a rotação concomitante de L-Phe217 para uma posição incompatível com a ligação de UQ10 causaria uma colisão espacial com a primeira unidade de isopreno da cauda (Figura 6A). Além disso, as principais mudanças conformacionais são evidentes, especialmente na hélice de (hélice curta na alça entre TMH D e E), onde L-Phe217 se desloca para o sítio de ligação de QB, e na rotação de L-Tyr223 (Figura 6A) para romper a ligação de hidrogênio com a estrutura de M-Asp45 e fechar a entrada do sítio de ligação de QB (Figura 6B). A hélice de gira em sua base, o Cα de L-Ser209 se desloca em 0,33 Å, enquanto o Cα de L-Val221 se desloca em 3,52 Å. Não há alterações observáveis ​​em TMH D e E, que são sobreponíveis em ambas as estruturas (Figura 6A). Até onde sabemos, esta é a primeira estrutura no RC natural que fecha o sítio QB. Uma comparação com a estrutura completa (ligada ao QB) mostra que, antes da quinona ser reduzida, é necessária uma mudança conformacional para que ela entre no sítio de ligação. O L-Phe217 gira para formar uma interação de empilhamento π com o grupo de cabeça da quinona, e a hélice se desloca para fora, permitindo que o esqueleto do L-Gly222 e a cadeia lateral do L-Tyr223 formem uma rede de ligações de hidrogênio com uma estrutura estável (Figura 6, A e C).
(A) Desenho esquemático sobreposto do holograma (cadeia L, laranja/cadeia M, magenta) e da estrutura apo (cinza), no qual os resíduos-chave são exibidos na forma de uma representação em bastão. UQ10 é representado por uma barra amarela. A linha pontilhada indica as ligações de hidrogênio formadas em toda a estrutura. (B e C) Representação da superfície da apolipoproteína e da estrutura completa do anel, destacando o oxigênio da cadeia lateral de L-Phe217 em azul e L-Tyr223 em vermelho, respectivamente. A subunidade L é laranja; as subunidades M e H não são coloridas. (D e E) Sítios RC QB da apolipoproteína (D) e de todo (E) [coloridos por (A), respectivamente] e PSII de Thermophilus thermophilus (verde, azul com quinona plástica; PDB ID: 3WU2) Align (58).
Inesperadamente, embora várias estruturas de RCs deficientes em QB sem LH1 estejam disponíveis, as alterações conformacionais observadas neste estudo não foram relatadas anteriormente. Estas incluem a estrutura de depleção de QB de Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) e Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), todas quase idênticas à sua estrutura geral de QB. Uma análise detalhada de 3PRC revelou que as moléculas do detergente LDAO (Lauril Dimetil Amina Óxido) se ligam à entrada da posição QB, o que pode impedir o rearranjo para uma conformação fechada. Embora o LDAO não se decomponha na mesma posição em 1EYS ou 1OGV, esses RCs são preparados usando o mesmo detergente e, portanto, podem produzir o mesmo efeito. A estrutura cristalina de Rba. O RC de Sphaeroides co-cristalizado com citocromo c2 (PDB ID: 1L9B) também parece ter um sítio QB fechado. No entanto, neste caso, a região N-terminal do polipeptídeo RC-M (que interage com o sítio de ligação QB através da ligação de hidrogênio do resíduo de Tyr na hélice Q) adota uma conformação não natural, e a mudança conformacional do QB não é explorada mais a fundo (30). O que é reconfortante é que não observamos esse tipo de deformação do polipeptídeo M na estrutura RC-LH114-W, que é quase idêntica à região N-terminal do RC-LH116. Deve-se notar também que, após a erradicação da antena LH1 baseada em detergente, os RCs de apolipoproteína no PDB foram resolvidos, o que eliminou os pools internos de quinona e lipídios no espaço entre o RC e a superfície interna do anel LH1 circundante (31, 32). O RC permanece funcional porque retém todos os cofatores, exceto a quinona QB decomponível, que é menos estável e frequentemente perdida durante o processo de preparação (33). Além disso, sabe-se que a remoção de LH1 e lipídios cíclicos naturais do RC pode ter um impacto nas funções, como a redução da vida útil do estado P+QB com separação de cargas (31, 34, 35). Portanto, especulamos que a existência do anel local de LH1 ao redor do RC pode manter o sítio QB “fechado”, preservando assim o ambiente local próximo ao QB.
Embora a apolipoproteína (sem a quinona QB) e a estrutura completa representem apenas dois instantâneos da dinâmica do sítio QB, em vez de uma série de eventos, há indícios de que a ligação pode ser controlada para impedir a religação pela hidroquinona, inibindo assim a inibição pelo substrato. A interação do quinolol e da quinona perto do sítio QB da apolipoproteína pode ser diferente, o que leva à sua rejeição pelo RC. Há muito se propõe que mudanças conformacionais desempenham um papel na ligação e redução das quinonas. A capacidade dos RCs congelados de reduzir quinonas após a adaptação ao escuro fica prejudicada (36); a cristalografia de raios X mostra que esse dano se deve ao fato de as quinonas QB ficarem presas em uma conformação “distal” a cerca de 4,5 Å da posição proximal ativa (26, 37). Sugerimos que essa conformação de ligação distal seja um instantâneo do estado intermediário entre a apolipoproteína e a estrutura completa do anel, que se segue à interação inicial com a quinona e à abertura do sítio QB.
O centro de reação (CR) do tipo II encontrado no complexo do fotossistema II (PSII) de certas bactérias fototróficas e cianobactérias, algas e plantas apresenta conservação estrutural e funcional (38). O alinhamento estrutural mostrado na Figura 6 (D e E) enfatiza a similaridade entre os CRs do PSII e o sítio QB do complexo CR bacteriano. Essa comparação tem sido um modelo para o estudo de sistemas intimamente relacionados de ligação e redução de quinonas. Publicações anteriores sugeriram que mudanças conformacionais acompanham a redução de quinonas pelo PSII (39, 40). Portanto, considerando a conservação evolutiva do CR, esse mecanismo de ligação, até então não observado, pode também ser aplicável ao sítio QB do CR do PSII em plantas fototróficas oxigenadas.
As cepas Rps ΔpufW (deleção pufW não marcada) e PufW-His (proteína-W com marcação 10x His na extremidade C-terminal, expressa a partir do lócus pufW natural) foram obtidas. palustris CGA009 foi descrita em nosso trabalho anterior (16). Essas cepas e a cepa parental selvagem isogênica foram recuperadas do congelador por estrias de um pequeno número de células em placas de ágar PYE (5 g litro⁻¹ cada) (armazenado em LB a -80 °C, contendo 50% (p/v) de glicerol) com proteína, extrato de levedura e succinato [1,5% (p/v)]. As placas foram incubadas durante a noite no escuro, à temperatura ambiente, em condições anaeróbicas, e então iluminadas com luz branca (~50 μmol m⁻² s⁻¹) fornecida por lâmpadas halógenas OSRAM de 116 W (RS Components, Reino Unido) por 3 a 5 dias, até o aparecimento de uma única colônia. Uma única colônia foi utilizada para inocular 10 ml de meio M22+ (41) suplementado com 0,1% (p/v) de aminoácidos de caseína (doravante denominado M22). A cultura foi cultivada em condições de baixo teor de oxigênio, no escuro, a 34 °C, com agitação a 180 rpm por 48 horas. Em seguida, 70 ml da cultura foram inoculados nas mesmas condições por 24 horas. Uma cultura semi-aeróbica com volume de 1 ml foi utilizada para inocular 30 ml de meio M22 em um frasco de vidro transparente de 30 ml com tampa de rosca e irradiada com agitação (~50 μmol m⁻² s⁻¹) por 48 horas utilizando uma haste de agitação magnética estéril. Posteriormente, 30 ml da cultura foram inoculados com cerca de 1 litro de cultura nas mesmas condições, que foi então utilizada para inocular cerca de 9 litros de cultura iluminada a ~200 μmol m⁻² s⁻¹ por 72 horas. As células foram coletadas por centrifugação a 7132 RCF durante 30 minutos, ressuspensas em aproximadamente 10 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e armazenadas a -20°C até serem necessárias.
Após o descongelamento, adicione alguns cristais de desoxirribonuclease I (Merck, Reino Unido), lisozima (Merck, Reino Unido) e dois comprimidos de inibidor de protease holoenzimático Roche (Merck, Reino Unido) às células ressuspensas. Em uma prensa francesa de 20.000 psi (Aminco, EUA), as células foram rompidas de 8 a 12 vezes. Após a remoção das células intactas e dos detritos insolúveis por centrifugação a 18.500 RCF por 15 minutos a 4 °C, a membrana foi precipitada do lisado pigmentado por centrifugação a 113.000 RCF por 2 horas a 43.000 °C. Descarte a fração solúvel e ressuspenda a membrana colorida em 100 a 200 ml de Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e homogeneize até que não haja agregados visíveis. A membrana em suspensão foi incubada em Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) (Anatrace, EUA) contendo 2% (p/v) de β-DDM por 1 hora no escuro a 4 °C com agitação suave. Em seguida, foi centrifugada a 70 °C para dissolver 150.000 RCF a 4 °C por 1 hora para remover os insolúveis residuais.
A membrana de solubilização da cepa ΔpufW foi aplicada a uma coluna de troca iônica DEAE Sepharose de 50 ml com três volumes de coluna (VC) de tampão de ligação [20 mM Tris-HCl (pH 8,0) contendo 0,03% (p/v) de β-DDM]. A coluna foi lavada com dois VC de tampão de ligação e, em seguida, com dois VC de tampão de ligação contendo 50 mM de NaCl. O complexo RC-LH116 foi eluído com um gradiente linear de 150 a 300 mM de NaCl (em tampão de ligação) em 1,75 VC, e o complexo de ligação restante foi eluído com um tampão de ligação contendo 300 mM de NaCl em 0,5 VC. Colete o espectro de absorção entre 250 e 1000 nm, mantenha a fração com razão de absorbância (A880/A280) maior que 1 entre 880 e 280 nm, dilua-a duas vezes em tampão de ligação e repita o procedimento na coluna DEAE para purificação. Dilua as frações com razões A880/A280 maiores que 1,7 e A880/A805 maiores que 3,0, realize a terceira rodada de troca iônica e retenha as frações com razões A880/A280 maiores que 2,2 e A880/A805 maiores que 5,0. O complexo parcialmente purificado foi concentrado para ~2 ml em um filtro centrífugo Amicon com corte de peso molecular (MWCO) de 100.000 (Merck, Reino Unido) e carregado em uma coluna de exclusão por tamanho Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, EUA) contendo tampão NaCl 200 mM, sendo então eluído no mesmo tampão a 1,5 CV. Os espectros de absorção da fração de exclusão por tamanho foram coletados e concentrados para valores de A880/A280 acima de 2,4 e A880/A805 acima de 5,8 a 100 A880, sendo imediatamente utilizados para a preparação de grades para criomicroscopia eletrônica de transmissão (criomicroscopia TEM) ou para armazenamento. As amostras foram mantidas a -80 °C até o uso.
A membrana solubilizante da cepa PufW-His foi aplicada a uma coluna de 20 ml de HisPrep FF Ni-NTA Sepharose (20 mM Tris-HCl (pH 8,0) contendo 200 mM NaCl e 0,03% (p/p)) em tampão IMAC (GE Healthcare). A coluna foi lavada com cinco volumes de coluna (VCs) de tampão IMAC e, em seguida, com cinco VCs de tampão IMAC contendo 10 mM de histidina. O complexo central foi eluído da coluna com cinco VCs de tampão IMAC contendo 100 mM de histidina. A fração contendo o complexo RC-LH114-W foi concentrada para ~10 ml em um tanque agitado equipado com um filtro Amicon de 100.000 MWCO (Merck, Reino Unido), diluída 20 vezes com tampão de ligação e, em seguida, adicionada a 25 ml de uma coluna de DEAE Sepharose. Quatro VCs ligados ao tampão foram utilizados previamente. Lave a coluna com quatro tampões de ligação CV, depois elua o complexo em oito CVs em um gradiente linear de 0 a 100 mM de NaCl (em tampão de ligação), e os quatro CVs restantes contendo 100 mM de tampão de ligação. Os complexos residuais eluídos no cloreto de sódio, combinados com a razão A880/A280 superior a 2,4 e a razão A880/A805 superior a 4,6, foram concentrados para ~2 ml em um filtro centrífugo Amicon 100.000 MWCO e preenchidos com 1,5 CV de IMAC previamente equilibrado com tampão em uma coluna de exclusão por tamanho Superdex 200 16/600, e então eluídos no mesmo tampão em 1,5 CV. Coletar os espectros de absorção das frações de exclusão por tamanho e concentrar os espectros de absorção com razões A880/A280 acima de 2,1 e razões A880/A805 acima de 4,6 para 100 A880, que são imediatamente usados ​​para a preparação de grades TEM congeladas ou armazenados a -80°C até o uso.
Um congelador de imersão Leica EM GP foi usado para preparar grades de TEM de baixa temperatura. O complexo foi diluído em tampão IMAC até uma absorbância (A880) de 50 e, em seguida, 5 μl foram depositados em uma grade de cobre revestida com carbono QUANTIFOIL 1.2/1.3 recém-tratada por descarga de plasma (Agar Scientific, Reino Unido). A grade foi incubada a 20 °C e 60% de umidade relativa por 30 s, seca com papel absorvente por 3 s e, em seguida, resfriada em etano líquido a -176 °C.
Os dados do complexo RC-LH114-W foram registrados no eBIC (Electronic Bioimaging Center) (British Diamond Light Source) com um microscópio Titan Krios, que opera com uma tensão de aceleração de 300 kV, uma ampliação nominal de 130.000× e uma energia de gap de 20 eV. Um detector Gatan 968 GIF Quantum com detector de pico K2 foi utilizado para registrar as imagens em modo de contagem. O tamanho do pixel calibrado é de 1,048 Å e a taxa de dose é de 3,83 e-Å-2s-1. O vídeo foi coletado em 11 segundos e dividido em 40 partes. A área revestida com carbono foi utilizada para refocalizar o microscópio, e então três vídeos foram coletados por orifício. No total, 3130 vídeos foram coletados, com valores de desfocagem entre -1 e -3 μm.
Os dados do complexo RC-LH116 foram coletados utilizando o mesmo microscópio no Laboratório de Bioestrutura de Asterbury (Universidade de Leeds, Reino Unido). Os dados foram coletados no modo de contagem com uma ampliação de 130k e o tamanho do pixel foi calibrado para 1,065 Å com uma dose de 4,6 e-Å-2s-1. O vídeo foi gravado em 12 segundos e dividido em 48 partes. No total, foram coletados 3359 vídeos, com valores de desfocagem entre -1 e -3 μm.
Todo o processamento de dados é realizado no pipeline Relion 3.0 (42). O Motioncorr 2 (43) é usado para corrigir o movimento do feixe por ponderação de dose e, em seguida, o CTFFIND 4.1 (44) é usado para determinar o parâmetro CTF (função de transferência de contraste). Fotomicrografias típicas após esses estágios iniciais de processamento são mostradas na Figura 2. S16. O modelo de seleção automática é gerado pela seleção manual de cerca de 250 pixels de 1000 partículas em um quadro de 250 pixels, sem classificação bidimensional (2D) de referência, rejeitando-se, assim, as classificações que apresentam contaminação da amostra ou não possuem características discerníveis. Em seguida, a seleção automática foi realizada em todas as microfotografias, resultando em 849.359 partículas para o complexo RC-LH114-W e 476.547 partículas para o complexo RC-LH116. Todas as partículas selecionadas passaram por duas rodadas de classificação 2D sem referência. Após cada rodada, as partículas que atendiam aos critérios de área de carbono, contaminação da amostra, ausência de características óbvias ou sobreposição significativa foram rejeitadas, resultando em 772.033 (90,9%) e 359.678 (75,5%) partículas utilizadas para a classificação 3D de RC-LH114-W e RC-LH116, respectivamente. O modelo de referência 3D inicial foi gerado utilizando o método de descida de gradiente estocástico. Utilizando o modelo inicial como referência, as partículas selecionadas foram classificadas em quatro categorias em 3D. Com base no modelo de cada categoria, realizou-se o refinamento 3D das partículas da categoria mais ampla. Em seguida, aplicou-se um filtro passa-baixa inicial de 15 Å para cobrir a área do solvente, adicionaram-se 6 pixels de bordas suaves e, por fim, realizou-se o pós-processamento dos pixels para corrigir a função de transferência de modulação do pico Gatan K2 do detector superior. Para o conjunto de dados RC-LH114-W, este modelo inicial foi modificado pela remoção da alta densidade nas bordas da máscara (desconectada da densidade do complexo central no UCSF Chimera). Os modelos resultantes (com resoluções de 3,91 Å para RC-LH114-W e 4,16 Å para RC-LH116) foram utilizados como referência para a segunda rodada de classificação 3D. As partículas utilizadas foram agrupadas na classe 3D inicial e não apresentaram forte correlação com a vizinhança, sobreposição ou ausência de características estruturais óbvias. Após a segunda rodada de classificação 3D, a categoria com a maior resolução foi selecionada [Para RC-LH114-W, uma categoria corresponde a 377.703 partículas (44,5%); para RC-LH116, existem duas categorias, totalizando 260.752 partículas (54,7%), sendo que a única diferença entre elas ocorre após o alinhamento, depois da rotação inicial]. As partículas selecionadas são reextraídas em uma caixa de 400 pixels e refinadas por refinamento 3D. A máscara de solvente é gerada usando o filtro passa-baixa inicial de 15 Å, expansão do mapa de 3 pixels e máscara suave de 3 pixels. Utilizando refinamento CTF por partícula, correção de movimento por partícula e uma segunda rodada de refinamento CTF por partícula, refinamento 3D, mascaramento de solvente e pós-processamento são realizados após cada etapa para refinar ainda mais a textura resultante. Usando o valor de corte do FSC (Coeficiente de Correlação de Fourier) de 0,143, as resoluções dos modelos finais de RC-LH114-W e RC-LH116 são de 2,65 Å e 2,80 Å, respectivamente. A curva FSC do modelo final é mostrada na Figura 2. S17.
Todas as sequências de proteínas foram baixadas do UniProtKB: LH1-β (PufB; ID UniProt: Q6N9L5); LH1-α (PufA; ID UniProt: Q6N9L4); RC-L (PufL; ID UniProt: O83005); RC-M (PufM; ID UniProt: A0A4Z7); RC-H (PuhA; ID UniProt: A0A4Z9); Proteína-W (PufW; ID UniProt: Q6N1K3). O SWISS-MODEL (45) foi usado para construir um modelo de homologia do RC, que contém as sequências de proteínas de RC-L, RC-M e RC-H, e a estrutura cristalina do RC de Rba. sphaeroides foi usada como molde (ID PDB: 5LSE) (46). Use a ferramenta “fit map” no UCSF Chimera para ajustar o modelo gerado ao mapa (47), melhorar a estrutura da proteína e adicionar cofatores [4×BChl a (nome do resíduo da biblioteca de monômeros = BCL), 2×BPh a (BPH), um ou dois tipos de UQ10 (U10), um ferro não-heme (Fe) e uma 3,4-diidrohexacarbonilcolina (QAK)] usando o Coot (48). Como o QAK não está disponível na biblioteca de monômeros, ele foi parametrizado usando a ferramenta eLBOW no PHENIX (49).
Em seguida, a subunidade LH1 foi construída. Inicialmente, a ferramenta de construção automática do PHENIX (49) foi usada para construir automaticamente parte da sequência LH1 usando o mapa e as sequências de proteínas LH1-α e LH1-β como entrada. Selecione a subunidade LH1 mais completa, extraia-a e carregue-a no Coot, adicione manualmente a sequência faltante e refine manualmente toda a estrutura antes de adicionar dois BCls (BCL) e uma espiriloxantina (CRT) [de acordo com a densidade de Rps relevante do complexo LH1 e o conteúdo conhecido de carotenoides. Espécies (17)]. Copie a subunidade LH1 completa e use a ferramenta “Docking Map Tool” do UCSF Chimera para acoplar na área adjacente não modelada da densidade LH1 e, em seguida, refine-a no Coot; repita o processo até que todas as subunidades LH1 tenham sido modeladas. Para a estrutura RC-LH114-W, extraindo a densidade não alocada no Coot, a proteína é segmentada dos componentes não proteicos restantes no mapa USCF Chimera e a ferramenta Autobuild é usada para estabelecer o modelo inicial e as subunidades restantes (proteína-W) são modeladas no PHENIX (49). Quaisquer sequências faltantes são adicionadas ao modelo resultante no Coot (48) e, em seguida, toda a subunidade é refinada manualmente. A densidade não alocada restante se ajusta à combinação de lipídios (ID da biblioteca de monômeros PDB de CDL = CDL, POPC = 6PL e POPG = PGT), detergente β-DDM (LMT) e moléculas de UQ10 (U10). A otimização do PHENIX (49) e a otimização manual no Coot (48) são utilizadas para aperfeiçoar o modelo inicial completo até que as estatísticas do modelo e a qualidade visual do ajuste não possam mais ser aprimoradas. Finalmente, use LocScale (50) para refinar o mapa local e, em seguida, execute vários outros ciclos de modelagem da densidade não alocada e otimização automática e manual.
Os respectivos peptídeos, cofatores e outros lipídios e quinonas acoplados em suas respectivas densidades são mostrados nas Figuras 1 e 2. S18 a S23. As informações estatísticas do modelo final são mostradas na Tabela S1.
Salvo indicação em contrário, os espectros de absorção UV/Vis/NIR foram coletados em um espectrofotômetro Cary60 (Agilent, EUA) em intervalos de 1 nm, de 250 nm a 1000 nm, e com um tempo de integração de 0,1 s.
Dilua a amostra em uma cubeta de quartzo com caminho óptico de 2 mm até uma absorbância (A880) de 1 e colete o espectro de absorção entre 400 e 1000 nm. Os espectros de dicroísmo circular foram coletados em um espectropolarímetro Jasco 810 (Jasco, Japão) em intervalos de 1 nm entre 400 nm e 950 nm a uma taxa de varredura de 20 nm min⁻¹.
O coeficiente de extinção molar é determinado diluindo o complexo central para uma absorbância (A880) de aproximadamente 50. Dilua o volume de 10 μl em 990 μl de tampão de ligação ou metanol e colete o espectro de absorção imediatamente para minimizar a degradação da BChl. O teor de BChl de cada amostra de metanol foi calculado pelo coeficiente de extinção a 771 nm de 54,8 mM⁻¹ cm⁻¹, e o coeficiente de extinção foi determinado (51). Divida a concentração de BChl medida por 32 (RC-LH114-W) ou 36 (RC-LH116) para determinar a concentração do complexo central, que é então usada para determinar o espectro de absorção da mesma amostra coletada no tampão. Três medições repetidas foram realizadas para cada amostra, e a absorbância média do máximo de Qy da BChl foi usada para o cálculo. O coeficiente de extinção do RC-LH114-W medido a 878 nm é de 3280±140 mM-1 cm-1, enquanto o coeficiente de extinção do RC-LH116 medido a 880 nm é de 3800±30 mM-1 cm-1.
A UQ10 foi quantificada de acordo com o método descrito em (52). Resumidamente, a cromatografia líquida de fase reversa (RP-HPLC) foi realizada utilizando o sistema Agilent 1200 HPLC. Dissolva cerca de 0,02 nmol de RC-LH116 ou RC-LH114-W em 50 μl de metanol:clorofórmio 50:50 contendo 0,02% (p/v) de cloreto férrico e injete a solução na coluna Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm Dissolve, previamente equilibrada, a 1 ml-1 min-1 a 40 °C em solvente de HPLC (metanol:20-propanol 80:20) em uma coluna de 25 cm de comprimento. Realize a eluição isocrática em solvente de HPLC para monitorar a absorbância a 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoides) e 780 nm (BChl) durante 1 hora. O pico no cromatograma de 275 nm em 25,5 minutos foi integrado, o qual não continha nenhum outro composto detectável. A área integrada é usada para calcular a quantidade molar de UQ10 extraída com referência à curva de calibração calculada a partir da injeção de padrões puros de 0 a 5,8 nmol (Figura S14). Cada amostra foi analisada em triplicata, e o erro relatado corresponde ao desvio padrão da média.
Uma solução contendo o complexo RC-LH1 com absorção máxima Qy de 0,1 foi preparada com 30 μM de citocromo c2 reduzido de coração de cavalo (Merck, Reino Unido) e 0 a 50 μM de UQ2 (Merck, Reino Unido). Três amostras de 1 ml foram preparadas para cada concentração de UQ2 e incubadas durante a noite no escuro a 4 °C para garantir a completa adaptação ao escuro antes da medição. A solução foi carregada em um espectrofotômetro modular OLIS RSM1000 equipado com uma grade de difração de 300 nm (chama)/500 nm (linha), fendas de entrada de 1,24 mm, fenda intermediária de 0,12 mm e fenda de saída de 0,6 mm. Um filtro passa-alta de 600 nm foi colocado na entrada do fototubo de amostra e no tubo fotomultiplicador de referência para excluir a luz de excitação. A absorbância foi monitorada a 550 nm com um tempo de integração de 0,15 s. A luz de excitação é emitida por um LED (diodo emissor de luz) M880F2 de 880 nm (Thorlabs Ltd., Reino Unido) através de um cabo de fibra óptica com 90% de intensidade, controlada por um controlador DC2200 (Thorlabs Ltd., Reino Unido), e emitida para a fonte de luz em um ângulo de 90°. O feixe de medição incide sobre um espelho para refletir qualquer luz que não tenha sido inicialmente absorvida pela amostra. A absorbância foi monitorada 10 s antes da iluminação de 50 s. Em seguida, a absorbância foi monitorada por mais 60 s no escuro para avaliar o grau em que o quinolol reduz espontaneamente o citocromo c23+ (ver Figura S8 para os dados brutos).
Os dados foram processados ​​ajustando-se uma taxa inicial linear entre 0,5 e 10 s (dependendo da concentração de UQ2) e calculando-se a média das taxas das três amostras em cada concentração de UQ2. A concentração de RC-LH1, calculada pelo respectivo coeficiente de extinção, foi utilizada para converter a taxa em eficiência catalítica, plotada no Origin Pro 2019 (OriginLab, EUA) e ajustada ao modelo de Michaelis-Menten para determinar os valores aparentes de Km e Kcat.
Para as medições de absorção transiente, a amostra RC-LH1 foi diluída para ~2 μM em tampão IMAC contendo 50 mM de ascorbato de sódio (Merck, EUA) e 0,4 mM de terbutina (Merck, EUA). O ácido ascórbico é usado como doador de elétrons sacrificial e o tert-butaclofeno é usado como inibidor de QB para garantir que o principal doador RC permaneça reduzido (ou seja, não foto-oxidado) durante todo o processo de medição. Aproximadamente 3 ml da amostra são adicionados a uma célula rotativa personalizada (cerca de 0,1 m de diâmetro, 350 RPM) com um caminho óptico de 2 mm para garantir que a amostra no caminho do laser tenha tempo suficiente para adaptação ao escuro entre os pulsos de excitação. Pulsos de laser de ~100 fs são usados ​​para amplificar o sistema de laser de Ti:Safira (Spectra Physics, EUA) para excitar a amostra a 880 nm com uma taxa de repetição de 1 kHz (20 nJ para NIR ou 100 nJ para Vis). Antes de coletar os dados, exponha a amostra à luz de excitação por cerca de 30 minutos. A exposição causará a inativação do QA (possivelmente reduzindo o QA uma ou duas vezes). Observe, porém, que esse processo é reversível, pois após um longo período de adaptação ao escuro, o RC retornará lentamente à atividade do QA. Um espectrômetro Helios (Ultrafast Systems, EUA) foi usado para medir os espectros transientes com um tempo de atraso de -10 a 7000 ps. Utilize o software Surface Xplorer (Ultrafast Systems, EUA) para desagrupar os conjuntos de dados, depois mesclá-los e padronizá-los. Utilize o pacote de software CarpetView (Light Conversion Ltd., Lituânia) para usar o conjunto de dados combinado para obter espectros diferenciais relacionados ao decaimento, ou utilize uma função que convolui múltiplos expoentes com a resposta do instrumento para ajustar a evolução espectral de comprimento de onda único no Origin (OriginLab, EUA).
Como mencionado acima (53), um filme fotossintético contendo o complexo LH1, sem o centro de reação (RC) e a antena periférica LH2, foi preparado. A membrana foi diluída em Tris 20 mM (pH 8,0) e então carregada em uma cubeta de quartzo com caminho óptico de 2 mm. Um pulso de laser de 30 nJ foi usado para excitar a amostra a 540 nm com um tempo de atraso de -10 a 7000 ps. Processe o conjunto de dados como descrito para a amostra de Rps. pal.
A membrana foi centrifugada a 150.000 RCF por 2 horas a 4°C e, em seguida, sua absorbância a 880 nm foi ressuspendida em Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) e NaCl 200 mM. A membrana foi dissolvida por agitação lenta em β-DDM 2% (p/v) por 1 hora no escuro a 4°C. A amostra foi diluída em carbonato de trietilamônio 100 mM (pH 8,0) (TEAB; Merck, Reino Unido) até uma concentração proteica de 2,5 mg ml-1 (análise Bio-Rad). O processamento subsequente foi realizado de acordo com o método previamente publicado (54), começando com a diluição de 50 μg de proteína em um volume total de 50 μl de TEAB contendo laurato de sódio 1% (p/v) (Merck, Reino Unido). Após sonicação por 60 s, a amostra foi reduzida com 5 mM de tris(2-carboxietil)fosfina (Merck, Reino Unido) a 37 °C por 30 minutos. Para a S-alquilação, a amostra foi incubada com 10 mM de metil S-metiltiometanossulfonato (Merck, Reino Unido), adicionado a partir de uma solução estoque de 200 mM em isopropanol, durante 10 minutos à temperatura ambiente. A digestão proteolítica foi realizada pela adição de 2 μg de uma mistura de tripsina/endoproteinase Lys-C (Promega, Reino Unido) e incubada a 37 °C por 3 horas. O surfactante laurato foi extraído pela adição de 50 μl de acetato de etila e 10 μl de ácido trifluoroacético (TFA) a 10% (v/v) de grau LC (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) e agitação em vórtex por 60 s. A separação de fases foi promovida por centrifugação a 15.700 RCF durante 5 minutos. De acordo com o protocolo do fabricante, uma coluna de centrifugação C18 (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) foi utilizada para aspirar e dessalinizar cuidadosamente a fase inferior contendo o peptídeo. Após secagem por centrifugação a vácuo, a amostra foi dissolvida em 0,5% de TFA e 3% de acetonitrila, e 500 ng foram analisados ​​por cromatografia de fase reversa em nanofluxo acoplada à espectrometria de massas, utilizando os parâmetros do sistema detalhados anteriormente.
Use o MaxQuant v.1.5.3.30 (56) para identificação e quantificação de proteínas para pesquisar o banco de dados do proteoma de Rps. palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Os dados de proteômica de espectrometria de massa foram depositados na ProteomeXchange Alliance através do repositório parceiro PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) sob o identificador de conjunto de dados PXD020402.
Para análise por RPLC acoplada à espectrometria de massa com ionização por electrospray, o complexo RC-LH1 foi preparado a partir de Rps do tipo selvagem. Utilizando o método previamente publicado (16), a concentração proteica produzida em células de palustris foi de 2 mg ml-1 em 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl e 0,03% (p/v) β-DDM (análise Bio-Rad). De acordo com o protocolo do fabricante, utilizou-se o kit de purificação 2D (GE Healthcare, EUA) para extrair 10 μg de proteína pelo método de precipitação, e o precipitado foi dissolvido em 20 μl de ácido fórmico (AF) 60% (v/v), acetonitrila 20% (v/v) e água 20% (v/v). Cinco microlitros foram analisados ​​por RPLC (Dionex RSLC) acoplada à espectrometria de massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Utilize uma coluna MabPac 1,2 × 100 mm (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) para a separação a 60 °C e 100 μl min⁻¹, com um gradiente de 85% (v/v) do solvente A [solução aquosa de 0,1% (v/v) de FA e 0,02% (v/v) de TFA] para 85% (v/v) do solvente B [0,1% (v/v) de FA e 0,02% (v/v) de TFA em 90% (v/v) de acetonitrila]. Utilizando uma fonte de ionização por eletrospray padrão e parâmetros padrão por mais de 60 minutos, o espectrômetro de massas obtém uma faixa de 100 a 2750 m/z (relação massa/carga). Com o auxílio da ferramenta FindPept do portal de recursos bioinformáticos ExPASy (https://web.expasy.org/findpept/), mapeie o espectro de massas para as subunidades do complexo.
As células foram cultivadas por 72 horas sob 100 ml de meio NF com baixa (10 μM m⁻² s⁻¹), média (30 μM m⁻² s⁻¹) ou alta (300 μM m⁻² s⁻¹) intensidade luminosa. O meio M22 (meio M22 no qual o sulfato de amônio é omitido e o succinato de sódio é substituído por acetato de sódio) foi utilizado em um frasco de 100 ml com tampa de rosca (23). Em cinco ciclos de 30 segundos, esferas de vidro de 0,1 μm foram adicionadas em uma proporção de volume de 1:1 para lisar as células e resfriadas em gelo por 5 minutos. A matéria insolúvel, as células intactas e as esferas de vidro foram removidas por centrifugação a 16.000 RCF por 10 minutos em uma microcentrífuga de bancada. A membrana foi separada em um rotor Ti 70.1 com 100.000 RCF em Tris-HCl 20 mM (pH 8,0) com um gradiente de sacarose de 40/15% (p/p) durante 10 horas.
Conforme descrito em nosso trabalho anterior, a imunodetecção da etiqueta His em PufW (16) foi realizada. Resumidamente, o complexo central purificado (11,8 nM) ou a membrana contendo a mesma concentração de RC (determinada por oxidação, subtraindo o espectro de diferença reduzido e igualando a carga no gel corado) em tampão de carregamento SDS 2x (Merck, Reino Unido), diluído duas vezes. As proteínas foram separadas em uma réplica de gel NuPage bis-tris 12% (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido). Um gel foi corado com Azul Brilhante de Coomassie (Bio-Rad, Reino Unido) para carregar e visualizar a subunidade RC-L. A proteína no segundo gel foi transferida para uma membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) ativada com metanol (Thermo Fisher Scientific, Reino Unido) para imunoensaio. A membrana de PVDF foi bloqueada em Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM, Tween-20 0,2% (v/v) e leite em pó desnatado 5% (p/v) e, em seguida, incubada com o anticorpo primário anti-His (diluído em tampão de anticorpo [Tris-HCl 50 mM (pH 7,6), NaCl 150 mM e Tween-20 0,05% (v/v)] na diluição de 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, EUA) por 4 horas. Após três lavagens de 5 minutos em tampão de anticorpos, a membrana foi combinada com peroxidase de rábano (Sigma-Aldrich, Reino Unido) e anticorpo secundário anti-rato (diluído 1:10.000 em tampão de anticorpos). A incubação permitiu a detecção (5 minutos após as três lavagens em tampão de anticorpos) utilizando o substrato de quimioluminescência WESTAR ETA C 2.0 (Cyanagen, Itália) e o sistema Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Reino Unido).
Ao desenhar a distribuição de intensidade de cada gel corado ou faixa de imunoensaio, integrando a área sob o pico e calculando a razão de intensidade de RC-L (gel corado) e Proteína-W (imunoensaio), no ImageJ (57), processe a imagem. Essas razões foram convertidas em razões molares assumindo que a razão de RC-L para proteína-W na amostra pura de RC-LH114-W era de 1:1 e normalizando todo o conjunto de dados de acordo.
Para acessar o material complementar deste artigo, visite http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
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A estrutura de alta resolução do complexo de captura de luz 1 no centro de reação fornece novas informações sobre a dinâmica da quinona.
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©2021 Associação Americana para o Avanço da Ciência. todos os direitos reservados. AAAS é parceira de HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef e COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.