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A melamina é um contaminante alimentar reconhecido que pode estar presente em certas categorias de alimentos, tanto acidentalmente quanto intencionalmente. O objetivo deste estudo foi verificar a detecção e quantificação de melamina em fórmulas infantis e leite em pó. Um total de 40 amostras de alimentos disponíveis comercialmente, incluindo fórmulas infantis e leite em pó, de diferentes regiões do Irã, foram analisadas. O teor aproximado de melamina nas amostras foi determinado utilizando um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção ultravioleta (HPLC-UV). Uma curva de calibração (R² = 0,9925) foi construída para a detecção de melamina na faixa de 0,1–1,2 μg mL⁻¹. Os limites de quantificação e detecção foram de 1 μg mL⁻¹ e 3 μg mL⁻¹, respectivamente. A melamina foi testada em fórmulas infantis e leite em pó, e os resultados mostraram que os níveis de melamina nas amostras de fórmula infantil e leite em pó foram de 0,001–0,095 mg kg⁻¹ e 0,001–0,004 mg kg⁻¹, respectivamente. Esses valores estão em conformidade com a legislação da UE e o Codex Alimentarius. É importante ressaltar que o consumo desses produtos lácteos com teor reduzido de melamina não representa um risco significativo para a saúde do consumidor. Isso também é corroborado pelos resultados da avaliação de risco.
A melamina é um composto orgânico com fórmula molecular C3H6N6, derivado da cianamida. Possui solubilidade muito baixa em água e é composta por aproximadamente 66% de nitrogênio. A melamina é um composto industrial amplamente utilizado, com uma vasta gama de aplicações legítimas na produção de plásticos, fertilizantes e equipamentos para processamento de alimentos (incluindo embalagens e utensílios de cozinha)^1,2. A melamina também é utilizada como veículo para o tratamento de doenças. A alta proporção de nitrogênio na melamina pode levar ao uso indevido do composto e à atribuição de propriedades de moléculas de proteína a ingredientes alimentícios^3,4. Portanto, a adição de melamina a produtos alimentícios, incluindo laticínios, aumenta o teor de nitrogênio. Assim, concluiu-se erroneamente que o teor de proteína do leite era maior do que o real.
Para cada grama de melamina adicionada, o teor proteico dos alimentos aumenta em 0,4%. No entanto, a melamina é altamente solúvel em água e pode causar danos mais graves. A adição de 1,3 gramas de melamina a produtos líquidos, como o leite, pode aumentar o teor proteico do leite em 30%^5,6. Embora a melamina seja adicionada a alimentos de origem animal e até mesmo humana para aumentar o teor proteico⁷, a Comissão do Codex Alimentarius (CAC) e as autoridades nacionais não aprovaram a melamina como aditivo alimentar e a classificaram como perigosa se ingerida, inalada ou absorvida pela pele. Em 2012, a Agência Internacional de Pesquisa sobre o Câncer (IARC) da Organização Mundial da Saúde (OMS) classificou a melamina como um carcinógeno do Grupo 2B, devido aos seus potenciais malefícios à saúde humana⁸. A exposição prolongada à melamina pode causar câncer ou danos renais². A melamina presente nos alimentos pode formar complexos com o ácido cianúrico, formando cristais amarelos insolúveis em água que podem causar danos aos tecidos renais e da bexiga, além de câncer do trato urinário e perda de peso^9,10. Pode causar intoxicação alimentar aguda e, em altas concentrações, morte, especialmente em bebês e crianças pequenas.¹¹ A Organização Mundial da Saúde (OMS) também estabeleceu a ingestão diária tolerável (IDT) de melamina para humanos em 0,2 mg/kg de peso corporal por dia, com base nas diretrizes do CAC.¹² A Food and Drug Administration (FDA) dos EUA estabeleceu o nível máximo de resíduos de melamina em 1 mg/kg em fórmulas infantis e 2,5 mg/kg em outros alimentos.^2,7 Em setembro de 2008, foi relatado que vários fabricantes nacionais de fórmulas infantis adicionaram melamina ao leite em pó para aumentar o teor de proteína de seus produtos, resultando em intoxicação por leite em pó e desencadeando um incidente nacional de intoxicação por melamina que deixou mais de 294.000 crianças doentes e mais de 50.000 hospitalizadas.¹³
A amamentação nem sempre é possível devido a diversos fatores, como as dificuldades da vida urbana, doenças da mãe ou da criança, o que leva ao uso de fórmulas infantis para alimentar os bebês. Como resultado, fábricas foram criadas para produzir fórmulas infantis com composição o mais próxima possível da do leite materno¹⁴. As fórmulas infantis comercializadas geralmente são feitas com leite de vaca e contêm uma mistura especial de gorduras, proteínas, carboidratos, vitaminas, minerais e outros compostos. Para se aproximarem do leite materno, o teor de proteínas e gorduras das fórmulas varia e, dependendo do tipo de leite, elas são enriquecidas com compostos como vitaminas e minerais, como ferro¹⁵. Como os bebês são um grupo sensível e correm o risco de intoxicação, a segurança do consumo de fórmulas infantis é de vital importância para a saúde. Após o caso de intoxicação por melamina entre bebês chineses, países de todo o mundo passaram a dar maior atenção a essa questão, e a sensibilidade a esse tema também aumentou. Portanto, é especialmente importante fortalecer o controle da produção de fórmulas infantis para proteger a saúde dos bebês. Existem vários métodos para detectar melamina em alimentos, incluindo cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), eletroforese, método sensorial, espectrofotometria e ensaio imunoenzimático antígeno-anticorpo (ELISA)16. Em 2007, a Food and Drug Administration (FDA) dos EUA desenvolveu e publicou um método de HPLC para a determinação de melamina e ácido cianúrico em alimentos, que é o método mais eficaz para determinar o teor de melamina17.
As concentrações de melamina em fórmulas infantis, medidas por meio de uma nova técnica de espectroscopia infravermelha, variaram de 0,33 a 0,96 miligramas por quilograma (mg kg-1).¹⁸ Um estudo no Sri Lanka encontrou níveis de melamina em leite em pó integral variando de 0,39 a 0,84 mg kg-1. Além disso, amostras de fórmulas infantis importadas apresentaram os níveis mais elevados de melamina, com 0,96 e 0,94 mg/kg, respectivamente. Esses níveis estão abaixo do limite regulamentar (1 mg/kg), mas um programa de monitoramento é necessário para a segurança do consumidor.¹⁹
Diversos estudos examinaram os níveis de melamina em fórmulas infantis iranianas. Cerca de 65% das amostras continham melamina, com uma média de 0,73 mg/kg e um máximo de 3,63 mg/kg. Outro estudo relatou que o nível de melamina em fórmulas infantis variou de 0,35 a 3,40 μg/kg, com uma média de 1,38 μg/kg. No geral, a presença e o nível de melamina em fórmulas infantis iranianas foram avaliados em vários estudos, com algumas amostras contendo melamina acima do limite máximo estabelecido pelas autoridades regulatórias (2,5 mg/kg/porção).
Considerando o enorme consumo direto e indireto de leite em pó na indústria alimentícia e a especial importância das fórmulas infantis na alimentação de crianças, este estudo teve como objetivo validar o método de detecção de melamina em leite em pó e fórmulas infantis. De fato, o primeiro objetivo deste estudo foi desenvolver um método quantitativo rápido, simples e preciso para detectar a adulteração com melamina em fórmulas infantis e leite em pó utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e detecção ultravioleta (UV); em segundo lugar, o objetivo deste estudo foi determinar o teor de melamina em fórmulas infantis e leite em pó comercializados no mercado iraniano.
Os instrumentos utilizados para a análise de melamina variam dependendo do local de produção dos alimentos. Um método de análise por HPLC-UV sensível e confiável foi utilizado para medir resíduos de melamina em leite e fórmula infantil. Produtos lácteos contêm diversas proteínas e gorduras que podem interferir na medição de melamina. Portanto, como observado por Sun et al.²², uma estratégia de purificação adequada e eficaz é necessária antes da análise instrumental. Neste estudo, utilizamos filtros de seringa descartáveis. Utilizamos uma coluna C18 para separar a melamina em fórmula infantil e leite em pó. A Figura 1 mostra o cromatograma para a detecção de melamina. Além disso, a recuperação das amostras contendo 0,1–1,2 mg/kg de melamina variou de 95% a 109%, a equação de regressão foi y = 1,2487x − 0,005 (r = 0,9925) e os valores do desvio padrão relativo (DPR) variaram de 0,8 a 2%. Os dados disponíveis indicam que o método é confiável na faixa de concentração estudada (Tabela 1). Os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) instrumentais da melamina foram de 1 μg mL⁻¹ e 3 μg mL⁻¹, respectivamente. Além disso, o espectro UV da melamina apresentou uma banda de absorção em 242 nm. O método de detecção é sensível, confiável e preciso. Este método pode ser utilizado para a determinação rotineira do nível de melamina.
Resultados semelhantes foram publicados por diversos autores. Um método de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por arranjo de fotodiodos (HPLC) foi desenvolvido para a análise de melamina em produtos lácteos. Os limites inferiores de quantificação foram de 340 μg kg⁻¹ para leite em pó e 280 μg kg⁻¹ para fórmula infantil a 240 nm. Filazzi et al. (2012) relataram que a melamina não foi detectada em fórmula infantil por HPLC. No entanto, 8% das amostras de leite em pó continham melamina em níveis de 0,505–0,86 mg/kg. Tittlemiet et al.²³ conduziram um estudo semelhante e determinaram o teor de melamina em fórmula infantil (número de amostras: 72) por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (HPLC-MS/MS) em aproximadamente 0,0431–0,346 mg kg⁻¹. Em um estudo conduzido por Venkatasamy et al. Em 2010, uma abordagem de química verde (sem acetonitrila) e cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-HPLC) foram utilizadas para quantificar a melamina em fórmulas infantis e leite. A faixa de concentração da amostra foi de 1,0 a 80 g/mL e a resposta foi linear (r > 0,999). O método apresentou recuperações de 97,2 a 101,2% na faixa de concentração de 5 a 40 g/mL e a reprodutibilidade foi inferior a 1,0% de desvio padrão relativo. Além disso, os limites de detecção (LOD) e de quantificação (LOQ) observados foram de 0,1 g mL⁻¹ e 0,2 g mL⁻¹, respectivamente. Lutter et al. (2011) determinaram a contaminação por melamina em leite de vaca e fórmulas infantis à base de leite utilizando HPLC-UV. As concentrações de melamina variaram de < 0,2 a 2,52 mg kg⁻¹. A faixa dinâmica linear do método HPLC-UV foi de 0,05 a 2,5 mg kg⁻¹ para leite de vaca, de 0,13 a 6,25 mg kg⁻¹ para fórmula infantil com fração de massa proteica <15% e de 0,25 a 12,5 mg kg⁻¹ para fórmula infantil com fração de massa proteica de 15%. Os resultados de LOD (e LOQ) foram de 0,03 mg kg⁻¹ (0,09 mg kg⁻¹) para leite de vaca, 0,06 mg kg⁻¹ (0,18 mg kg⁻¹) para fórmula infantil <15% de proteína e 0,12 mg kg⁻¹ (0,36 mg kg⁻¹) para fórmula infantil 15% de proteína, com uma relação sinal-ruído de 3 e 1025 para LOD e LOQ, respectivamente. Diebes et al. (2012) investigaram os níveis de melamina em amostras de fórmula infantil e leite em pó usando HPLC/DMD. Na fórmula infantil, os níveis mais baixos e mais altos foram de 9,49 mg kg−1 e 258 mg kg−1, respectivamente. O limite de detecção (LOD) foi de 0,05 mg kg−1.
Javaid et al. relataram que os resíduos de melamina em fórmulas infantis estavam na faixa de 0,002–2 mg kg−1 por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FT-MIR) (LOD = 1 mg kg−1; LOQ = 3,5 mg kg−1). Rezai et al.27 propuseram um método de HPLC-DDA (λ = 220 nm) para estimar a melamina e alcançaram um LOQ de 0,08 μg mL−1 para leite em pó, que foi inferior ao nível obtido neste estudo. Sun et al. desenvolveram um método de RP-HPLC-DAD para a detecção de melamina em leite líquido por extração em fase sólida (SPE). Eles obtiveram um LOD e um LOQ de 18 e 60 μg kg−128, respectivamente, o que é mais sensível do que o presente estudo. Montesano et al. confirmou a eficácia do método HPLC-DMD para a avaliação do teor de melamina em suplementos proteicos com um limite de quantificação de 0,05–3 mg/kg, que foi menos sensível do que o método usado neste estudo29.
Sem dúvida, os laboratórios analíticos desempenham um papel importante na proteção do meio ambiente, monitorando poluentes em diversas amostras. No entanto, o uso de um grande número de reagentes e solventes durante as análises pode resultar na formação de resíduos perigosos. Portanto, a química analítica verde (GAC) foi desenvolvida em 2000 para reduzir ou eliminar os efeitos adversos dos procedimentos analíticos sobre os operadores e o meio ambiente. Métodos tradicionais de detecção de melamina, incluindo cromatografia, eletroforese, eletroforese capilar e ensaio imunoenzimático (ELISA), têm sido utilizados para identificar melamina. Contudo, dentre os inúmeros métodos de detecção, os sensores eletroquímicos têm atraído muita atenção devido à sua excelente sensibilidade, seletividade, rapidez na análise e facilidade de uso. A nanotecnologia verde utiliza vias biológicas para sintetizar nanomateriais, o que pode reduzir a geração de resíduos perigosos e o consumo de energia, promovendo assim a implementação de práticas sustentáveis. Nanocompósitos, por exemplo, feitos de materiais ecologicamente corretos, podem ser usados ​​em biossensores para detectar substâncias como a melamina.
O estudo demonstra que a microextração em fase sólida (SPME) é utilizada eficazmente devido à sua maior eficiência energética e sustentabilidade em comparação com os métodos de extração tradicionais. A compatibilidade ambiental e a eficiência energética da SPME tornam-na uma excelente alternativa aos métodos de extração tradicionais em química analítica, proporcionando um método mais sustentável e eficiente para a preparação de amostras35.
Em 2013, Wu et al. desenvolveram um biossensor de ressonância plasmônica de superfície (mini-SPR) altamente sensível e seletivo que utiliza o acoplamento entre melamina e anticorpos anti-melamina para detectar rapidamente melamina em fórmulas infantis por meio de um imunoensaio. O biossensor SPR, combinado com um imunoensaio (utilizando albumina sérica bovina conjugada à melamina), é uma tecnologia fácil de usar e de baixo custo, com um limite de detecção de apenas 0,02 μg mL-136.
Nasiri e Abbasian utilizaram um sensor portátil de alto potencial em combinação com compósitos de óxido de grafeno-quitosana (GOCS) para detectar melamina em amostras comerciais37. Este método demonstrou seletividade, precisão e resposta ultra-altas. O sensor GOCS apresentou sensibilidade notável (239,1 μM−1), faixa linear de 0,01 a 200 μM, constante de afinidade de 1,73 × 104 e limite de detecção (LOD) de até 10 nM. Além disso, um estudo conduzido por Chandrasekhar et al. em 2024 adotou uma abordagem ecologicamente correta e de baixo custo. Eles utilizaram extrato de casca de mamão como agente redutor para sintetizar nanopartículas de óxido de zinco (ZnO-NPs) por um método ecologicamente correto. Posteriormente, uma técnica exclusiva de espectroscopia micro-Raman foi desenvolvida para a determinação de melamina em fórmulas infantis. As nanopartículas de ZnO derivadas de resíduos agrícolas demonstraram potencial como uma ferramenta de diagnóstico valiosa e uma tecnologia confiável e de baixo custo para monitorar e detectar melamina38.
Alizadeh et al. (2024) utilizaram uma plataforma de fluorescência de estrutura metalorgânica (MOF) de alta sensibilidade para determinar a presença de melamina em leite em pó. A faixa linear e o limite inferior de detecção do sensor, determinados utilizando 3σ/S, foram de 40 a 396,45 nM (equivalente a 25 μg kg⁻¹ a 0,25 mg kg⁻¹) e 40 nM (equivalente a 25 μg kg⁻¹), respectivamente. Essa faixa está bem abaixo dos níveis máximos de resíduos (LMRs) estabelecidos para a identificação de melamina em fórmulas infantis (1 mg kg⁻¹) e outras amostras de alimentos/rações (2,5 mg kg⁻¹). O sensor fluorescente (térbio (Tb)@NH₂-MIL-253(Al)MOF) demonstrou maior precisão e capacidade de medição mais exata do que a HPLC³⁹ na detecção de melamina em leite em pó. Os biossensores e nanocompósitos na química verde não só melhoram as capacidades de detecção, como também minimizam os riscos ambientais, em consonância com os princípios do desenvolvimento sustentável.
Os princípios da química verde têm sido aplicados a diversos métodos para a determinação de melamina. Uma abordagem consiste no desenvolvimento de um método verde de microextração em fase sólida dispersiva, utilizando o polímero polar natural β-ciclodextrina reticulado com ácido cítrico para a extração eficiente de melamina em amostras como fórmulas infantis e água quente. Outro método utiliza a reação de Mannich para a determinação de melamina em amostras de leite. Este método é econômico, ecologicamente correto e altamente preciso, com uma faixa linear de 0,1 a 2,5 ppm e um baixo limite de detecção. Além disso, um método econômico e ecologicamente correto para a determinação quantitativa de melamina em leite líquido e fórmulas infantis foi desenvolvido utilizando espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR), com alta precisão e limites de detecção de 1 ppm e 3,5 ppm, respectivamente. Esses métodos demonstram a aplicação dos princípios da química verde ao desenvolvimento de métodos eficientes e sustentáveis ​​para a determinação de melamina.
Diversos estudos propuseram métodos inovadores para a detecção de melamina, como o uso de extração em fase sólida e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)43, bem como cromatografia líquida de alta eficiência rápida (HPLC), que não requer pré-tratamento complexo ou reagentes de par iônico, reduzindo assim a quantidade de resíduos químicos44. Esses métodos não apenas fornecem resultados precisos para a determinação de melamina em produtos lácteos, mas também estão em conformidade com os princípios da química verde, minimizando o uso de produtos químicos perigosos e reduzindo o impacto ambiental geral do processo analítico.
Quarenta amostras de diferentes marcas foram testadas em triplicata, e os resultados são apresentados na Tabela 2. Os níveis de melamina nas amostras de fórmula infantil e leite em pó variaram de 0,001 a 0,004 mg/kg e de 0,001 a 0,095 mg/kg, respectivamente. Não foram observadas diferenças significativas entre os três grupos etários de fórmula infantil. Além disso, a melamina foi detectada em 80% das amostras de leite em pó, enquanto 65% das fórmulas infantis estavam contaminadas com melamina.
O teor de melamina no leite em pó industrializado foi maior do que na fórmula infantil, e a diferença foi significativa (p<0,05) (Figura 2).
Os resultados obtidos ficaram abaixo dos limites estabelecidos pela FDA (abaixo de 1 e 2,5 mg/kg). Além disso, os resultados estão em conformidade com os limites estabelecidos pelo CAC (2010) e pela UE45,46, ou seja, o limite máximo permitido é de 1 mg/kg para fórmulas infantis e 2,5 mg/kg para produtos lácteos.
De acordo com um estudo de 2023 realizado por Ghanati et al.47, o teor de melamina em diferentes tipos de leite embalado no Irã variou de 50,7 a 790 μg kg−1. Seus resultados estavam abaixo do limite permitido pela FDA. Nossos resultados são inferiores aos de Shoder et al.48 e Rima et al.49. Shoder et al. (2010) constataram que os níveis de melamina em leite em pó (n=49), determinados por ELISA, variaram de 0,5 a 5,5 mg/kg. Rima et al. analisaram resíduos de melamina em leite em pó por espectrofotometria de fluorescência e encontraram um teor de melamina de 0,72 a 5,76 mg/kg. Um estudo realizado no Canadá em 2011 monitorou os níveis de melamina em fórmulas infantis (n=94) utilizando cromatografia líquida (LC/MS). As concentrações de melamina encontradas estavam abaixo do limite aceitável (padrão preliminar: 0,5 mg kg−1). É improvável que os níveis fraudulentos de melamina detectados tenham sido uma tática usada para aumentar o teor de proteína. No entanto, isso não pode ser explicado pelo uso de fertilizantes, realocação do conteúdo dos recipientes ou fatores semelhantes. Além disso, a origem da melamina no leite em pó importado para o Canadá não foi divulgada.50
Hassani et al. mediram o teor de melamina em leite em pó e leite líquido no mercado iraniano em 2013 e encontraram resultados semelhantes. Os resultados mostraram que, com exceção de uma marca de leite em pó e leite líquido, todas as outras amostras estavam contaminadas com melamina, com níveis variando de 1,50 a 30,32 μg g−1 no leite em pó e de 0,11 a 1,48 μg ml−1 no leite. Notavelmente, o ácido cianúrico não foi detectado em nenhuma das amostras, reduzindo a possibilidade de intoxicação por melamina para os consumidores. Estudos anteriores avaliaram a concentração de melamina em produtos de chocolate contendo leite em pó. Cerca de 94% das amostras importadas e 77% das amostras iranianas continham melamina. Os níveis de melamina nas amostras importadas variaram de 0,032 a 2,692 mg/kg, enquanto nas amostras iranianas variaram de 0,013 a 2,600 mg/kg. No geral, a melamina foi detectada em 85% das amostras, mas apenas uma marca específica apresentou níveis acima do limite permitido.44 Tittlemier et al. relataram níveis de melamina em leite em pó variando de 0,00528 a 0,0122 mg/kg.
A Tabela 3 resume os resultados da avaliação de risco para os três grupos etários. O risco foi inferior a 1 em todos os grupos etários. Portanto, não há risco não carcinogênico para a saúde decorrente da presença de melamina em fórmulas infantis.
Níveis mais baixos de contaminação em produtos lácteos podem ser devidos à contaminação não intencional durante o preparo, enquanto níveis mais altos podem ser devidos a adições intencionais. Além disso, o risco geral para a saúde humana decorrente do consumo de produtos lácteos com baixos níveis de melamina é considerado baixo. Pode-se concluir que o consumo de produtos contendo níveis tão baixos de melamina não representa nenhum risco para a saúde do consumidor.⁵²
Considerando a importância da gestão da segurança alimentar na indústria de laticínios, especialmente em termos de proteção da saúde pública, é fundamental desenvolver e validar um método para avaliar e comparar os níveis e resíduos de melamina em leite em pó e fórmulas infantis. Um método simples e preciso de cromatografia líquida de alta eficiência com detecção por UV (HPLC-UV) foi desenvolvido para a determinação de melamina em fórmulas infantis e leite em pó. O método foi validado para garantir sua confiabilidade e precisão. Os limites de detecção e quantificação do método demonstraram sensibilidade suficiente para medir os níveis de melamina em fórmulas infantis e leite em pó. De acordo com nossos dados, a melamina foi detectada na maioria das amostras iranianas. Todos os níveis de melamina detectados estavam abaixo dos limites máximos permitidos pela Autoridade de Controle de Alimentos (CAC), indicando que o consumo desses tipos de produtos lácteos não representa risco à saúde humana.
Todos os reagentes químicos utilizados eram de grau analítico: melamina (2,4,6-triamino-1,3,5-triazina) com 99% de pureza (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); acetonitrila de grau HPLC (Merck, Darmstadt, Alemanha); água ultrapura (Millipore, Morfheim, França). Filtros de seringa descartáveis ​​(Chromafil Xtra PVDF-45/25, tamanho do poro 0,45 μm, diâmetro da membrana 25 mm) (Macherey-Nagel, Düren, Alemanha).
Para preparar as amostras, foram utilizados um banho ultrassônico (Elma, Alemanha), uma centrífuga (Beckman Coulter, Krefeld, Alemanha) e um HPLC (KNAUER, Alemanha).
Foi utilizado um cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC) (KNAUER, Alemanha) equipado com um detector UV. As condições de análise por HPLC foram as seguintes: um sistema UHPLC Ultimate equipado com uma coluna analítica ODS-3 C18 (4,6 mm × 250 mm, tamanho de partícula 5 μm) (MZ, Alemanha) foi utilizado. O eluente do HPLC (fase móvel) foi uma mistura de TFA/metanol (450:50 mL) com uma vazão de 1 mL min⁻¹. O comprimento de onda de detecção foi de 242 nm. O volume de injeção foi de 100 μL e a temperatura da coluna foi de 20 °C. Como o tempo de retenção do fármaco é longo (15 minutos), a próxima injeção deve ser feita após 25 minutos. A melamina foi identificada pela comparação do tempo de retenção e do pico do espectro UV com padrões de melamina.
Uma solução padrão de melamina (10 μg/mL) foi preparada utilizando água e armazenada em refrigerador (4 °C) ao abrigo da luz. A solução estoque foi diluída com a fase móvel para preparar as soluções padrão de trabalho. Cada solução padrão foi injetada no HPLC 7 vezes. A equação de calibração 10 foi calculada por análise de regressão entre a área do pico determinada e a concentração determinada.
Amostras de leite em pó comercial (20 amostras) e de diferentes marcas de fórmulas infantis à base de leite de vaca (20 amostras) foram adquiridas em supermercados e farmácias locais no Irã para alimentação de bebês de diferentes faixas etárias (0–6 meses, 6–12 meses e >12 meses) e armazenadas sob refrigeração (4 °C) até a análise. Em seguida, 1 ± 0,01 g de leite em pó homogeneizado foi pesado e misturado com acetonitrila:água (50:50, v/v; 5 mL). A mistura foi agitada por 1 min, sonicada em banho ultrassônico por 30 min e, finalmente, agitada por agitação rotativa por 1 min. A mistura foi então centrifugada a 9000 × g por 10 min à temperatura ambiente e o sobrenadante foi filtrado para um frasco de amostra de 2 mL utilizando um filtro de seringa de 0,45 μm. O filtrado (250 μl) foi então misturado com água (750 μl) e injetado no sistema HPLC10,42.
Para validar o método, determinamos a recuperação, a exatidão, o limite de detecção (LOD), o limite de quantificação (LOQ) e a precisão em condições ótimas. O LOD foi definido como o teor da amostra com uma altura de pico três vezes maior que o nível de ruído de fundo. Por outro lado, o teor da amostra com uma altura de pico 10 vezes maior que a relação sinal-ruído foi definido como o LOQ.
A resposta do dispositivo foi determinada utilizando uma curva de calibração composta por sete pontos de dados. Diferentes concentrações de melamina foram utilizadas (0, 0,2, 0,3, 0,5, 0,8, 1 e 1,2). A linearidade do procedimento de cálculo da melamina foi determinada. Além disso, diferentes concentrações de melamina foram adicionadas às amostras em branco. A curva de calibração foi construída pela injeção contínua de 0,1–1,2 μg mL⁻¹ de uma solução padrão de melamina em amostras de fórmula infantil e leite em pó, apresentando um R² de 0,9925. A exatidão foi avaliada pela repetibilidade e reprodutibilidade do procedimento, obtidas pela injeção de amostras no primeiro e nos três dias subsequentes (em triplicata). A repetibilidade do método foi avaliada pelo cálculo do RSD% para três diferentes concentrações de melamina adicionada. Estudos de recuperação foram realizados para determinar a precisão. O grau de recuperação pelo método de extração foi calculado em três níveis de concentração de melamina (0,1, 1,2, 2) em amostras de fórmula infantil e leite em pó9,11,15.
A ingestão diária estimada (IDE) foi determinada usando a seguinte fórmula: IDE = Ci × Cc/PC.
Onde Ci é o teor médio de melamina, Cc é o consumo de leite e BW é o peso médio das crianças.
A análise dos dados foi realizada utilizando o SPSS 24. A normalidade foi testada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov; todos os dados apresentaram distribuição não paramétrica (p = 0). Portanto, os testes de Kruskal-Wallis e de Mann-Whitney foram utilizados para determinar diferenças significativas entre os grupos.
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